Name: 의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 생쥐 맹장에서 Pseudomonas aeruginosa RNA를 격리하는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 산성 페놀 클로로포름 추출과 다중 용해 단계를 통해 고품질 RNA를 확보하여 qPCR 및 RNA 시퀀싱에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 보건 보조금 AI62983 국립 연구소 (AYK), AI22535 (GPB)에 의해 재정 지원되었다.

1. P.의 Murine 모델 녹농균이라는 박테리아의 GI의 콜로니 및 전파 <ol><li> C3H/HeN 마우스 (암, 6-8 wks 노인, 할란)는 공생 식물을 고갈 후 이전 4 설명된대로 PA와 함께 모노가 - 식민지에 경구 항생제로 치료하고 있습니다. </li></ol> 2. Murine Cecal Luminal 내용 수확 <ol><li> 액체 질소 욕조에 청소 스테인리스 박격포 젖어. </li><li> 이산화탄소 질식으로 마우스를 안락사. </li><li> 스티로폼 보드와 95 % 에탄올로 샤워에서 보안 마우스 시체. 흉골에서 회음부로 피부를 통해 중간선에 세로 절개를합니다. 피부와 복강을 노출 복막을 반영합니다. </li><li> 전체 맹장을 잘라 내다. 스테인리스 박격포 이상 포셉과 맹장을 잡아. 해부 가위로 맹장의 양쪽 끝이 싹둑. </li><li> 이게 맹장의 근위 끝에 cecal flushate 버퍼 (10 MM TrisHCl, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 MM NaCl) 5 개 중 1 ML 가득한 P1000 피펫 팁을 넣습니다. 스테인레스 절구에 cecal flushate 버퍼와 cecal luminal 내용을 플러시. cecal flushate 버퍼 1 ML은 cecal 내용을 모두 꼴이지 충분한 것입니다. Cecal flushate 내용은 박격포와 접촉으로 오는 즉시 정지됩니다. </li><li> 멸균 유봉과 함께 cecal flushate 내용을 분쇄. </li><li> 장소 그라운드 드라이 아이스 / 에탄올 목욕탕에 빠져들 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 cecal luminal 내용을 냉동. </li><li> 반복 각 추가 마우스 2.7을 통해 2.2 단계. </li><li> -80에서 보관 ° C. </li></ol> 3. 박테리아 RNA 격리 <ol><li> 산성 클로로포름 / 페놀의 따뜻한 1 볼륨 (약 3 ML, 두 cecal luminal 내용의 최종 부피에 따라) (5시 1분, V / V)는 65 parafilm에서 보안 뚜껑과 함께 50 ML 오크 릿지의 원심 튜브에 들어있는 ° C의 물 목욕. </li><li> 5 분 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 포함된 용해 완충액 0.5 볼륨 (2 % SDS, 16 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 MM NaCl) 6 끓여. </li><li> cecal luminal 내용에 끓는 용해 버퍼를 추가합니다. Homogenize. 정기 vortexing 5 분 동안 끓여. </li><li> 추가 100 ° 65 ° C 산 오크 릿지의 원심 튜브에 클로로포름 / 페놀로 C cecal 내용 / 용해 샘플. parafilm로 밀봉 캡. </li><li> 65 품어 ° C 정기 vortexing (매 2 분) 10 분. </li><li> 15 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 새로운 50 ML 오크 릿지의 원심 분리기에 수성 단계 (흰색 인터페이스 중 하나를 피하는) 전송. 수성 단계의 볼륨 cecal 내용, 용해 버퍼, 그리고 산성 클로로포름 / 페놀의 전체 볼륨의 약 50 %됩니다. 산성 클로로포름 / 페놀의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 인감 parafilm와 모자와 높은 속도로 vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 15 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 수성과 유기농 단계 사이에 보이는 흰 인터페이스가 없습니다 때까지 3.9-3.7 단계를 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 새로운 50 ML 오크 릿지의 원심 분리기에 수성 단계를 전송합니다. 클로로포름 / isoamyl 알콜의 동일한 음량을 (24:1, V / V) 추가합니다. </li><li> 밀봉 캡 및 vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 15 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기. 