마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑
September 13th, 2011
그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.
이 절차의 전반적인 목표는 온전하게 분리된 LOR 관류 마우스 심장에서 막관통 전위와 세포 내 칼슘 과도 상태를 동시에 광학적으로 매핑하는 것입니다. 이는 먼저 손상되지 않은 쥐의 심장을 절제한 다음 대동맥을 캐뉼레이션하고 LOR 관류를 시작하여 수행됩니다. 다음 단계는 커플러에 여기 수축을 로드한 다음 심장을 관류 챔버에 고정하여 심장을 고정하는 것입니다.
마지막 단계는 광학 염료를 로드하고 실험 중에 모션 아티팩트를 줄이기 위한 준비를 하는 것입니다. 광학 이미지는 캠 Ultima LC Moss 카메라로 심장에서 방출되는 빛을 수집하여 얻습니다. 이봐, 내 이름은 디야.
저는 워싱턴 대학교의 대학원생입니다. 마이크로 전극과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 광학 매핑을 통해 심장 전체 표면에 걸쳐 더 큰 공간 해상도를 얻을 수 있다는 것입니다. 안녕하세요, 저는 Matt Sulkin입니다.
저는 워싱턴 대학교의 대학원생입니다. 이 방법을 올바르게 수행하면 부정맥 형성의 기초와 같은 심장 전기 생리학의 많은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 분당 40ml의 속도로 용액을 순환시키도록 하나의 연동 펌프를 구성합니다.
그런 다음 두 번째 연동 펌프를 분당 80밀리리터로 설정합니다. 이 펌프는 Perfuse eight을 저장 및 산소 공급 저장소로 되돌려 보냅니다. 펌프를 켜고 1 리터, 70 % 에탄올로 시스템을 재순환으로 30 분 동안 세척하십시오.
재순환 없이 2리터의 탈이온수로 이 세척을 따르십시오. 물이 빠지면 2리터의 Tyro 용액을 순환시키고 5미크론 필터에 통과시킵니다. 워터 재킷과 순환기로 산소 공급 가스를 용액에 주입하여 섭씨 8도에서 37도까지 관류를 가열합니다.
pH를 7.35 플러스 또는 마이너스 0.05로 유지하기 위해 가스 버블링 속도를 조정합니다. 실험 중 pH와 온도를 모두 모니터링합니다. 듀얼 광학 매핑 장치는 초당 3000프레임으로 100 x 100 픽셀 이미지를 캡처할 수 있는 두 개의 고속 C 모스 카메라로 구성됩니다.
칼슘 이미징 카메라에 대역 통과 필터를 부착하고 듀얼 카메라 홀더의 전압 이미징 카메라에 긴 패스 필터를 부착합니다. 다이 거울과 렌즈를 부착하여 심장에서 나오는 방출광이 렌즈에 의해 거울에 집중되도록 합니다. 또한 두 대의 카메라를 홀더에 부착하고 서로 수직이 되도록 배열합니다.
다음으로 여기광을 설정합니다. 빛은 할로겐 램프에 의해 생성되며 유연한 라이트 가이드를 통해 전달됩니다. 열 필터, 노출을 제한하는 셔터, 여기 대역 통과 필터를 통해 빛을 통과시킵니다.
마지막으로, 은과 염화은 전극을 챔버에 설치하여 준비합니다. 앰프와 필터의 레벨을 다시 확인하고 조정한 후 설정이 마음에 들 준비가 되었습니다. 케타민과 자일라진을 헤파린 100단위와 함께 섞은 칵테일을 사용하여 진행하기 전에 마우스를 마취합니다.
발가락 꼬집기를 사용하여 동물이 통증 반사가 없는지 확인하십시오. 흉골 중앙을 절개한 후 심장과 주변 조직을 빠르게 제거합니다. 그런 다음 신속하게 해부 현미경을 사용하여 대동맥을 식별하고 오른쪽 쇄골하 동맥 아래의 상행 대동맥을 가로질러 깨끗하게 절단합니다.
