Name: 추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 배우세요 밝은장 내생체현미경법을 사용하여 마우스 크리마스터 근육에서 호중구의 관강내 기어다니기, 혈관내피 횡단 이동 및 화학주성을 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 염증 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 연구 캐나다 연구소 (CIHR, 걸레 - 86749)에서 연구 부여에 의해 지원되었다. L. 리우 CIHR 새로운 탐정 수상 (MSH - 95374)의 수상자이다.

1. 아가로 오스 겔에 Chemoattractant의 준비 <ol><li> 피펫 10 50 ML 원뿔 튜브 2 × PBS의 ML, 그리고 뜨거운 물이 들어있는 비커에 넣고하여 튜브를 따뜻하게. </li><li> 피펫 10 증류수의 ML 다른 50 - ML 원뿔 관에 0.4 g 아가로 오스 분말을 추가 (약간 느슨하게의 모자)와 혼합 가열 (700 와트 전자렌지에서 ~ 1 분) 전자 레인지에 불과 끓는까지 . </li><li> 아가로 오스 솔루션 튜브, 소용돌이 혼합 용액에 예열이 × PBS를 추가하고 뜨거운 물을 비커에 따뜻하게 유지. </li><li> Micropipette의 chemoattractant 3 μl 인도 잉크를 포함하는 1.5 - ML Eppendorf 튜브의 뚜껑에 솔루션 (예 : CXC의 케모카인 1 ㎜의 WKYMVm의 MIP - 2 또는 12 μl의 0.5 μg의 10 μl)와 (방지 micropipette를 사용 흡인하여 잘 섞는다 공기 방울). </li><li> 뚜껑에 200 μl pipet 팁 및 아가로 오스 솔루션 (42 ° C)의 micropipette 110 μl의 팁 끝을 잘라 즉시 다른 피펫 팁을 (공기 방울을 방지)를 사용하여 잘 섞는다. </li><li> 4에서 chemoattractant 함유 겔을 저장 ° C. </li></ol> 2. Intravital 현미경에 대한 Cremaster 근육의 준비 (그림 1) <ol><li> 10 MG / kg xylazine 200 MG / kg 케타민을 하이드로 클로라이드의 혼합물의 IP 주사하여 성인 남성이 마우스를 마취. </li><li> 오른쪽 외부 경정맥 정맥과 전기 면도기와 음낭의 앞쪽에을 통해 지역을 면도. 마취 후, anesthetized 마우스 특별한 관심과주의를주는 것이 중요합니다. 가열 램프는 저체온증에서 마우스를 방지하기 위해 사용할 수 있습니다. 마우스 통증 반응에서 무료로해야합니다. </li><li> , 수평 절개를 찾아 100 U / ML 헤파린의 식염수에 가득한 PE - 10 튜브를 사용하여 경정맥 정맥을 ...에 카테 테르를 꽂다. 필요한 경우 경정맥 혈관의 Catheterization은 추가 anesthetics 마약의 관리를 위해 필요합니다. </li><li> 마우스가 집에서 만든 cremaster 근육 보드 (그림 1)에 얼굴을 거짓말로 배꼽 테이프와 마우스 뒷다리를 수정. </li><li> cremaster 근육 및 마우스 몸을 따뜻하게 유지하기 위해 37 ° C의 물 순환 장치에 보드를 연결합니다. </li></ol> 참고 : 2.6에서 2.14로 모든 절차가 매우 부드럽게 5 수행해야합니다. <ol start="6"><li> 왼쪽 cremaster 근육을 노출 scrotal 피부에 절개를합니다. 관련 근막에서 근육을 조심스럽게을 해부하다. </li><li> 37과 cremaster 근육을 Superfuse ° C - 예열 연동 펌프를 사용하여 (131.9 NaCl, MM의 4.7 KCl, 1.2 MgSO 4, 20 NaHCO 3,, 산도 7.4) 염분 중탄산염 버퍼. </li><li> cremaster 근육 보드의 명확한보기 유리 받침대에 잡아 cremaster 근육의 말초 끝에 4-0 치료를 묶어. </li><li> 길이 방향 cremaster 근육을 부식. 4-0 봉합사로, 근육 평면을 보유하고 받침대에있는 가장자리를 따라 그것을 확보. 기본 근육의 고환과 epididymis을 분리하여 복강으로 그들을 이동합니다. </li><li> ~ 0.6 37 ° C - 예열 재관류 버퍼와 ML / 분 및 22 노출된 근육 커버 × 22mm 유리 coverslip에있는 근육 Superfuse. </li><li> , 현미경 무대에 cremaster 근육 보드를 놓습니다 현미경 근육을 검사, 적절한 postcapillary venule을 (똑바로 unbranched이며 일반 전단 속도와 25-40 μm의의 직경을 가지고있는 venule 선택) 찾아 비디오 카메라를 조정 venule은 TV 모니터 중 하나를 왼쪽이나 오른쪽 끝에 수직 위치에서 시각 수 있도록합니다. </li><li> 30 분의 평형 후, 비디오 레코더를 사용하여 기본적인 제어 데이터로 5 분 선택한 postcapillary venule의 영상 이미지를 기록합니다. </li><li> superfusion를 중지하고 근육에 coverslip을 제거합니다. </li><li> 350 μm의에서 preselected 영역에 cremaster 근육의 표면에 ~ 1 mm 3 크기 chemoattractant 함유 젤 장소 및 병렬 관찰 postcapillary venule로, 장소에 젤 잡아 coverslip을 추가하고 매우에서 근육 조직을 superfuse 천천히 출시 및 겔의 형성 chemoattractant의 그라디언트의 설립을 허용하는 속도가 느린 속도 (≤ 10 μl / 분). </li><li> chemoattractant 포함된 젤의 추가 90 분 영상 이미지를 기록합니다. 