추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

본 프로토콜의 전체적인 목표는 명시야(Brightfield) 생체 내 현미경 및 타임랩스 비디오 촬영을 이용하여, 생체 내(in vivo) 호중구 화학 유인 물질에 반응한 호중구 모집 과정 중 호중구와 혈관 내피 세포 간의 역동적인 상호작용을 연구하는 것입니다. 본 비디오에서는 마우스의 화학 근육 조직에서 호중구의 혈관 내 이동(intraluminal crawling), 혈관 내피세포 통과 이동(T endothelial migration) 및 화학 유성(chemotaxis)을 시각화하고 결정하기 위한 명시야 생체 내 비디오 현미경 사용 절차를 시연합니다. 백혈구 모집은 염증의 전형적인 특징입니다.

이 모집 과정은 혈류 내의 백혈구가 염증 부위의 모세혈관 후 정맥 내피세포 위에서 굴러가기 시작하면서 개시됩니다. 혈관 표면의 케모카인 또는 다른 화학 유인 물질에 반응하여, 이렇게 굴러가던 백혈구들은 내피세포 상에서 정지하고 단단히 부착됩니다. 부착 후, 많은 백혈구들은 내강 표면을 기어다니며 최적의 투과 부위를 찾는 것으로 보입니다.

크롤링 이후 백혈구는 내피세포를 가로질러 이동하며, 이 과정을 T 내피세포 이동(T endothelial migration)이라고 합니다. 그 후 호중구는 염증 부위의 화학 유인 물질 공급원을 향해 혈관 외 조직으로 이동하는데, 이 과정을 화학주성(chemotaxis) MOI라고 합니다. 본 영상에서는 명시야 생체 내 비디오(brightfield intravital video), 현미경 타임랩스 촬영 및 Image J를 사용하여 오마 근육 조직 내 호중구의 혈관 내 크롤링, T 내피세포 이동 및 화학주성 이동을 시각화하고 추적 및 결정하는 실험과 호중구 화학 유인 물질 공급원에 대한 반응을 보여줍니다.

안녕하세요, 서스캐처원 대학교 의과대학 약리학과의 Lis Liu입니다. 오늘은 agro gel에서 neutrophil chemo trant를 만드는 방법과, 생체 내 현미경 관찰(intra vital microscopy)을 위해 생쥐의 근육 조직을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.

MEGJ를 사용하여 세포 이동을 추적하는 방법과 최종적으로 호중구 모집 파라미터를 분석하는 방법을 설명하겠습니다. 저희 실험실의 대학원생 두 명인 ngel Naja, sh, 그리고 Chile가 상세한 실험 절차를 보여드릴 것입니다. 안녕하세요, Naja Sh입니다. 안녕하세요, Chile입니다.

이 실험을 시작하기 위해, 먼저 agro gel 내의 호중구 화학 유인 물질을 준비합니다. 2배 PBS 10 mL를 50 mL 원심분리관에 피펫팅하여 넣습니다. 뜨거운 물이 담긴 비커에 튜브를 넣어 가온합니다. 증류수 10 mL를 피펫팅하여 넣습니다.

다른 50 mL 원추형 튜브에 agarose 분말 0.4g을 넣습니다. PBS 내에 2% agarose 용액을 만들기 위해 혼합물을 전자레인지에서 끓기 시작할 때까지 가열합니다. 따뜻하게 데워진 2x PBS를 agarose 용액 튜브에 추가합니다.

혼합 용액을 소용돌이치듯 흔들어 섞고 온수 비커 내에서 따뜻하게 유지합니다. 1.5 mL 튜브 뚜껑에 화학 유인 물질 용액과 3 µL의 India Ink를 넣고 잘 섞습니다. 이때 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.

200 µL 피펫 팁의 끝부분을 자르고 마이크로 피펫을 준비합니다. 42 °C의 agro solution 110 µL를 뚜껑에 넣고 즉시 잘 섞어줍니다. 다른 피펫 팁을 사용하여 이 화학 유인 물질이 포함된 젤을 사용 전까지 냉장고에 보관합니다. 자일라진과 케타민 혼합물을 IP 주사하여 성체 수컷 마우스를 마취합니다.

우측 외경정맥 상단 부위와 음낭 앞면을 면도합니다. 마취 후 전기면도기를 사용할 때는 마취된 마우스에 특별한 주의와 세심한 관리를 기울이는 것이 중요합니다. 마우스의 저체온증을 방지하기 위해 가열 램프를 사용할 수 있습니다.