이제 대동맥의 짧은 부분을 4 개의 오 블랙 꼰 실크 봉합사를 사용하여 맞춤형 21 게이지 캐뉼라에 부착하십시오. 캐뉼레이션 후 복고풍으로 심장을 크게 퍼퓨하고 슈퍼 융합합니다. Tyro 용액을 사용하여 대동맥 압력을 60mm에서 80mm 사이로 유지하도록 유량을 조정합니다. 압력 변환기로 측정한 수은.
이제 주변의 폐, 흉선 및 지방 조직을 절개하고 제거합니다. 이제 폐정맥을 통해 좌심실에 실리콘 튜브를 삽입합니다. 튜브를 근처의 결합 조직에 봉합합니다.
이 매우 중요한 단계는 특히 심실 수축을 억제한 후 좌심실에 갇힌 Perfuse eight의 울혈 및 산성화를 방지합니다. Perfuse 8 유도 심장 움직임을 방지하려면 심장을 문턱 가드 코팅된 관류 챔버의 정점에 고정합니다. 또한, 오른쪽 및 왼쪽 심방 부속물을 늘리고 고정하여 직립 구성에서 심방의 표면적을 증가시킵니다.
이렇게 하면 기록 표면적이 최대화됩니다. 페이싱 자극을 수행하려면 심장 표면에 맞춤형 전극을 부착하십시오. 모션 아티팩트를 줄이려면 용액 표면의 심장 위에 작은 커버 유리를 고정합니다.
여러 핀 사이에 유리를 끼워 이렇게하십시오. 최종 준비로, 여기광을 심장에 집중시키고 광학 이미지를 얻을 수 있도록 카메라를 배치한 다음, 다이를 로딩하는 동안 염료를 로딩하는 것으로 시작합니다. 심장의 정상적인 전기적 기능을 보장하기 위해 ECG 기록을 지속적으로 모니터링합니다.
BLE 스타틴을 실온으로 예열하는 것부터 시작합니다. 그런 다음 1/2 밀리리터의 BLE 스타틴을 저장 탱크에 있는 8개의 풍부한 용액에 혼합하고, 나머지 10분의 1 밀리리터의 BLE 스타틴을 1ml의 Tyros 용액에 희석합니다. 다음 20분 동안 캐뉼라 근처의 약물 포트를 통해 BLEs 스타틴을 티로에 천천히 주입합니다.
BLEs 스타틴은 운동 아티팩트를 점진적으로 감소시킵니다. 다음으로, 30 마이크로 리터의 전압 민감성 염료를 1 밀리리터 티로 용액으로 희석하고이 혼합물을 동일한 약물 포트에 5-7 분에 걸쳐 천천히 주입합니다. 그런 다음 같은 혼합물을 다시 만드십시오.
이번에는 30 마이크로 리터의 칼슘 지표를 추가합니다. 이 혼합물을 같은 포트를 통해 5-10분에 걸쳐 천천히 바르십시오. 칼슘 지시약을 주입한 후 BLEs 스타틴이 운동을 완전히 억제하고 염료가 세포에 들어갈 때까지 5-10분 더 기다렸다가 실험을 진행합니다.
이러한 마음의 준비는 이루어졌습니다. 프로토콜에 따르면, ECG 신호는 S one S one 자극으로 인한 심실 페이싱 중에 기록되었습니다. 활동 전위와 칼슘 과도 신호는 왼쪽의 심방과 오른쪽의 심실에서 기록되었습니다.
화살표는 카메라의 기록을 3 픽셀 x 3 픽셀 단위로 binning하여 심실로부터의 신호 산란이 발생한 위치를 보여주며, 배열 데이터의 데이터로부터 칼슘 과도 현상 및 활동 전위의 배열을 표시할 수 있습니다. 활동 전위 전도를 나타내는 그림이 구성될 수 있습니다. 횡축과 종축에 있는 3개의 연속된 지점에서 얻은 데이터는 심실 표면을 가로지르는 활동 전위의 전파에 따른 진폭 변화를 보여줍니다.
마찬가지로, 활동 전위와 칼슘 과도 지속시간을 보여주는 그림이 구성될 수 있습니다. 그러면 왼쪽의 오른쪽에 제어 조건이 표시됩니다. 이소프로테레놀(isoproterenol)을 심장에 주사하여 칼슘 과도 현상과 활동 전위의 지속 시간을 분명히 단축시켰습니다.
