RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus

본 절차의 전반적인 목표는 Priyanka Pacificus 선충에 외래 DNA를 성공적으로 형질전환시키고 유전자 기능을 넉다운(knock down)하는 것입니다. 형질전환을 위해, 먼저 상보적인 점착성 말단을 가진 적절한 게놈 DNA를 준비하십시오.

RNA 간섭을 위해, 이중 가닥 RNA 전사 키트를 사용하여 목적 유전자를 합성하십시오. 그런 다음 PRIs DIANCA pacificus goads에 DNA 또는 이중 가닥 RNA를 미세 주입하십시오. 형질전환의 경우 F1 집단에서 선택된 마커 표현형을 스크리닝하고, RNA 간섭의 경우 넉다운 표현형을 선택하여 형질전환을 진행하십시오.

형광 현미경을 통해 GFP 리포터를 이용한 특정 유전자 발현 결과를 확인하기 위해 F2 세대 형질전환 벌레의 결과를 계속해서 모니터링하십시오. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 주립대학교 노스리지의 Ray Hong이며, 본 시연에서는 특정 선충의 유전적 조작 단계를 설명하겠습니다. 신흥 모델 생물에서 RNAi 및 형질전환을 수행하면 유전자 기능과 발현을 특성화함으로써 발생 생물학 및 행동학의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 벌레를 주입 패드에 배치하는 방법과 go nats가 보이는 정확한 초점 평면에 벌레를 주입하는 방법을 시청함으로써 도움을 받을 수 있습니다. gans와 달리 goad는 SCA 특이적이며, 이는 nematode가 후기 J4 단계에서 성체로 발달함에 따라 goad가 등쪽에서 서로 교차하고 결국 이동하기 때문입니다. 또한, 주입 혼합물을 만들기 위해 상응하는 제한 효소로 절단된 genomic DNA를 트랜스유전자 및 공동 주입 마커와 함께 첨가해야 합니다.

본 실험에서는 형질전환을 위한 PRIs 사례의 미세주입법을 시연하겠습니다. 주입을 위해 3D NA 제작물이 필요하며, 우세 공주입 마커가 사용됩니다. 표적 리포터 transgene 및 genomic D-N-A-D-N-A 제작물을 상호 호환되는 제한 효소로 소화합니다. DNA 제작물은 에탄올 침전법을 사용하여 회수합니다.

주입 혼합물은 표에 기재된 농도로 조제합니다. 질소 탱크의 압력계 설정을 확인하십시오. 이제 1~2 µL의 주입 혼합물을 바늘에 로딩합니다.

마이크로인젝션 조작기에 바늘을 장착합니다. 슬라이드 위에 놓인 얇게 뽑힌 모세관 튜브의 가장자리에 바늘 끝을 살짝 접촉시켜 끝을 부러뜨린 후, 대기 위치에 둡니다. 이제 파라핀 오일을 부어 네 마리의 젊은 성체 벌레가 있는 플레이트를 덮습니다.

단일 벌레를 선택하여 주입 패드로 옮깁니다. 현미경 하에서 벌레의 생식샘이 바늘 방향을 향하게 하고, 외음부는 바늘 반대 방향으로 위치하도록 조정합니다. 이제 바늘을 현미경 시야의 위치로 내립니다.

상단 생식샘과 바늘의 초점을 동일한 평면에 맞춥니다. 벌레를 조심스럽게 찔러 주입 혼합물을 주입합니다. 주입이 성공적이면 난자들이 말단 팁 방향으로 분리되는 것을 확인할 수 있습니다.

바늘의 위치를 조정하여 아래쪽 생식선에 주입하고 주입 과정을 반복합니다. 이 생식선은 장 아래에 위치하므로 알이 퍼지는 모습이 보이지 않으며, 따라서 주입의 성공 여부를 판단하기가 더 어렵습니다. 하지만 주입 후 벌레의 몸체는 돌출된 생식선 없이 온전한 상태를 유지해야 합니다.

바늘을 다시 대기 위치로 되돌립니다. 픽(pick)을 이용해 OP 50 박테리아와 함께 M9 버퍼 한 방울을 첨가하여 벌레를 구출합니다. 벌레가 붙을 수 있도록 OP 50으로 벌레를 살짝 건드립니다.

이제 벌레를 OP 50이 50 µL씩 점적된 플레이트로 옮깁니다. 주입된 벌레를 20 °C에서 약 4일 동안 보관하여 F1 세대가 산란되고 성장하도록 합니다. 이제 벌레를 스크리닝하여 선택된 표현형을 확인합니다.

관찰된 표현형을 나타내는 F1 개체를 골라 새로 분주한 플레이트에 옮기고 25 °C에서 보관하십시오. 마지막으로, 형질전환 라인의 경우 F2 개체를 개별 플레이트로 옮깁니다. 이후 세대는 20 °C에서 보관하십시오.

RNAi 및 형질전환을 통한 개체 수준의 유전자 기능 조작은 진화 발달 생물학의 Ppac pacificus 모델의 핵심 요소입니다. 왼쪽의 야생형 웜과 비교하여, 안정적인 F four PPR L three 형질전환 라인은 머리 뉴런의 GFP 발현을 보이는 우성 롤러를 생성합니다. 반대로, 이 RNA I 실험은 PRL one roller 기능 획득 돌연변이 TU 92에서 일반적으로 관찰되는 롤링 운동 능력이 완전히 억제된 PRL one 돌연변이체를 생성합니다. 숙달되면 각 주입은 5분 이내에 완료할 수 있습니다. 독립적인 F1 형질전환 롤 라인에서 얻은 모든 F two를 개별적으로 픽킹하여 독립적인 F two 프로미를 구축해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이는 F2 라인 간에 GFP 발현이 매우 가변적이며, roller 표현형의 전달이 GFP 발현 수준과 상관관계가 없음을 발견했기 때문입니다.