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 관에 수성 단계 (볼륨이 전체 볼륨의 반응 약 50 % 것입니다)를 제거하고 이소프로판올의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 최소한 2 시간 또는 야간을위한 -20 °의에서 품어. </li><li> 45 분 동안 4 명이시 2,500g에서 샘플을 원심 분리기. 펠렛 같은 겔은 튜브의 아래쪽에 형성됩니다. 뜨는 제거합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오. 와동. 5 분 4 명이시 10,000그램에서에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는를 제거하고 10 분 동안 상온에서 건조 펠렛을 알려주도록 튜브를 반전. </li><li> RNase없는 물 200 μl의 RNA 펠렛을 Resuspend. </li></ol> 4. DNase 처리 (터보 DNA - 무료, 응용 Biosystems) <ol><li> 10X 터보 DNase 버퍼와 2 μl 터보 DNase 20 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 20 분 동안 37 °에서 알을 품다. </li><li> resuspended DNase의 불활 성화 시약 20 μl를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 때때로 혼합, 실온에서 5 분 품어. </li><li> 1.5 분 동안 상온에서 10,000g에서 원심과 새 microfuge 튜브에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 페놀 / 클로로포름 감기 (4 °) 산 중 하나가 볼륨을 추가하고 1 분 vortexing하여 철저히 섞는다. </li><li> 2 분 동안 상온에서 1만2천5백g에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 튜브로 수성 단계를 전송하고 클로로포름 / isoamyl 알콜 (49:1 V / V), 와동 1 볼륨을 추가합니다. </li><li> 2 분 동안 상온에서 1만2천5백g에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 튜브로 수성 단계 (총 반응 량의 약 50 %) 전송합니다. </li><li> 3M의 아세트산 나트륨의 0.1 볼륨, 산도 5.5 및 추가얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 2.5 권. 와동. </li><li> 적어도 2 시간 30 분 -80 °에서 -20 °의에서 품어. </li><li> 4 30 분 1만2천g에서 원심 ° </li><li> 뜨는 제거합니다. </li><li> 4 명이시 10,000g에서 5 분 centrifuging하여 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 1 ML로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 10 분 뜨는 공기 건조를 제거합니다. </li><li> RNase없는 물 100 μl의 펠렛을 Resuspend. resuspend 65 ° 물을 욕조에 장소와 펠렛을 해산해야 할 수도 있습니다. </li><li> DNase 처리의 효능을 테스트하려면, ribosomal 단백질 (또는 기타 참조 유전자)의 증폭에 대한 표준 RT - PCR 반응을 더 RT 컨트롤을 사용하지, 처리 및 비 - 처리 샘플을 수행할 수 있습니다. </li></ol> 5. RNA 정리 단계 (Qiagen, RNeasy 키트) <ol><li> Qiagen RNeasy 미니 수첩 (4 번째 에디션 월 2006)의 페이지 56-57을 참조하시기 바랍니다. 로 표시하십시오. </li></ol> 6. 대표 결과 이 프로토콜을 사용하여 복구할 세균성 총 RNA의 양은 두 cecums에서 약 2-3 μg이다. 회수 RNA는 다음 qPCR, 전사 프로 파일링, 및 RNA Seq 실험을위한 충분한 수량과 품질입니다. RNA의 순도는 정기적으로 260nm/280nm 비율에게 샘플 7를 측정하여 평가, 아직이 방법은 RNA 무결성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 애질런트 Bioanalyzer은 사이징, 부량 및 DNA, RNA, 단백질 및 세포의 품질 관리를위한 microfluidics 기반 플랫폼 및 RNA 무결성 번호 (린) 8로 알려진 RNA 무결성 메트 릭을 사용합니다. 이 프로토콜은 1.7에서 2.0와 린 값 ≥ 7.0까지 280분의 260 비율을 생산과 RNA가 추출. 이 프로토콜에 의해 복구 세균성 RNA의 애질런트 Bioanalyzer 분석의 예제는 그림 1에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 애질런트 Bioanalyzer electropherogram과 녹농균 총 RNA 샘플의 젤 같은 이미지가 격리되고 murine cecal 내용에서 회복. 린 8.0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