마우스가 통증 반응이 없는 상태인지 확인해야 합니다. 수평 절개를 실시하고, 100 units/mL 헤파린 식염수가 채워진 PE 10 튜빙을 사용하여 경정맥을 찾아 카테터를 삽입합니다. 음낭거근과 마우스의 체온을 유지하기 위해 보드를 37 °C 워터 서큘레이터에 연결합니다.

마우스의 뒷다리를 제대 테이프로 고정하여 고환거근 보드 위에 등이 위로 향하게 눕힙니다. 음낭 피부를 절개하여 왼쪽 고환거근을 노출시킵니다. 주변 근막으로부터 근육을 조심스럽게 박리합니다.

37 °C로 데운 중탄산염 완충 식염수로 고환올림근을 충분히 세척합니다. 고환올림근 보드의 투명 관찰 유리 받침대에 고환올림근을 고정하기 위해 원위단에 4.0 봉합사를 묶습니다. 4.0 봉합사와 소작기를 사용하여 고환올림근을 세로 방향으로 소작합니다.

근육을 평평하게 잡고 받침대 가장자리를 따라 고정합니다. 고환과 부고환을 아래쪽 근육에서 분리하여 복강 내로 이동시킵니다. 22 by 22 millimeter 유리 커버슬립의 반대쪽 가장자리에 진공 그리스를 얇게 바릅니다.

그런 다음 노출된 근육을 유리 커버 슬립으로 덮습니다. 마스터 근육 보드를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 현미경으로 근육을 관찰하여 적절한 모세혈관 후 정맥을 찾습니다.

정상적인 전단 속도를 가지고 직경이 25에서 40 µm 사이인 정맥을 선택하십시오. 비디오 카메라를 조정하여 정맥이 TV 모니터의 오른쪽 또는 왼쪽 끝에 수직 방향으로 시각화되도록 합니다. 30분 후, DVD 기록기와 같은 비디오 기록 장치를 사용하여 선택한 모세혈관 후 정맥의 비디오 영상을 기저 대조군 데이터로 기록하십시오.

이것은 모세혈관 후 정맥(post capillary venue)의 기저 대조군 비디오 이미지입니다. 크레마스터 근육(cremaster muscle) 표면에 화학 유인 물질이 포함된 겔을 배치하기 전에, 표면 관류를 중단하고 근육 위의 유리 커버 슬립을 제거하십시오. 이노(einor) 튜브 뚜껑에서 1 cubic millimeter 크기로 화학 유인 물질 포함 겔을 펀칭하여 떼어냅니다. 끝을 자른 200 µL 피펫 팁을 사용하여, 펀칭된 화학 유인 물질 포함 겔을 관찰 중인 모세혈관 후 정맥으로부터 350 µm 떨어진 크레마스터 근육 표면의 사전 선택된 영역에 배치하십시오.

커버 슬립을 덮어 겔을 고정하고, 겔에서 화학 유인 물질이 서서히 방출되어 농도 구배가 형성될 수 있도록 분당 10 µL 이하의 매우 느린 속도로 근육 조직에 초융합(superfuse)합니다. 화학 유인 물질이 포함된 겔을 첨가한 후 90분 동안 비디오 영상을 기록합니다. 기록하는 동안, 혈관 내 및 근육 조직 내에서 부착, 이동, 투과 및 화학 유주를 하는 백혈구에 현미경 초점을 맞추고 유지합니다.

실험 후, 비디오 파일을 컴퓨터로 가져옵니다. 컴퓨터 분석을 위해 비디오를 추출하고 AVI 형식으로 변환합니다. 예를 들어, 무료 컴퓨터 소프트웨어인 bit ripper를 사용하여 DVD 비디오를 AVI 파일로 변환하십시오.

Windows Movie Maker와 같은 동영상 편집 소프트웨어를 사용하여 원본 실시간 영상으로부터 타임랩스 영상을 제작하고, 이를 DV AVI 형식으로 변환하여 저장하십시오. 동일한 현미경 설정 하에서 보정용 마이크로미터의 이미지를 기록하십시오. 기록된 이미지를 컴퓨터로 가져오십시오.

