Name: GENPLAT : 바이오 매스의 효소 발견과 칵테일 최적화를위한 자동 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 GENPLAT을 이용한 바이오매스 분해 효소 칵테일 최적화 방법입니다. 자동화된 액체 처리 시스템으로 다양한 효소 조합을 테스트하여 발효당 수율을 극대화하고 바이오연료 생산 비용을 절감할 수 있습니다.

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이 작품은 에너지의 미국학과, 기본 에너지 과학 부문의 사무실에서 미국 에너지 대호 Bioenergy 연구 센터 계열 (과학 BER의 DOE 사무소 DE - FC02 - 07ER64494)과 부여 DE - FG02 - 91ER200021에 의해 부분적으로 투자되었다 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences.의 우리는 그들의 자료와 개념적 공헌에 대한 존 스콧 - 크렉과 멜리사 Borrusch 감사드립니다.

1. 효소 생산 <ol><li> 벡터 pPICZ 또는 pPICZα에 해당 유전자의 복제와 P.으로 변환하여 Pichia pastoris에의 단백질을 생산 pastoris. 메탄올 유도와 함께 실패하는 500 ML flasks 300 - ML 배치에서 세포를 성장마다 24 시간 (Banerjee 외., 2010a). </li><li> 집중과 접선 흐름 여과하여 문화 filtrates을 탈염하다. </li><li> -80에서 20 % 글리세롤의 작은 aliquots에있는 효소를 저장 ° C. 농도 범위는 MG / ML 10-10입니다. </li></ol> 2. 실험의 설계 <ol><li> 입력 테스트하는 효소의 수를 그들의 위턱과 아래턱 비율 (핵심 효소 5 %의 낮은 비율을 예), 그리고 디자인 Expertsoftware으로 실험 설계 (예 : 차 또는 입방)의 유형입니다. </li><li> 15 MG / G 글루칸 총 로딩을 추가할 수 각 효소 μg에 금액을 계산하고 다음에 추가 μl 각 효소의 양을 계산각각의 반응. </li><li> 실험 설계 및 Biomek FXP 소프트웨어로 가져오기를 전송 -에서 - 파일 함수를 사용에 따라 물, 효소의 분배에 대한 소스 labware, 소스 우물, 대상 labware, 대상 우물, 그리고 전송 볼륨을 지정 Excel 워크시트를 생성합니다. </li></ol> 3. 효소 가수 분해 <ol><li> 패들 저수지에서 5 μg / ML의 테트라 사이클린과 5 μg / ML cycloheximide를 포함, 50 MM 나트륨 구연산, 산도 4.8의 바이오 매스 슬러리를 일시 중지합니다. </li><li> 96 - 웰 깊은 잘 반응 플레이트의 각 우물에 슬러리의 Robotically pipet 200 μl는 스팬 - 8로 잘라 마지막 0.5 cm로 1000 μl pipet 도움말을 사용합니다. 100 μl / 초 한 번에 슬러리를 혼합하고 패들 저수지에서 동일한 볼륨을 기음하고 접시에 분배. </li><li> 베크 만 FX에 입력된 프로그램을 사용하여 동일한 접시에 효소를 분배. </li><li> pierceable capmats로 번호판을 밀봉합니다. </li><li> 반전과 탭접시는 몇 시간은 표면 장력을 극복하기. 10 RPM의 회전 하이브 리다이 제이션 인큐베이터에서 48 시간 50 ° C에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 4. Glc 및 Xyl의 결정 <ol><li> 스윙 버킷 원심 분리기의 1,250 XG에서 3 분 반응 번호판을 원심 분리기. </li><li> Biomek FX의 AP96 포드를 사용하여 정기적으로 96 - 웰 플레이트로 뜨는 100 μl을 전송합니다. </li><li> 90-95시 번호판을 품어 ° C 효소를 inactivate 후 30 초에 대한 1,250 XG에서 원심을 위해 10 분. </li><li> Glc 측정, 일반 96 - 웰 플레이트에 supernatants 12 μl를 전송합니다. 포도당 산화 효소 / 퍼옥시데이즈 (GOPOD) 시약의 192 μl를 추가합니다. 20 분 50 ° C에서 접시를 부화하고 microplate 리더에서 510 nm의에서 absorbances를 참조하십시오. 공백없이 효소와 반응 혼합물이다. </li><li> Xyl 측정, 384 잘 접시에 4 μl를 전송합니다. 분석 시약을 추가하고 340 nm의에서 접시를 참조하십시오. 공백없이 효소와 반응 혼합물이다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 알려진 Glc하고 원래 바이오 매스의 Xyl 내용에 따라 자신의 % Glc 및 Xyl의 수율로 흡광도 값을 변환합니다. 답변으로 디자인 전문 소프트웨어로 이러한 비율을 가져옵니다. 강력한 모델에 대한 기준이 충족되어 있는지 확인하는 통계 paramenters를 확인합니다. </li><li> 실험적으로 최고의 모델 예측을 확인합니다. </li></ol> 6. GENPLAT와 대표 검색 결과 : (1) 개인 순수한 단백질의 최적화된 혼합물의 창조. 결과는 효소가 중요있는 표시, 그리고 어떤 비율로, 또한 어떤 효소는 중요하지 않습니다. T. 풍부 일부 단백질 이러한 Cip1 및 Cip2로 reesei secretome은 (Nagendran 외., 2009), 암모니아 섬유 확장 (AFEX) 또는 알칼리 hyd에 의해 pretreated 옥수수 여물에서 Glc 릴리스에 역할을하지 나타납니다 로겐, 과산화수소 (AHP) (Banerjee 외., 2010b). 반면에, 일부 단백질이 예기치 않게 중요합니다. 예를 들어, Glycosyl 하이드 롤 레이스 가족 10 11 엔도 - xylanases는 Glc 릴리스 모두 중요하다, 한 xylanase이 다른 (. Banerjee 외, 2010b, C)를 대신할 수 없습니다. Cel61A, T.의 사소한 단백질 reesei secretome 아주 Glc 중요하지만 릴리스 Xyl되지 않습니다. 다른 하나 또는 다른 (Banerjee 외., 2010c)에 필요한 반면 일부 효소는 Glc 및 Xyl 모두 릴리스 중요합니다. 