RNA 추출 방법은 여기에서 설명한 것은 murine GI 기관을에서 수확 고품질 녹농균의 총 RNA의 충분한 수량의 복구를 허용합니다. 이 방법은 P.에 국한되지 않고 녹농균이라는 박테리아하며 잠재적으로 다른 세균에 적용할 수 있습니다. 소장에서 충분한 미생물 생물의 복구는 생명체에서 생명체로 크게 달라집니다. 우리 murine 모델, P.에서는 녹농균이라는 박테리아는 일반적으로 5 X 10월 7일에서 5일까지 X 10 8 cfu / g 대변 4 사이의 레벨에서 murine GI 넓이를 colonizes. 회수 cecal 내용은 약 0.5 g, P.의 예상 번호이므로 이 cecums에서 발견한 녹농균이라는 박테리아는 5 X 10월 7일에서 5일까지 X 10 8 cfu 사이입니다. 기타 미생물을 사용하는 경우 그것은 식민지 GI 수치를 확인한 후 cfu의 대상 번호를 복구하는 데 필요한 cecums의 수를 계산하기 위해 신중한 것입니다. 이 특정 murine 모델을 사용하는 경우, PA에 감염되지 않은 항생제 - 처리 생쥐들이 cecal 내용에서 격리 RNA에 대한 같지는 금액이 없다는 것을주의하는 것도 중요하다. 녹농균 위장 식민지와 P.의 pathogenesis을 흉내낸 보급 시도 우리의 murine 모델 암 줄기 세포 이식 환자에서 녹농균이라는 박테리아 bacteremia. 이 환자 인구, 공생 식물은 주로 병원성 미생물 (예 : P.의 녹농균이라는 박테리아와 모노 협회)의 전면에 자라난 그 결과 항생제 또는 chemotherapeutic 치료 (GI 공생 식물의 항생제 고갈 등)에 보조 소진 있으며 면역 억제 후에 후속 보급. 이 murine 모델의 장점과 한계는 이미 이전에 네 해결되었습니다. 현재이 연구의 목적은 GI의 넓이로 봐서에서 미생물 총 RNA를 분리를위한 방법론을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 쉽게 GI 요로 (즉, 공생 식물의 상호 작용, 염증성 장 질환, 세균 등에 효과)에 미생물의 pathogenesis의 다른 측면을 연구 다른 murine 모델 적용할 수 있습니다. 이 방법의 장점 중 하나는 동결 / 해동, 기계 장애 (박격포 / 유봉, 균질로 pulverizing), 끓고, 화학 용해 (예 : SDS)를 포함하여 여러 용해 단계의 결합입니다. 용해 단계의 무리에도 불구하고, 일부 미생물 (특히 그람 양성 세균 및 곰팡이 / 효모) 추가 기계적 중단을 요구할 수 있습니다. 용해 / 산 페놀 - 클로로포름 부화 (3.5 단계), 구슬의 추가 (박테리아와 효모에 대한 / 또는 0.5-0.7 mm 위해 0.1 ㎜)와 이후의 구슬 - 박동 단계 뜨거운 후, 이러한 생물 9 lyse하기에 충분해야합니다 10. murine이게 맹장, 반복 차가운 acid-phenol/chloroform extractions (단계 3.7-3.9)에서 복구 재료의 복잡한 특성상 절대적으로 더 이상 하류 반응에 대한 허용 RNA의 품질과 무결성을 달성하기 위해서 필요합니다. 3-5 추위 acid-phenol/chloroform extractions 사이에 멸망 수성 및 유기 단계 사이의 흰색 인터페이스를하기 전에해야 할 수 있습니다. 마지막으로, DNase 처리 (4 단계)와 RNeasy 정리 프로토콜 (5 단계) 모두의 조합 훼손 DNA와 비 mRNA 소형 (기들과 tRNA)를 제거 필수적입니다. 이전에 언급한 바와 같이,이 프로토콜을 이용하여 회수 RNA는 이후 전사 프로 파일링 3, qPCR (게시되지 않은), 그리고 RNA Seq (게시되지 않은) 실험을위한 충분한 수량과 품질입니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 박격포와 유봉 </td><td> 어부 </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> 균 질기 </td><td> 옴니 </td><td> TM - 125 </td></tr><tr><td> 오크 릿지의 원심 분리기 튜브 (50 ML) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> 산성 페놀 / 클로로포름 </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Isoamyl 알코올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> 이소프로판올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> 디에틸 pyrocarbonate (DEPC) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 40,718 </td></tr><tr><td> DNase </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> 3M의 아세트산 나트륨 </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100 % 에탄올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