녹음하는 동안, 조정 및 준수에 현미경 초점을 유지, 크롤 링 transmigrating 및 venule 내부와 근육 조직에 leukocytes을 chemotaxing. </li><li> 실험 후, 분석을 위해 컴퓨터에 비디오 파일을 가져옵니다. </li></ol> 3. ImageJ를 사용하여 셀 추적 <ol><li> 컴퓨터에서 추출하여 AVI 포맷 (예, AVI 파일을 DVD 비디오로 변환 무료 컴퓨터 소프트웨어 bitRipper를 사용)에 동영상을 변환합니다. </li><li> 시간 타락한 동영상을 생성하는 비디오 편집 소프트웨어를 사용합니다. 예를 들어, 시간이 타락한 영화 (512분의 1 또는 1천24분의 1 시간 - 경과하기 위해 Windows Movie Maker를 사용하여원래, 실시간 비디오에서 t 30 FPS 속도). 변환 및 DV - AVI 형식으로 압축 시간 타락한 영화를 저장할 수 있습니다. </li><li> 같은 현미경 설정에 따라 교정 마이크로 미터의 이미지를 기록, 컴퓨터에 이미지를 가져오려면, ImageJ로 이미지를 엽니다. ImageJ에서 총 픽셀 화면 (예를 들어, 720 × 480 픽셀)의 왼쪽 상단에 나타납니다. X와 Y의 축 (예 : 200 × 150 μm의) 모두에서 화면의 크기를 측정합니다. 이에서 μm의 당 픽셀 (예를 들어, X = 200분의 720 = 3.6 픽셀 / μm의,와 y = 150분의 480 = 3.2 픽셀 / μm의)의 개수를 계산합니다. </li><li> 동영상을 가져오려면, 오픈 ImageJ 다시, "QT 영화 오프너"의 인터페이스에서 "OK" "파일 - 가져오기를 사용하는 QuickTime 동영상 플러그인 것은"분석하는 동영상을 선택하고를 누릅니다. </li><li> 세포를 추적하는 "플러그인 - 수동 추적"을 클릭하십시오. 시작하기 전에 추적 하단에있는 필드에 해당 정보를 입력합니다. 간단히, <ol><li> 시간 간격 (초)을 = fold-time-lapse/30 (예를 들면, 1020 × 시간 경과가 30분의 1,020 = 34 초 / 프레임 간격 것입니다.) </li><li> X / Y 교정 = 마이크로 미터의 이미지의 보정을 사용하여 μm의 / 픽셀 측정. </li><li> Z 교정 = 0 (마우스 cremaster 근육이 조직 및 세포 크롤링 및 마이 그 레이션의 매우 얇은 층 밝은 필드 transillumination 아래에 약 2 차원뿐입니다 등). </li><li> = 1 중심에 대해 사각형 크기를 검색합니다. </li><li> 도트 크기 / 선 폭 / 글꼴 크기 : 필요한 경우 그들이 조정할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 기준점으로 안정적이고 명확한 지점을 선택합니다. 이 기준점은 모든 실험을하는 동안 변경하고 안정적​​인 남아​​있는 명확하고 작은 구조 지점 수 있습니다. 마지막 프레임에 처음부터 참조 지점을 추적하고 "최종 트랙"을 클릭하여 "트랙 추가 '를 클릭합니다. 데이터는 자동으로 결과를 테이블에 나타납니다. </li><li> neutrophils를 크롤 링하고 마이 그 레이션 트랙을 하나씩 클릭 각 프레임에 그 실종 조직의 모양의 세포를 추적하고 Microsoft Excel에서 결과를 완료하고 저장 "최종 트랙"을 클릭하여 "트랙을 추가." </li></ol> 4. 호중구 채용 매개 변수의 분석 <ol><li> Microsoft Excel에서 결과 파일을 열고 (분석에 기준점의 변화를) 데이터를 분석할 수 있습니다. </li><li> Intraluminal 크롤링 <ol><li> 거리를 크롤링 : 총 거리는 세포가 최적의 윤회 사이트 (μm의)에 초기 자기편 사이트에서 루멘으로 크롤 링합니다. </li><li> 속도를 크롤 링 거리 / 시간 (μm의 / 분) 크롤 링. </li></ol></li><li> Transendothelial 마이 그 레이션 <ol><li> 윤회 시간 : 세포가 전체 세포의 몸이 venule 밖이며 셀 시체가 루멘 (분 또는 초)에서 볼 수 없습니다 때 시간 내피를 통해 윤회하다 시작 시간부터. </li><li> 파견 시간 : 시간에서 전체 셀 몸이 세포가 venule (꼬리 retracts) (분 또는 초)과 접촉을 잃는 경우 시점에 (바로 윤회 후) 그냥 venule 밖입니다. </li></ol></li><li> 조직에 Chemotaxis <ol><li> 마이 그 레이션 거리 : 조직에서 마이 그 레이션의 끝 지점 (μm의)로 시작 시점에서 세포가 이동하는 거리의 합계. </li><li> 마이 그 레이션 속도 : 조직 / 시간에 마이 그 레이션 거리 (μm의 / 분). </li><li> Chemotaxis 거리 : 거리 세포의 합계가 조직의 X - 축 (μm의)에서 마이 그 레이션합니다. </li><li> chemotaxis의 속도 : chemotaxis 거리 / 시간 (μm의 / 분). </li><li> Chemotaxis 지수 : 조직에서 마이 그 레이션 거리로 chemotaxis 거리를 나누어의 비율. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 : bightfield intravital 현미경은 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 연구에 사용되며 neutrophils for 반드시되지 않을 수 있지만, 우리는 조직학 연구에 의해, neutrophil chemoattractant - 대우 cremaster 근육의 고용 세포의 이상 95% 실제로 neutrophils 있었 확인 . 이 보고서에서, 호중구 - 선택 chemoattractants를 사용하여, 우리는 생체내에 neutrophils의 채용을 추적 절차를 제시한다. 특히, 우리는 추적 호중구 intraluminal 크롤링, transendothelial 마이 그 레이션, 그리고 시간 경과 intravital 비디오 현미경과 ImageJ를 사용하여 anesthetized 마우스에 cremaster 근육 조직의 chemotaxis의 프로토콜을 설명합니다. cremaster 근육에 chemoattractant 함유 아가로 오스 겔 천천히 chemoattractant을 출시하고 chemoattractant 그라디언트가 조직 설립 수 있습니다. 호중구의 chemoattractant는 마우스에 cremasteric postcapillary venules에서 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 유도. 전체 실험은 TV 모니터에 컬러 비디오 카메라에 의해 예상과 비디오 레코더에 기록된 영상과 직립 brightfield intravital 현미경 시각이다. 우리는 호중구 결정intraluminal 크롤링, transendothelial 마이 그 레이션 및 마이 그 레이션 및 응답의 근육 조직의 chemotaxis은 chemoattractant MIP - 2를 호중구하고 WKYMVm는 (그림 2) 아가로 오스 겔에서 준비했습니다. 우리는 MIP - 2 (0.5 μm의)와 WKYMVm이 (0.1 MM에서) 거의에서 비교의 시간 길이, 호중구 마이 그 레이션 및 근육 조직의 chemotaxis에 대한 venule에서와 비슷한 속도, 호중구 transendothelial 마이 그 레이션과 분리에서 호중구 intraluminal 크롤 링을 elicited 것을 발견 유사한 호중구의 chemotaxis 인덱스 (P&gt; 0.05, 학생 t 시험)와 같은 속도합니다. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. intravital 현미경 시스템의 개략도 그림. 마우스 cremaster 근육은 현미경 스테이지에 cremaster 근육 보드의 명확한보기 받침대에 exteriorized 37 ° C - 예열 중탄산염 버퍼 식염수에 superfused 있습니다. 직립 현미경 brightfield intravital 현미경에 CCD 컬러 비디오 카메라로 연결됩니다. 흑백 깊은 냉각 CCD 디지털 카메라도 형광 현미경을위한 intravital 현미경 포트에 연결되어, 이미지가있는 직접 컴퓨터에 의해 처리됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> brightfield intravital 현미경의 그림 2. 호중구 모집 매개 변수. 호중구 모집은 아가로 오스 겔 준비 MIP - 2 또는 WKYMVm이 postcapillary venule에 인접한 350 μm의 배치 호중구의 chemoattractant의 점진적 릴리스에 의해 유도되었다. 시간 타락한 비디오 데이터는 실험의 실시간 비디오 녹화를 처리 후 ImageJ에 의해 분석되었다. cremaster 근육 (D)에서 호중구 intraluminal 링 (A), 윤회 시간과 분리 시간 (B), 조직에서 마이 그 레이션 속도와 chemotaxis 속도 (C) 및 chemotaxis 지수는 MIP - 2 또는 WKYMVm 아가로 오스 겔에의 관리 후 결정 C57BL / 6 마​​우스에 cremaster 근육 (N = 3, # 추적 세포의 = 22 일 (A와 B) 및 27 (C와 D)를 각각 MIP - 2, 그리고 = 26 일 (및 B) 44 ( WKYMVm에 대한 각각 C와 D)에서).

