January 9th, 2013
모기 표본의 품질 말라리아 기생충 및 벡터 DNA를 추출 할 수 신속하고 저렴한 방법은 설명되어 있습니다. 간단한 방법은 모기 중간 창자와 침샘 단계에서 말라리아 기생충의 genotyping,뿐만 아니라의 분자 식별, Chelex 수지의 킬레이트 특성에 수 대문자로 표기 아노펠레스 PCR에 의해 종을 형제.
이 절차의 전반적인 목표는 기형, 표본의 중장 및 타액선 절편에서 말라리아, 기생충 및 모기 DNA를 추출하는 것입니다. 이것은 먼저 복부와 흉부 사이의 관절에서 정확히 모기를 절단하여 침샘 부분에서 중장을 분리함으로써 이루어집니다. 다음으로, 각 섹션은 탈이온수에서 별도로 분쇄됩니다.
그런 다음 조직 현탁액을 눕히고 세척하고 세포 펠릿을 회수합니다. 마지막으로, 세포 펠릿을 재구성하고 끓인 다음 DNA를 추출합니다. 궁극적으로, PCR 및 대립유전자 특이적 제한 효소 소화를 통해 기형, 매개체 종 및 유전자형 말라리아 감염을 식별하기 위한 템플릿으로 사용하기에 적합한 고품질 모기 및 말라리아 기생충, DNA를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.
따라서 유기물 추출 및 분류 방법과 같은 기존 기술에 비해 이 매우 간단한 기술의 주요 장점은 안전하고 쉽게 구할 수 있는 시약을 거의 사용하지 않고 처리 시간도 훨씬 짧다는 것입니다. 모기를 해부하기 시작하려면 작은 파라폼 조각에 모기를 놓고 해부 현미경에 장착하십시오. 탈이온수 한 방울로 덮으십시오.
조직의 크기를 부드럽게하기 위해 모기 사체는 흉부와 복부 사이의 관절에서 정확하게 움직입니다. 따라서 복부에서 머리와 흉부를 깎아냅니다. 해부된 각 모기 절편을 깨끗한 오토클레이브, 모기 ID 번호와 신체 단면이 사전 표시된 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 파라 필름을 버리고 70% 알코올에 적신 김 물티슈를 사용하여 현미경 단계를 조심스럽게 닦은 다음 모기로 처리하기 전에 모기 DNA를 추출하기 위해 첫 번째 피펫 20마이크로리터의 탈이온수를 샘플 튜브로 추출합니다.
그리고 피펫 팁을 사용하여 물에 잠긴 모기 부분을 균일한 현탁액으로 분쇄합니다. 100마이크로리터의 오토클레이브, XPBS 1%사포닌 용액 1개를 시료 균질화에 넣고 부드럽게 와류로 혼합합니다. 샘플을 실온에서 20분 동안 배양합니다.
20, 2 분 동안 000 G에 다음 분리기, 그리고 상층액을 버리십시오. 펠릿을 100마이크로리터 1XPBS에 재현탁합니다. 그런 다음 스핀을 반복합니다.
75 마이크로 리터의 멸균 탈 이온수와 부피 당 25 % 중량의 20 마이크로 리터를 추가합니다. Cellex 100 수지를 탈이온수에 현탁시키고 분젠 버너에서 화염을 낸 멸균 23 게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 펠릿을 다시 현탁시키기 위해 부드럽게 와류를 일으킵니다. 샘플 튜브의 뚜껑에 구멍을 뚫습니다.
샘플 현탁액을 가열 블록에서 10분 동안 끓입니다. 20, 1 분 동안 000 G에 분리기를 이용하고, 추출한 DNA의 질을 검사하기 위하여 PCR 반응에 있는 템플렛으로 사용을 위한 전 레테르를 붙인 저장 작은 유리병으로 DNA 해결책을 옮기고, 400의 기본적인 쌍 파편을 생성할 것으로 예상되는 절지동물 mi 미토콘드리아 nicotinamide 아데닌 디뉴클레오티드 dehydrogenase 소단위 4 유전자의 지구를 증폭하십시오. 다음으로 Ananais Gambia 종을 구별하기 위해 Ananais Gambia Sens Stricto에 대해 390개의 염기쌍과 ananais api에 대해 315개의 염기쌍 크기를 생성할 것으로 예상되는 유전자 간 스페이서 영역에서 SNP 옆 영역을 증폭합니다.
그런 다음 Ansis는 유전자형 p falciparum 안티 엽산 약물 내성 다형성을 수행합니다. 중첩 PCR을 수행하여 아미노산 코돈 16, 51, 59, 108 및 164를 둘러싸고 있는 영역을 증폭합니다. 기생충에서 디하이드로 엽산 환원효소 유전자는 앰플리콘의 대립유전자 특이적 소화를 수행하여 항엽산 약물 내성을 검출합니다.
관련 다형성. 2%AROS 겔 검사에서 반응을 확인합니다. 모기 DNA 추출물 품질 분석 analis RABIS 분자 식별 및 p falciparum 유전형 분석에 대한 PCR 분석 결과의 예는 단순화된 Kelex 방법이 각 추출물에서 유사한 DNA 품질로 더 적은 단계와 1/4 미만의 시간에도 불구하고 표준 염분 제거 프로토콜과 유사한 결과를 산출한다는 것을 보여주며, 이상 징후와 관련하여 샘플 양성률이 다음과 같은 것은 놀라운 일이 아닙니다. 감비아의 형제자매 종과 기생충 감염률은 McNear의 카이 제곱 검정에 따라 통계적으로 다르지 않았습니다.
반응 혼합물에 BSA를 추가하면 단순화된 kelex 및 일반 염장 프로토콜 모두에 대한 PCR 억제제의 제거로 인해 PCR 양성 반응이 일반적으로 증가합니다. 그러나 이러한 증가는 켈렉스 추출물의 DNA 품질을 제외하고는 통계적으로 유의하지 않았습니다. p falciparum amplicon의 대립유전자 특이적 제한 효소 소화는 약물 내성 대립유전자에 대한 중장 및 타액선 말라리아 감염의 유전형 분석을 가능하게 합니다.
이 기술은 제대로 수행되면 약 37분 안에 수행할 수 있어야 합니다.
이 기사는 말라리아 기생충 및 모기 매개체로부터 고품질 DNA를 추출하는 빠르고 경제적인 방법을 설명합니다. Chelex 수지를 사용하여 이 기술은 말라리아 기생충의 유전형 분석 및 아노펠레스 종의 분자 식별을 효과적으로 가능하게 합니다.
In resource-limited settings, sustainable molecular surveillance of malaria vectors and parasites requires DNA extraction methods that balance performance with operational simplicity. The Chelex-based protocol delivers comparable DNA quality to established salting-out methods while reducing reagent complexity and processing time from nearly three hours to under 40 minutes. This positions the method as a practical tool for enabling scalable, cost-effective genotyping and species identification workflows in endemic region research and control programs.
The method fits within the discovery continuum from specimen processing to genetic analysis, enabling reliable input for PCR-based identification and genotyping assays.