의 rna 격리 녹농균 murine 위장관을 colonizing

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

이러한 백혈병 환자, 심한 화상 상처, 또는 장기 이식 1로 손상된 면역 체계와 호스트에 중요한 병적 상태와 사망률에 녹농균 (PA) 감염 결과. PA의 혈류 감염을 개발하기위한 높은 위험 환자에서 위장 (GI) 넓이는 식민지 2 주 저수지이지만, 메커니즘하는 asymptomatic colonizing 미생물의 침략, 그리고 종종 치명적인 위해 PA 전환은, 병원체가 명확하지 않습니다. 이전, 우리는 숙주의 면역 상태를 변경하는 동안 세균의 유전자 표현의 변화를 파악하기 위해 쥐를 3 식민지의 cecums에 거주하는 세균 세포에서 PA의 mRNA를 복구하여 생체내 전사 프로 파일링 실험에서 수행했습니다. 모든 전사 프로 파일링 실험과 마찬가지로 속도 - 제한 단계는 고품질의 mRNA의 충분한 양을의 격리에 있습니다. 효소, 파편, 음식 잔류물 및 GI 기관을의 미립자 물질의 풍부한 감안할 때, RNA 분리의 도전은 어려운 것입니다. 여기, 우리는 murine GI 기관을에서 발견한 박테리아 RNA의 신뢰성과 재현성 절연을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 PA GI의 식민지와 neutropenia - 유도 보급 4 잘 설립 murine 모델을 활용합니다. PA와 함께 일단 GI 식민지가 확인, 마우스는 euthanized와 cecal 내용 회복과 플래시 냉동입니다. RNA는 다음 기계적 끓고 혼란, 페놀 / 클로로포름 extractions, DNase 처리 및 친화성 크로마 토그래피의 조합을 사용하여 추출됩니다. 수량과 순도​​는 분광 광도법 (Nanodrop 기술)와 bioanalyzer (애질런트 테크놀로지) (그림 1)에 의해 확인됩니다. GI의 미생물 RNA 격리의이 방법은 쉽게뿐만 아니라 다른 세균 및 곰팡이에 적용할 수 있습니다.

의 RNA 격리에 대한 신뢰할 수있는 방법<em&gt; 녹농균</em&gt; murine cecums에서 발견한 것은 설명되어 있습니다. 회수 RNA는 다음 qPCR, 전사 프로 파일링, 및 RNA Seq 실험을위한 충분한 수량과 품질입니다. 이 기술은 다른 장내 미생물의 RNA 분리에 대해 적용할 수 있습니다.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) 감염은 면역 체계가 손상된 호스트, 예를 들어 ... 환자와 같은 이들에게 상당한 이환율과 사망률을 초래합니다.