0.94 MG / ML (즉, 비 최적화된 혼합물)의 농도 16 구성 요소 각각을 포함하는 합성 혼합은 AFEX - pretreated DDG에서 사용할 수있는 Glc의 38 %를 발표했다. 동일한 가수 분해 조건 하에서 최적의 혼합이되는 16 구성 요소의 농도가 0퍼센트에서 32 %로였다 (그림 2) Glc의 52 %를 발표했다. 이 실험은 정의 혼합 건설의 유틸리티를 보여줍니다. _content "다른 전처리 / 기판 조합에 최적화된 칵테일&gt; (2) 창조. 현재 상업 cellulase의 준비은"한 - 크기 - 맞는 - 모든 ". 현실에서 최고의 칵테일은 기판과 전처리 모두에 따라 달라집니다. 하나의 제품 Accellerase 1000 같은 방법으로 pretreated 다양한 기판에서 서로 다른 pretreatments (그림 1)에 노출 동일한 기판 다른 수율을 제공 등. 우리는 여러 pretreatments 및 mutiple feedstocks (Banerjee 동부 표준시에 대한 순수한 효소의 혼합물을 최적화하는 GENPLAT를 사용했습니다 알., 2010c). 그림 2는 16 순수한 효소의 최적 효소 비율이 AFEX - pretreated 옥수수 여물, AHP - pretreated 옥수수 여물, 그리고 AFEX - pretreated DDG에 대한 다른 방법을 보여줍니다. 단 11 효소가 그림에 표시됩니다. 2 최적의 이유 나머지 다섯 (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, 그리고 Cel12A)의 비율은 (Banerjee 외., 2010c) 0 %가된다는 것을 발견했다. (3) 소설 효소 발견 T. 이외 버섯의 추출물을 만들었습니다 reesei와 A. 니제르는 다른 기판에 성장. 핵심 세트에 추가하면 하나의 특정 추출물 Glc 수율이 없어졌다. 책임 단백질은 정제과 (Banerjee와 월튼, 발표되지 않은 결과) 상업적 효소 준비에 존재하지 않는 소설 glycosyl 하이드 롤 레이스로 표시되었다. 더 효소 (4) 발견. 의 저하에 대한 효소가 가장 중요 GENPLAT로 표시하는 데특히 바이오 매스, 우리는 효소가 개선 초점되어야하는 더 나은 이해를했습니다. 중요한 효소의 더 나은 예는 자연에서 검색하여 발견되거나 단백질 공학에 의해 만들 수 있습니다. (효소가 원하는 속성에 따라 여러 가지 방법으로 자사의 T. reesei의 상동체보다 "더"가 될 수있다, 예를 들어, 높은 특정 활동, 큰 시너지 효과는 proteolytic 감도, 또는 향상된 열적 안정성을 감소). 순수한 셀룰로스 또는 기타 인공 기판과 결과는 자연 리그노셀룰로오스성에 관련되지 않을 수 있기 때문에 그것이 현실 복잡한 칵테일 (아무 바이오 매스 효소가 격리 작동하지 않기 때문에 중요한) 중요한 현실적인 기판 (활용하기 때문에 GENPLAT는 잠재적으로 더 효소를 시금위한 의미있는 플랫폼을 제공합니다 자료). (5) 상업 효소 최적화. 순수한 효소의 충분히 많은 양의 아직 현실 세계에서 존재하지 않습니다. 그들이 때까지 에탄올 프로ducers는 Accellerase 1000 MultifectXylanase와 같은 상용 제품에 의존해야합니다. 단, 상업 효소의 혼합물은 일반적으로 개인보다 더 나은 수행하고, GENPLAT은 여러 상업 효소의 최적 칵테일을 디자인하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3 네 상업 효소 준비의 혼합물을 최적화할 수 GENPLAT의 사용을 보여줍니다. AFEX - pretreated DDG에서 Glc의 릴리스에 대한 최적의 비율은 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, 그리고 4퍼센트 Multifect Xylanase (Banerjee 외., 2010c)으로 발견되었다. 그림 3B 네 효소 준비와 AFEX - DDG에서 Glc 수율의 차이를 보여줍니다, 최적화된 상업 혼합물은 높은 Glc 수율을 제공 혼자 Accellerase1000보다 SpezymeCP 혼자, 또는 16 요소 합성 혼합물. 이 실험은 또한 16 구성 요소 합성 혼합물은 상업 효소 중 하나 이상에 존재하는 최적의 Glc 릴리스에 필요한 하나 이상의 효소가없는 것을 나타냅니다. GENPLAT 우리 수에드는 구성 요소를 식별합니다. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 하나가 상업 효소 준비는 모든 기판 모든 pretreatments 최적 않습니다. 다섯 기판 세 pretreatments은 (0.5 mm 입자 크기) 연삭 비슷한 조건 하에서 비교했다, 효소로드 (15 MG / G 글루칸) 및 가수 분해 조건 (48 시간, 50 ° C) 다른 AFEX - pretreated 기판. A.의 소화 Accellerase 1000 '와. 옥수수 여물의 B.는 소화 Accellerase 1000'와 세 가지 방법 (Banerjee 외를 참조하십시오., 2010c)에 의해 pretreated. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. AFEX - pretreated 옥수수 여물 (AFEX - CS), 알칼리 수소 과산화물 - pretreated 옥수수 여물 (AHP - CS) 또는 말린 AFEX - pretreated에서 Glc의 릴리스 11 효소의 최적 비율은 증류ERS '곡식 (AFEX - DDG). 데이터 Banerjee 외에서 있습니다. (2010c). 막대의 상단 숫자는 바이오 매스 샘플의 총 Glc의 비율로 Glc의 산출됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. A. AFEX - pretreated DDG에서 Glc의 릴리스에 대한 네 상업 효소 준비의 최적 혼합을 생산 GENPLAT의 사용합니다. Multifect Xylanase의 작은 기여 (4 %)를 만들어 그러므로이 3 원 그림에서 생략되었습니다. 동일한 가수 분해 조건 (15 MG / G 글루칸 효소, 48 H, 50 ° C)에 따라 서로 다른 효소 치료를 AFEX - DDG에서 B. Glc의 수확량이 . "4 - 구성 요소 상업은"그림에 표시된 실험에서 결정된 비율을했다. 3A.