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<li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites%3A+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Intravital 현미경은 염증시 백혈구 모집의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히 위해 필수적인 도구입니다. 이러한 cremaster 근육 및 장간막과 같은 transluscent 조직의 microvasculature에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 결정에 대한 양적 시각화의 기법 1.5의 응용 프로그램에 대한 황금 표준 남아 있습니다. 기존 brightfield의 intravital 현미경은 많은 독특한 기술 특징을 가지고 있으며, 이들 조직에서 공개 채용 메커니즘은 생체내 1,2,6 대부분의 조직에 적용됩니다. 그러나, 폐, 간, 뇌 등 다른 조직에서 백혈구 모집의 메커니즘 cremaster 근육과 장간막 1 공개과는 꽤 다른 발견되었습니다. 또한, 형광 현미경은 몇 가지 덜 투명한 조직에서 사용할 수 있습니다. 라이브 세포의 기능에 photodamage 알려져있는 형광 기반의 ...

표 : 재료, 특정 시약 및 장비 <table border="1"><tr><td> 시약 / 장비 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 튜브, PE10 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 427401 </td><td> ID 0.28mm × 0.61mm OD </td></tr><tr><td> 먹물 </td><td> Speed​​ball 예술 </td><td> 슈퍼 블랙 </td><td> 100 % 카본 블랙 안료 - 염료도 없습니다 </td></tr><tr><td> 소작 </td><td> 아론 의료 </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 바이엘 헬스케어, 바이엘 주식 회사 </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민을 하이드로 클로라이드 </td><td> Bioniche 동물 건강 캐나다, 주식 회사 </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Murine 재조합 MIP - 2 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 452 - M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> 피닉스 제약 주식 회사 </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapure </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 </td><td> H - 3393 </td><td></td></tr><tr><td> 직립 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD 컬러 비디오 카메라 </td><td> SONY </td><td> DXC - 990 </td><td></td></tr><tr><td> HD - DVD 비디오 레코더 </td><td> LG 전자 주식 회사 </td><td> RH398H - M </td><td></td></tr><tr><td> TV 모니터 </td><td> LG 전자 주식 회사 </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> 물 순환 장치 </td><td> 써모 과학 </td><td> HAAKE의 DC10 </td><td></td></tr><tr><td> 연동 펌프 </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P - 3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster 근육 보드 </td><td> 서스캐처원 대학 </td><td></td><td> 집에서 만든 </td></tr></table>