이 프로시저의 전반적인 목표는 마우스 ECM에서 회수된 Pseudomonas aerogen의 총 RNA를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 장관 내 내용물을 수집한 다음, 박테리아 RNA를 분리함으로써 이루어집니다.그 후 D'S 처리와 RNA 정제가 수행됩니다. 마지막으로, bioanalyzer와 분광 광도 분석을 통해 RNA를 정량하고 분리물의 순도를 확인합니다. 최종적으로 QPCR, 분석, 전사 프로파일링 또는 RNA 시퀀싱 실험과 같은 후속 실험적 평가에 충분한 품질과 양의 박테리아 RNA를 얻을 수 있습니다.이 기술이 트라이올 추출과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 고품질 RNA를 확보하기 위해 매우 엄격한 산성 조건에서의 다단계 용해 단계와 클로로포름 추출 단계를 포함한다는 점입니다. 서면 프로토콜은 성공에 필수적인 세부 사항들이 누락되는 경우가 많아 용해 및 추출 단계를 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 절차 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Eduardo Lopez Medina과 실험실 매니저인 Megan Neubauer가 진행하겠습니다. 수확을 시작하기 전, IMSA는 액체 질소 욕조에서 스테인리스 스틸 막자를 세척합니다.그 후 *Pseudomonas aerogen*이 군락을 형성한 6~8주령의 C3 HHEN 마우스를 안락사시킨 뒤, 동물을 스티로폼 보드 위에 등으로 누운 자세(supine position)로 놓고 복부에 95% ethanol을 분무합니다. 다음으로, 흉골에서 회음부까지 피부를 따라 정중선 종단 절개를 실시합니다. 그런 다음 피부와 복막을 젖혀 복강을 노출시킵니다.이제 포셉을 사용하여 맹장 전체를 절제합니다. 스테인리스 스틸 유발 위에 맹장을 잡고 해부 가위로 맹장의 양 끝을 자릅니다. P 1000 피펫 팁에 1 mL의 sequel flush eight buffer를 채운 후, 팁을 맹장의 근위단에 삽입합니다.sequel flush eight 버퍼와 sequel 루멘 내 내용물을 스테인리스 스틸 유발로 씻어내십시오. 이제 멸균 페스틀을 사용하여 sequel flush eight 내용물을 갈아주십시오.그런 다음 드라이아이스가 담긴 용기에 에탄올을 붓고, 50 mL 폴리프로필렌 원심 분리 튜브를 드라이아이스-에탄올 배스에 넣습니다. 분쇄된 냉동 회장 내용물을 원심 분리 튜브로 옮기고 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오. 다음 단계들은 이 실험 절차에서 가장 까다로운 부분입니다.MI 맹장에서 수집된 시료의 복잡한 특성을 고려할 때, 수용성 층과 유기성 층 사이의 넓은 계면이 제거될 때까지 3~5회의 반복적인 냉각 필로폼 추출을 통해 수용액과 유기상 간의 적절한 균질성과 무결성을 확보하는 것이 반드시 필요합니다. 산성 페놀 클로로포름 1부피를 50 mL Oak Ridge 원심분리 튜브에 옮깁니다. 캡을 단단히 잠근 후, 65 °C 항온수조에서 튜브를 가온합니다.50 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 용해 버퍼(lysis buffer)를 절반 부피만큼 넣고 5분 동안 가열하여 끓입니다. -80 °C 보관소에서 sequel luminal content를 꺼낸 후, 손으로 튜브를 빠르게 문질러 잠시 데운 다음 끓인 용해 버퍼를 튜브에 첨가합니다. 혼합물을 흔들어 용해 버퍼와 SQL luminal content 용액이 균질하게 섞이도록 합니다.용해 완충액과 SQL luminal 내용물을 5분 동안 가열하십시오. 주기적으로 볼텍싱하며 페놀 클로로포름 용액이 들어 있는 Oak Ridge 원심분리 튜브의 밀봉을 풀고, SQL 내용물 용해 시료를 튜브로 옮기십시오. 그다음 캡을 perfil로 다시 밀봉하고, 2분마다 튜브를 흔들어주며 65 °C 온수조에 10분 동안 다시 배치하십시오.샘플을 4°C에서 2,500 ×g로 15분 동안 세척합니다. 이제 흰색 계면이 섞이지 않도록 주의하며 수성층을 새로운 50 mL Oak Ridge 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 새 튜브에 동일한 부피의 산성 페놀 클로로포름을 첨가합니다.Parafilm으로 캡을 밀봉하고, 튜브를 고속으로 볼텍싱하여 내용물을 충분히 혼합합니다. 샘플을 계속해서 원심분리하고 수성층을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상층의 수성층 부피가 너무 작아지면, 더 작은 직경의 튜브로 옮길 수 있습니다.