이 기술을 마스터하면 이 절차에 따라 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. AV 노드의 불응 주기에 관한 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 페이싱 프로토콜과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.
개요
본 연구는 분리된 랑게르판 관류 쥐 심장에서 막 전위 및 세포내 칼슘 변동을 광학 매핑하는 상세한 절차를 제시합니다. 본 방법은 전통적인 기술에 비해 공간 해상도를 향상시켜 심장 전기 생리학에 대한 통찰력을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심장 전기 생리학
- 광학 매핑 기술
- 쥐 심장 모델
배경
- 광학 매핑은 Vm 및 CaT를 동시에 측정할 수 있습니다.
- 미세 전극과 같은 전통적인 방법은 공간 해상도에 한계가 있습니다.
- 이 기술은 방혈증 연구에 도움이 될 수 있습니다.
- 랑게르판 관류는 실험을 위해 심장 생존력을 유지합니다.
연구 목적
- 쥐 심장에서 광학 매핑을 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- 심장 전기 활동에 대한 이해를 높입니다.
- 부정맥의 메커니즘 연구를 촉진합니다.
사용된 방법
- 관류를 위해 쥐 심장을 절제하고 관류관을 연결합니다.
- 광학 이미지를 캡처하기 위해 고속 카메라를 사용합니다.
- 막 전위 및 칼슘 변동을 시각화하기 위해 광학 염료를 로딩합니다.
- 실험 중 pH 및 온도를 모니터링합니다.
주요 결과
- 분리된 심장에서 Vm 및 CaT의 광학 매핑에 성공했습니다.
- 염료 적용 시 동 동작 아티팩트 감소를 입증했습니다.
- 활동 전위 및 칼슘 변동 신호를 효과적으로 기록했습니다.
- 향후 전기 생리학 연구를 위한 방법을 검증했습니다.
결론
- 광학 매핑 기술은 높은 공간 해상도를 제공합니다.
- 이 방법은 심장 전기 생리학 연구를 발전시킬 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 이 기술을 활용하여 방혈증을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Optical mapping of transmembrane potential and calcium transients in mouse hearts provides high-resolution spatial and temporal data critical for mechanistic de-risking in cardiovascular target validation. This approach enables quantitative assessment of electrophysiological phenotypes, supporting predictive confidence in preclinical models of arrhythmia and heart failure. By capturing concurrent Vm and CaT dynamics, the method bridges discovery biology with translational biomarker alignment in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping action potential and calcium transient dynamics across cardiac tissue.
- Operational Value: Supports biological de-risking through simultaneous visualization of excitation-contraction coupling parameters.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking molecular perturbations to functional electrophysiological outputs.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via standardized optical signal acquisition.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible measurements of action potential duration, conduction velocity, and calcium transient amplitude.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple cardiac disease models through consistent Langendorff perfusion and dye loading protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studies of heart failure, arrhythmias, and metabolic disease using genetically engineered mouse models.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical validation through preserved tissue architecture and physiological perfusion.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying electrophysiological liability early in the discovery pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical efficacy assessment, enabling iterative refinement of cardiovascular candidates based on functional electrophysiological readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by correlating genetic or pharmacological interventions with spatial electrophysiological patterns.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs essential for reliable compound screening in ion channel and modulator discovery.
- Analytics: Provides spatiotemporal measurements of Vm and CaT that enable comparative analysis across experimental conditions and genotypes.
- Translational Research: Maintains physiological relevance through Langendorff perfusion, supporting extrapolation to intact organ responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological phenotyping capability applicable across multiple cardiovascular projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac electrophysiology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined perfusion, dye loading, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying electrophysiological liabilities prior to significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative action potential and calcium transient profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, Langendorff perfusion, and optical imaging systems.
- Dependent on high-speed CMOS cameras, excitation light sources, and optical filter sets for dual-channel detection.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading protocols and motion artifact reduction strategies.
- Involves adaptation considerations when translating to different mouse strains or disease models with altered cardiac physiology.
- Includes practical limitations such as dye toxicity, photobleaching, and the need for meticulous motion suppression to maintain data quality.
