의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

이 프로시저의 전반적인 목표는 마우스 ECM에서 회수된 Pseudomonas aerogen의 총 RNA를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 장관 내 내용물을 수집한 다음, 박테리아 RNA를 분리함으로써 이루어집니다.

그 후 D'S 처리와 RNA 정제가 수행됩니다. 마지막으로, bioanalyzer와 분광 광도 분석을 통해 RNA를 정량하고 분리물의 순도를 확인합니다. 최종적으로 QPCR, 분석, 전사 프로파일링 또는 RNA 시퀀싱 실험과 같은 후속 실험적 평가에 충분한 품질과 양의 박테리아 RNA를 얻을 수 있습니다.

이 기술이 트라이올 추출과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 고품질 RNA를 확보하기 위해 매우 엄격한 산성 조건에서의 다단계 용해 단계와 클로로포름 추출 단계를 포함한다는 점입니다. 서면 프로토콜은 성공에 필수적인 세부 사항들이 누락되는 경우가 많아 용해 및 추출 단계를 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 절차 시연은 제 연구실의 박사후 연구원인 Eduardo Lopez Medina과 실험실 매니저인 Megan Neubauer가 진행하겠습니다. 수확을 시작하기 전, IMSA는 액체 질소 욕조에서 스테인리스 스틸 막자를 세척합니다.

그 후 *Pseudomonas aerogen*이 군락을 형성한 6~8주령의 C3 HHEN 마우스를 안락사시킨 뒤, 동물을 스티로폼 보드 위에 등으로 누운 자세(supine position)로 놓고 복부에 95% ethanol을 분무합니다. 다음으로, 흉골에서 회음부까지 피부를 따라 정중선 종단 절개를 실시합니다. 그런 다음 피부와 복막을 젖혀 복강을 노출시킵니다.

이제 포셉을 사용하여 맹장 전체를 절제합니다. 스테인리스 스틸 유발 위에 맹장을 잡고 해부 가위로 맹장의 양 끝을 자릅니다. P 1000 피펫 팁에 1 mL의 sequel flush eight buffer를 채운 후, 팁을 맹장의 근위단에 삽입합니다.

sequel flush eight 버퍼와 sequel 루멘 내 내용물을 스테인리스 스틸 유발로 씻어내십시오. 이제 멸균 페스틀을 사용하여 sequel flush eight 내용물을 갈아주십시오.

그런 다음 드라이아이스가 담긴 용기에 에탄올을 붓고, 50 mL 폴리프로필렌 원심 분리 튜브를 드라이아이스-에탄올 배스에 넣습니다. 분쇄된 냉동 회장 내용물을 원심 분리 튜브로 옮기고 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오. 다음 단계들은 이 실험 절차에서 가장 까다로운 부분입니다.

MI 맹장에서 수집된 시료의 복잡한 특성을 고려할 때, 수용성 층과 유기성 층 사이의 넓은 계면이 제거될 때까지 3~5회의 반복적인 냉각 필로폼 추출을 통해 수용액과 유기상 간의 적절한 균질성과 무결성을 확보하는 것이 반드시 필요합니다. 산성 페놀 클로로포름 1부피를 50 mL Oak Ridge 원심분리 튜브에 옮깁니다. 캡을 단단히 잠근 후, 65 °C 항온수조에서 튜브를 가온합니다.

50 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 용해 버퍼(lysis buffer)를 절반 부피만큼 넣고 5분 동안 가열하여 끓입니다. -80 °C 보관소에서 sequel luminal content를 꺼낸 후, 손으로 튜브를 빠르게 문질러 잠시 데운 다음 끓인 용해 버퍼를 튜브에 첨가합니다. 혼합물을 흔들어 용해 버퍼와 SQL luminal content 용액이 균질하게 섞이도록 합니다.

용해 완충액과 SQL luminal 내용물을 5분 동안 가열하십시오. 주기적으로 볼텍싱하며 페놀 클로로포름 용액이 들어 있는 Oak Ridge 원심분리 튜브의 밀봉을 풀고, SQL 내용물 용해 시료를 튜브로 옮기십시오. 그다음 캡을 perfil로 다시 밀봉하고, 2분마다 튜브를 흔들어주며 65 °C 온수조에 10분 동안 다시 배치하십시오.