수성 층과 유기 층 사이에 흰색 계면이 더 이상 보이지 않을 때까지 이 과정을 반복하십시오. 흰색 계면이 사라지면, 수성 층을 새로운 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그 다음, 동일한 부피의 chloroform, isoamyl alcohol을 튜브에 추가하고 캡을 밀봉한 후 볼텍싱(vortexing)하여 내용물을 잘 섞어줍니다.다음으로, 샘플을 다시 원심분리한 후 수성층을 15 milliliter 폴리프로필렌 원뿔형 튜브로 옮기고 동일한 부피의 isopropanol을 첨가합니다. 그런 다음 용액을 -20 °C에서 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 샘플 배양 후, 튜브를 45분 동안 원심분리합니다.튜브 바닥에서 겔 형태의 펠릿을 확인한 후, 상층액을 제거합니다. 이제 튜브를 볼텍싱하여 1 mL의 얼음처럼 차가운 70% ethanol로 펠릿을 세척한 다음, 4 °C에서 10,000 ×g로 5분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 마지막으로 상층액을 제거하고 튜브를 뒤집어 펠릿을 실온에서 10분 동안 공기 건조시킵니다.그 다음 RNA 펠릿을 200 µL의 RNase-free water에 재현탁합니다. 먼저, 10x Turbo DNA buffer 20 µL와 Turbo DNase 2 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 37 °C에서 20분 동안 배양한 후, 재현탁된 DNA 불활성화 시약 20 µL를 튜브에 넣고 잘 혼합합니다.이제 튜브를 상온에서 가끔씩 섞어주며 5분 더 배양합니다. 다음으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 10,000 ×g에서 1.5분 동안 원심분리하여 펠렛을 가라앉힌 후, 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 펠렛에 동일 부피의 차가운 acid phenol chloroform을 첨가하고, 1분 동안 볼텍싱하여 용액을 충분히 혼합합니다.용액을 12,500 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 수층을 새 튜브로 옮기고 1부피의 클로로포름-이소아밀알코올을 첨가합니다. 그런 다음 용액을 볼텍싱하여 섞어준 후 동일한 조건에서 다시 원심분리합니다. 수층을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.그 다음 3 M sodium acetate를 0.1 부피만큼 넣고, 얼음처럼 차가운 100% ethanol을 2.5 부피만큼 추가합니다. 튜브를 볼텍싱하여 섞어줍니다. 시료를 -80 °C에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 4°C에서 12,000 ×g로 30분간 원심분리한 후, 상층액을 제거합니다. 마지막으로 1 mL의 얼음처럼 차가운 70% ethanol로 펠렛을 세척합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 10분 동안 공기 건조합니다.그런 다음 펠렛을 100 µL의 RNase-free water에 재현탁합니다. Agilent Bioanalyzer는 DNA, RNA, 단백질 및 세포의 크기 측정, 정량 및 품질 관리를 위한 미세유체 기반 플랫폼으로, RNA 무결성 수치 또는 RIN이라고 알려진 RNA 무결성 지표를 활용합니다. 본 프로토콜로 추출하면 1.7에서 2.0 범위의 260/280 비율과 7.0 이상의 RIN 값을 얻을 수 있습니다.왼쪽에는 박테리아 RNA의 Agilent bioanalyzer 전기영동도 예시가 나와 있으며, 오른쪽에는 마우스 SQL 내용물에서 회수된 pseudomonas arosa의 겔 유사 이미지가 나와 있습니다. 이 절차 이후에는 정밀한 유전자 발현 프로파일링과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 정량적 PCR 또는 RNA 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Morrill, SR, et al. 혐기성 성장 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 항생제 내성 혐기성 박테리아를 사용하여 마우스의 질 집락화를 모델링하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 상피 감수성을 증가시키기 위한 호르몬 치료로 시작하여 혐기성 조건에서 질 접종 및 동시 접종이 이어집니다. 이 절차는 박테리아 집락화 및 생물막 형성을 평가하기 위한 접종 후 샘플링 및 배양으로 마무리됩니다.

