마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

이 절차의 전반적인 목표는 적출된 쥐의 심장을 LOR(Langendorff) 관류 상태에서 유지하며 초막 전위와 세포 내 칼슘 과도 현상을 동시에 광학적으로 매핑하는 것입니다. 이를 위해 먼저 온전한 쥐 심장을 적출한 후, 대동맥에 캐뉼라를 삽입하고 LOR 관류를 시작합니다. 다음 단계로, 심장을 수축-이완 커플러에 고정하고 관류 챔버에 핀으로 고정하여 심장을 부동화합니다.

마지막 단계는 광학 염료를 주입하고 실험 중 움직임으로 인한 아티팩트를 줄이기 위한 준비를 하는 것입니다. 광학 이미지는 my cam Ultima LC Moss 카메라를 사용하여 심장에서 방출되는 빛을 수집함으로써 얻습니다. 안녕하세요, 제 이름은 di입니다.

저는 워싱턴 대학교의 대학원생입니다. 마이크로 전극과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주된 장점은, 광학 매핑을 통해 심장 전체 표면에 걸쳐 더 높은 공간 해상도를 얻을 수 있다는 점입니다. 안녕하세요, 저는 Matt Sulkin입니다.

저는 워싱턴 대학교의 대학원생입니다. 이 방법은 올바르게 수행될 경우, 부정맥 발생의 기전과 같은 심장 전기생리학의 많은 의문점을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 연동 펌프 한 대를 설정하여 용액이 40 milliliters per minute로 순환하도록 하십시오.

그런 다음 두 번째 연동 펌프를 분당 80 milliliters로 설정합니다. 이 펌프는 Perfuse 8을 보관 및 산소 공급 리저버로 다시 되돌려 보냅니다. 펌프를 작동시키고 70% ethanol 1 liter를 사용하여 30분 동안 순환 세척합니다.

재순환 없이 2L의 탈이온수로 세척하십시오. 물을 배출한 후, 2L의 Tyro 용액을 5µm 필터를 통해 순환시킵니다. 워터 재킷과 순환기를 사용하여 관류 장치를 37°C로 가온하고, 용액에 산소화된 가스를 버블링하십시오.

pH를 7.35 ± 0.05로 유지하도록 가스 버블링 속도를 조절하십시오. 실험 중에 pH와 온도를 모두 모니터링하십시오. 이중 광학 매핑 장치는 초당 3000 프레임으로 100 x 100 픽셀 이미지를 캡처할 수 있는 두 대의 고속 CMOS 카메라로 구성되어 있습니다.

밴드패스 필터를 칼슘 이미징 카메라에 장착하고, 듀얼 카메라 홀더의 전압 이미징 카메라에는 롱패스 필터를 장착합니다. 다이이크(diic) 미러와 렌즈를 장착하여 심장에서 나오는 방출광이 렌즈에 의해 미러로 집중되도록 합니다. 또한, 두 대의 카메라를 홀더에 장착하고 서로 수직이 되도록 배치합니다.

다음으로, 여기 광원을 설정합니다. 빛은 할로겐 램프에 의해 생성되며 유연한 라이트 가이드를 통해 유도됩니다. 빛을 열 필터, 노출 시간을 제한하기 위한 셔터, 그리고 여기 밴드패스 필터에 통과시킵니다.

마지막으로, 은 및 염화은 전극을 챔버에 설치하여 준비합니다. 앰프와 필터의 레벨을 이중 확인하고 조정한 후, 심장 실험을 위한 준비가 완료됩니다. 실험을 진행하기 전, 케타민과 자일라진 칵테일에 헤파린 100 unit을 섞어 마우스를 마취하십시오.

발가락 꼬집기 시험을 통해 동물에게 통증 반사가 없는지 확인하십시오. 흉골 중앙에 절개를 가한 후, 심장과 주변 조직을 빠르게 제거합니다. 그다음 해부 현미경을 사용하여 신속하게 대동맥을 확인하고, 우측 쇄골하동맥 아래의 상행 대동맥을 깨끗하게 절단하십시오.

이제 4-0 검은색 편조 실크 봉합사를 사용하여 대동맥의 짧은 단면을 맞춤 제작된 21게이지 캐뉼라에 연결합니다. 캐뉼라 삽입 후 Tyrode 용액으로 심장을 역행성 관류 및 과관류시킵니다. 압력 트랜스듀서로 측정되는 대동맥압이 60에서 80 mmHg 사이로 유지되도록 유량을 조절합니다.