샘플을 4°C에서 2,500 ×g로 15분 동안 세척합니다. 이제 흰색 계면이 섞이지 않도록 주의하며 수성층을 새로운 50 mL Oak Ridge 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 새 튜브에 동일한 부피의 산성 페놀 클로로포름을 첨가합니다.

Parafilm으로 캡을 밀봉하고, 튜브를 고속으로 볼텍싱하여 내용물을 충분히 혼합합니다. 샘플을 계속해서 원심분리하고 수성층을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 상층의 수성층 부피가 너무 작아지면, 더 작은 직경의 튜브로 옮길 수 있습니다.

수성 층과 유기 층 사이에 흰색 계면이 더 이상 보이지 않을 때까지 이 과정을 반복하십시오. 흰색 계면이 사라지면, 수성 층을 새로운 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 그 다음, 동일한 부피의 chloroform, isoamyl alcohol을 튜브에 추가하고 캡을 밀봉한 후 볼텍싱(vortexing)하여 내용물을 잘 섞어줍니다.

다음으로, 샘플을 다시 원심분리한 후 수성층을 15 milliliter 폴리프로필렌 원뿔형 튜브로 옮기고 동일한 부피의 isopropanol을 첨가합니다. 그런 다음 용액을 -20 °C에서 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 샘플 배양 후, 튜브를 45분 동안 원심분리합니다.

튜브 바닥에서 겔 형태의 펠릿을 확인한 후, 상층액을 제거합니다. 이제 튜브를 볼텍싱하여 1 mL의 얼음처럼 차가운 70% ethanol로 펠릿을 세척한 다음, 4 °C에서 10,000 ×g로 5분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 마지막으로 상층액을 제거하고 튜브를 뒤집어 펠릿을 실온에서 10분 동안 공기 건조시킵니다.

그 다음 RNA 펠릿을 200 µL의 RNase-free water에 재현탁합니다. 먼저, 10x Turbo DNA buffer 20 µL와 Turbo DNase 2 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 용액을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 37 °C에서 20분 동안 배양한 후, 재현탁된 DNA 불활성화 시약 20 µL를 튜브에 넣고 잘 혼합합니다.

이제 튜브를 상온에서 가끔씩 섞어주며 5분 더 배양합니다. 다음으로, 마이크로 원심분리기를 사용하여 10,000 ×g에서 1.5분 동안 원심분리하여 펠렛을 가라앉힌 후, 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 펠렛에 동일 부피의 차가운 acid phenol chloroform을 첨가하고, 1분 동안 볼텍싱하여 용액을 충분히 혼합합니다.

용액을 12,500 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 수층을 새 튜브로 옮기고 1부피의 클로로포름-이소아밀알코올을 첨가합니다. 그런 다음 용액을 볼텍싱하여 섞어준 후 동일한 조건에서 다시 원심분리합니다. 수층을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

그 다음 3 M sodium acetate를 0.1 부피만큼 넣고, 얼음처럼 차가운 100% ethanol을 2.5 부피만큼 추가합니다. 튜브를 볼텍싱하여 섞어줍니다. 시료를 -80 °C에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 4°C에서 12,000 ×g로 30분간 원심분리한 후, 상층액을 제거합니다. 마지막으로 1 mL의 얼음처럼 차가운 70% ethanol로 펠렛을 세척합니다. 상층액을 제거하고 펠렛을 10분 동안 공기 건조합니다.

그런 다음 펠렛을 100 µL의 RNase-free water에 재현탁합니다. Agilent Bioanalyzer는 DNA, RNA, 단백질 및 세포의 크기 측정, 정량 및 품질 관리를 위한 미세유체 기반 플랫폼으로, RNA 무결성 수치 또는 RIN이라고 알려진 RNA 무결성 지표를 활용합니다. 본 프로토콜로 추출하면 1.7에서 2.0 범위의 260/280 비율과 7.0 이상의 RIN 값을 얻을 수 있습니다.

왼쪽에는 박테리아 RNA의 Agilent bioanalyzer 전기영동도 예시가 나와 있으며, 오른쪽에는 마우스 SQL 내용물에서 회수된 pseudomonas arosa의 겔 유사 이미지가 나와 있습니다. 이 절차 이후에는 정밀한 유전자 발현 프로파일링과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 정량적 PCR 또는 RNA 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.