혐기성 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델링

출처: Taylor, MN, et.al. 단일 웜 데이터를 사용하여 Caenorhabditis elegans-박테리아 상호 작용의 이질성을 정량화합니다. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 무균, 연령 일치 Caenorhabditis elegans 벌레가 장 집락화를 위해 박테리아 균주에 노출되는 것을 보여줍니다. 부착되지 않은 외부 박테리아를 선택적으로 제거하여 정량화를 위해 장 상피에 부착된 생존 가능한 박테리아만 남기는 것을 설명합니다.

무균 C . elegans에서 장내 세균 집락화 평가

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

wormsorter 형광 기자의 표현에 따라 웜을 정렬하여 예쁜 꼬마 선충의 유전자 화면을 용이하게한다. 여기에서, 우리는 새로운 사용 설명 : GFP - 표현 병원체에 의한 식민지에 따라 정렬을, 우리는 면역 반응을 시작하기에 병원체의 인식의 불완전하게 이해 역할을 조사하기 위해 그것을 사용합니다.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

여기에, 절차는 대장균 K1의 문화와 신생아 쥐에 전신 감염의 설립을 설명합니다. 이것은 비 침습성 절차 맥락총에서 위장관 식민 전신 순환에 병원균의 전위, 및 중추 신경계의 침입을 허용한다.

Neuropathogenic의 비 침습 모델 대장균 신생아 쥐에 감염

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

이 프로토콜에는 요로 감염의 murine 모델에서 단일, 감염 방광 상피 세포를 분리 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

다운스트림 단일 세포 분석에 대 한 요로 감염의 Murine 모델에서 생성 된 단일 세포내 세균성 지역 사회의 절연

여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형  균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

재발성 UPEC UTI를 유도하기 위해 잠복성 세포내 방광 저장소와 G. 질리스에 대한 후속 방광 노출을 확립하는 비뇨병원성 대장균(UPEC) 경요도 접종의 마우스 모델이 입증된다. 또한 박테리아의 열거, 소변 세포학 및 주사 전자 현미경을위한 현장 방광 고정 및 처리가 입증되었습니다.

재발 성 에스케리치아 콜라 이 요로 감염 Gardnerella 질 방광 노출에 의해 유발 마우스에서

이 프로토콜은 비염증 조건에서 pks+ 대장 균 쥐를 정착하는 데 필요한 절차와, 대변 내 pks+ 대장균 확장의 비침습적 확립 및 평가 방법을 설명합니다.

비염증 조건에서 마우스 pks+ 대장균에 의한 정착

배우세요 생쥐 맹장에서 Pseudomonas aeruginosa RNA를 격리하는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 산성 페놀 클로로포름 추출과 다중 용해 단계를 통해 고품질 RNA를 확보하여 qPCR 및 RNA 시퀀싱에 활용할 수 있습니다.

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

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