추적 호중구 intraluminal 크롤링, intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

혈류에서 염증 조직 leukocytes 순환의 모집은 염증의 1,2의 결정과 복잡한 프로세스입니다. 염증 조직의 postcapillary venules에서 venular 벽 luminal 표면에 처음에는 밧줄과 롤 leukocytes. 내피에 leukocytes 연금을 롤백하고 케모카인 또는 venular 표면에 다른 chemoattractants에 대한 응답으로 확고한 접착력을 받고있다. 많은 자기편 leukocytes이 내피에있는 junctional 넘쳐 흐름 사이트에 부착의 초기 사이트에서 재배치, 프로세스 intraluminal 3를 크롤 링 칭했다. 크롤링 다음, leukocytes는 chemoattractant의 소스 (chemotaxis) 4쪽으로 extravascular 조직에서 내피 (윤회)를 통해 이동하고 마이 그 레이션. Intravital 현미경은 생체내에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용을 시각화하고 백혈구 모집 2,5의 세포 및 분자 메커니즘을 드러내는위한 강력한 도구입니다. 이 보고서에서는, 우리는 호중구 chemoattractant의 경사도에 대응 마우스 cremaster 근육에서 호중구 모집의 세부 프로세스를 시각화하고 결정하는 brightfield intravital 현미경을 사용하는 포괄적인 설명을 제공합니다. 호중구 채용, 호중구 chemoattractant MIP - 2 (CXCL2, CXC의 케모카인) 또는 WKYMVm (TRP - LYS - 티르 - 발 - D - 만났고, 합성 아날로그를 포함한 아가로 오스 겔의 작은 조각 (~ 1 mm 3 크기)를 유도하기 위해 세균성 펩타이드의)는 관찰 postcapillary venule에 인접한 근육 조직에 배치됩니다. 시간 타락한 비디오 촬영 및 컴퓨터 소프트웨어 ImageJ, 내피, 호중구 transendothelial 마이 그 레이션 및 조직에서 마이 그 레이션 및 chemotaxis에 호중구 intraluminal 크롤 링 시각 및 추적과 함께. 이 프로토콜은 intraluminal 크롤링 속도, 윤회 시간, 분리 시간, 마이 그 레이션 속도, chemotaxis 속도와 조직의 chemotaxis 지수 많은 호중구 모집 매개 변수의 신뢰성 및 정량 분석​​이 가능합니다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 이러한 호중구 모집 매개 변수가 안정적으로 결정하고 단세포 운동이 편리 생체내에서 추적할 수있다는 것을 보여준다.