Image J로 이미지를 엽니다. x축과 y축 양방향에서 화면의 크기를 측정하고 마이크로미터당 픽셀 수를 계산합니다. 동영상을 불러오기 위해 Image J를 엽니다. 다시 파일(file)에서 QuickTime movies 플러그인을 사용하여 가져오기(import)를 클릭하고, 분석할 동영상을 선택한 후 QT movie opener 인터페이스에서 확인(okay)을 클릭합니다. 플러그인(plugins)에서 세포 추적을 위해 Manual tracking을 클릭합니다. 추적을 시작하기 전 화면 하단의 필드에 관련 정보를 입력하십시오. 추적 전 다음 매개변수들이 결정되어야 하며, 여기에는 시간이 포함됩니다.

초 단위의 간격은 전체 시간 경과를 30으로 나눈 값이며, xy 보정은 마이크로미터 이미지 보정을 통해 측정된 픽셀당 마이크로미터 값입니다. Z 보정은 0으로 설정하며, 중심 맞추기를 위한 탐색 정사각형 크기는 1로 설정합니다. 녹화된 비디오에서 기준점으로 사용할 안정적이고 명확한 지점을 선택해야 합니다. 이 기준점은 전체 실험 과정 동안 변하지 않고 안정적으로 유지되는 명확하고 작은 구조적 지점이면 무엇이든 가능합니다.

'트랙 추가(add track)'를 클릭하여 첫 번째 프레임부터 마지막 프레임까지 기준점을 추적하십시오. 그다음, 기어다니거나 이동하는 호중구들을 하나씩 클릭하여 추적하십시오. '트랙 추가'를 클릭하여 조직 내에 세포가 나타난 시점부터 각 프레임에서 사라지는 시점까지 세포를 추적하십시오.

그런 다음 클릭 및 추적을 수행하여 완료하고 결과를 Microsoft Excel에 저장합니다. Microsoft Excel에서 결과 파일을 엽니다. 데이터를 분석하기 시작합니다.

분석 시 기준점의 움직임을 고려하는 것이 중요합니다. 호중구 및 루멘 내 크롤링(crawling)을 추적할 때는 호중구와 루멘 내 크롤링 거리 및 크롤링 속도를 결정합니다. 호중구의 내피세포 투과 이동(trans endothelial migration)을 분석할 때는 호중구의 투과 이동 시간과 박리 시간을 측정합니다.

근육 조직 내 중성구 화학성 유인성을 결정할 때, 근육 내 중성구 이동 및 화학성 유인의 거리와 속도를 측정하며, 근육 조직 내 중성구 화학성 유인 과정 중의 화학성 유인 지수를 결정합니다. 화면에 표시된 이러한 매개변수의 정의는 서면 프로토콜에 상세히 설명되어 있습니다. 본 실험에서는 명시야 생체 내 현미경을 사용하여 중성구의 내강 내 크롤링, 내피세포 이동 및 화학성 유인 시의 이동을 시각화하고 결정하는 절차를 시연합니다.

생체 내 호중구 화학유인물질에 대한 반응을 확인하기 위해, MIP-2, CXCL2 또는 합성 펩타이드 W-K-Y-M-V-M이 함유된 아가로즈 겔을 제작하여 마우스 CMA 근육 조직 내 호중구 모집을 유도하였습니다. 본 그림에서 확인할 수 있듯이, 0.5 µM의 MIP-2와 0.1 mM의 W-K-Y-M-V-M은 유사한 속도로 호중구의 혈관 내 크롤링(intraluminal crawling)을 유발하였습니다. 호중구의 혈관내피세포 통과 이동(transendothelial migration) 및 정맥에서의 이탈에 소요된 시간 또한 서로 비슷하였습니다.

이 두 화학 유인 물질 또한 거의 동일한 속도와 유사한 호중구 화학성 유인 지수로 근육 조직 내 호중구 이동 및 화학성 유인을 유도하였습니다. 생체 내 현미경(Intravital microscope)은 호중구 모집 과정을 직접 관찰하고, 각 모집 단계에서 세포와 분자의 기능을 정량적으로 결정하는 데 유용한 도구입니다. 타임랩스 비디오 촬영과 Image J를 이용하면, 선택적 억제제, 형질전환 마우스 및 선택적 화학 유인 물질을 사용하여 명시야 생체 내 현미경 하에서 백혈구의 혈관 내 크롤링, 혈관 내피세포 이동 및 조직 내 화학성 유인 이동을 측정할 수 있습니다.

이 분석 시스템은 백혈구 모집에서 특정 단백질의 기능을 밝히는 데 도움을 줄 수 있습니다.