이제 주변의 폐, 흉선 및 지방 조직을 절개하여 제거합니다. 이제 폐정맥을 통해 좌심실에 실리콘 튜브를 삽입합니다. 튜브를 주변 결합 조직에 봉합합니다.

이 매우 중요한 단계는 특히 심실 수축이 억제된 후 좌심실에 갇힌 Perfuse eight의 정체 및 산성화를 방지합니다. Perfuse eight으로 인해 유발되는 심장의 움직임을 방지하기 위해, 심장의 첨단부를 sill guard 코팅된 관류 챔버 바닥에 고정하십시오. 또한, 우심방과 좌심방의 꼬리(atrial appendages)를 당겨 고정함으로써 직립 상태에서 심방의 표면적을 넓히십시오.

이렇게 하면 기록 표면적을 최대화할 수 있습니다. 페이싱 자극을 수행하려면 맞춤 제작된 전극을 심장 표면에 부착하십시오. 움직임으로 인한 아티팩트를 줄이기 위해, 용액 표면의 심장 위에 작은 커버 글라스를 고정하십시오.

여러 개의 핀 사이에 유리를 끼워 고정하여 이를 수행하십시오. 최종 준비 단계로, 여기광을 심장에 집중시키고 카메라를 배치하여 광학 이미지를 얻은 다음, 염료를 로딩하면서 로딩을 시작하십시오. 심장의 정상적인 전기적 기능을 보장하기 위해 ECG 기록을 지속적으로 모니터링하십시오.

먼저 BLEs statin을 실온으로 가온합니다. 그 다음, 0.5 mL의 BLEs statin을 유지 저장조의 profuse eight에 혼합하고, 남은 0.1 mL의 BLEs statin을 1 mL의 Tyros 용액으로 희석합니다. 이후 20분 동안 캐뉼라 근처의 약물 주입구를 통해 Tyros에 희석된 BLEs statin을 천천히 주입합니다.

BLEs statin이 점차적으로 움직임 아티팩트를 감소시킬 것입니다. 다음으로, 30 µL의 전압 민감성 염료를 1 mL의 tyro 용액에 희석하고, 이 혼합액을 동일한 약물 포트를 통해 5~7분 동안 천천히 주입하십시오. 그런 다음 동일한 혼합액을 다시 조제하십시오.

이번에는 칼슘 지시약을 30 µL 추가로 첨가합니다. 동일한 포트를 통해 5~10분에 걸쳐 이 혼합물을 천천히 주입하십시오. 칼슘 지시약 주입 후, BLEs statin이 움직임을 완전히 억제하고 염료가 세포 내로 들어갈 수 있도록 5~10분 더 기다린 후 실험을 진행하십시오.

심장 표본을 제작하였습니다. 프로토콜에 따라, S1-S1 자극을 통한 심실 페이싱 동안 ECG 신호를 기록하였습니다. 좌측 심방과 우측 심실에서 활동 전위 및 칼슘 과도 신호를 기록하였습니다.

화살표는 뇌실에서 신호 산란이 발생한 위치를 나타내며, 카메라 기록을 3x3 픽셀 단위로 빈닝(binning)함으로써 어레이 데이터로부터 칼슘 과도 현상과 활동 전위의 어레이를 표시할 수 있습니다. 이를 통해 활동 전위 전도를 보여주는 그림을 구성할 수 있습니다. 가로축과 세로축의 연속적인 세 지점에서 얻은 데이터는 심실 표면을 가로지르는 활동 전위 전파에 따른 진폭 변화를 보여줍니다.

마찬가지로, 활동 전위와 칼슘 과도 현상의 지속 시간을 보여주는 그림을 작성할 수 있습니다. 여기에서 왼쪽은 대조군 조건을, 오른쪽은 실험군 조건을 보여줍니다. 심장에 이소프로테레놀을 주입하면 칼슘 과도 현상과 활동 전위의 지속 시간이 모두 명확하게 단축됩니다.

이 기술을 숙달하면 본 절차에 따라 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. AV 노드의 불응기와 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 페이싱 프로토콜과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.