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

혈류로부터 염증 조직으로 순환 백혈구가 모집되는 것은 염증의 중대하고 복잡한 과정입니다1,2. ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 명시야(Brightfield) 생체 내 현미경 및 타임랩스 비디오 촬영을 이용하여, 생체 내(in vivo) 호중구 화학 유인 물질에 반응한 호중구 모집 과정 중 호중구와 혈관 내피 세포 간의 역동적인 상호작용을 연구하는 것입니다. 본 비디오에서는 마우스의 화학 근육 조직에서 호중구의 혈관 내 이동(intraluminal crawling), 혈관 내피세포 통과 이동(T endothelial migration) 및 화학 유성(chemotaxis)을 시각화하고 결정하기 위한 명시야 생체 내 비디오 현미경 사용 절차를 시연합니다. 백혈구 모집은 염증의 전형적인 특징입니다.이 모집 과정은 혈류 내의 백혈구가 염증 부위의 모세혈관 후 정맥 내피세포 위에서 굴러가기 시작하면서 개시됩니다. 혈관 표면의 케모카인 또는 다른 화학 유인 물질에 반응하여, 이렇게 굴러가던 백혈구들은 내피세포 상에서 정지하고 단단히 부착됩니다. 부착 후, 많은 백혈구들은 내강 표면을 기어다니며 최적의 투과 부위를 찾는 것으로 보입니다.크롤링 이후 백혈구는 내피세포를 가로질러 이동하며, 이 과정을 T 내피세포 이동(T endothelial migration)이라고 합니다. 그 후 호중구는 염증 부위의 화학 유인 물질 공급원을 향해 혈관 외 조직으로 이동하는데, 이 과정을 화학주성(chemotaxis) MOI라고 합니다. 본 영상에서는 명시야 생체 내 비디오(brightfield intravital video), 현미경 타임랩스 촬영 및 Image J를 사용하여 오마 근육 조직 내 호중구의 혈관 내 크롤링, T 내피세포 이동 및 화학주성 이동을 시각화하고 추적 및 결정하는 실험과 호중구 화학 유인 물질 공급원에 대한 반응을 보여줍니다.안녕하세요, 서스캐처원 대학교 의과대학 약리학과의 Lis Liu입니다. 오늘은 agro gel에서 neutrophil chemo trant를 만드는 방법과, 생체 내 현미경 관찰(intra vital microscopy)을 위해 생쥐의 근육 조직을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.MEGJ를 사용하여 세포 이동을 추적하는 방법과 최종적으로 호중구 모집 파라미터를 분석하는 방법을 설명하겠습니다. 저희 실험실의 대학원생 두 명인 ngel Naja, sh, 그리고 Chile가 상세한 실험 절차를 보여드릴 것입니다. 안녕하세요, Naja Sh입니다. 안녕하세요, Chile입니다.이 실험을 시작하기 위

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 마우스 노상 강도의 백혈구가 추적 연구 비침습 두 개의 광자 (2P) 현미경의 접근 방식을 설명합니다. 우리는 조직 이미징 준비의 기술적 측면을 논의하고 실행 및 데이터를 수집하도록 설정 초기의 전형적인 실험을 통해 독자를 걸어보세요.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

이 문서는 먼저 제대 정맥 내피 세포로부터 인간을 분리하기위한 절차를 설명하고 유동 조건 하에서 호중구 윤회를 검사하기 위해 이러한 세포를 사용하는 방법을 보여줍니다. 유리의 광학 특성을 가진 고분자로 만들어진 낮은 볼륨 흐름 챔버를 사용하여 희귀 세포 집단의 살아있는 세포 형광 이미징도 가능합니다.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

이 현재 프로토콜은 형광 리포터, 생체 내 라벨링 및 생체 내 이미징 기술을 사용하여 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

여기에서 우리는 화학 전술 보완 C5a 구배를 이미지 마우스 상주 복막 대식세포에 시간 경과, 위상 대조 현미경 검사법을 사용하여 방법을 설명합니다. 프로토콜은 그밖 면역 세포로 확장될 수 있습니다.

마우스 대식세포 화학의 시간 경과 화상 진찰

호중구 이동은 화학 유인 물질 및 세포 외 미세 환경과의 상호 작용에 대한 반응으로 원형질막의 빠르고 지속적인 리모델링에 의존합니다. 본원에서는 마취된 마우스의 귀에 주입된 호중구에서 막 리모델링의 역학을 조사하기 위한 Intravital Subcellular Microscopy에 기초한 절차가 설명됩니다.

생리학적 조건에서 세포하막 리모델링을 조사하기 위해 마우스 피부의 호중구 이동을 이미징합니다.

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 영상 검사는 관절 내 백혈구의 이동 행동을 밝혀냅니다

배우세요 밝은장 내생체현미경법을 사용하여 마우스 크리마스터 근육에서 호중구의 관강내 기어다니기, 혈관내피 횡단 이동 및 화학주성을 실시간으로 시각화하는 방법을. 이 기술은 염증 반응 메커니즘 연구에 활용됩니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

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