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<li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61%3A+Structure+and+function+of+a+large%2C+enigmatic+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li>
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<li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera%2C+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li>
<li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

그것은 널리 효소의 비용을 절감하는 경제적인 리그노셀룰로오스성 에탄올 산업의 발전에 중요하다는 인식됩니다. 현재 사용 가능한 상용 효소 칵테일은 여​​러 단백질 (Nagendran 외., 2009)의 복잡하고 제대로 정의 혼합물이며, 그들은 주로 산성 - pretreated 옥수수 여물에 사용에 대한 적응입니다. 더 효소 칵테일의 발전을 촉진하기 위해서는 여러 실험실 효소 발견과 특성화에 대한 높은 처리량 플랫폼을 개발했습니다. .; 데커 동부 표준시 로봇 효소 및 바이오 매스 slurries의 분배, 실험의 통계적 설계, 및 / 또는 Glc의 자동 결정 및 Xyl (베를린 외, 2007 :이 영역에서 노력도 GENPLAT에서 찾은 다음 속성 중 하나 이상을 포함해야 알 2009;. 김 외, 1998;. 킹 외, 2009).. GENPLAT는 대부분 6 구성 요소에서 분석할 수있는 효소 혼합물의 복잡 가장 크게, 이러한 이전의 노력을 확장최근 작품 이상의 16 이전 연구 (Banerjee 외., 2010c). 완만한​​은 엔드 오버 엔드 회전에 의해 소화하는 동안 믹싱, 및 GLU와 Xyl의 자동 colorimetric 결정 GENPLAT의 추가 주요 기능은 분배하는 동안 정지 여물의 slurries을 유지할 수 있습니다 비드 혼합 챔버 사용 (패들 저수지)입니다.

사용 장비 및 소프트웨어 : <ol><li> 디자인 전문 소프트웨어, 버전 8.0 (합계 - 용이성, 주식 회사, 미네 아 폴리스, 미네소타) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li> Biomek FXP 실험실 자동화 워크 스테이션 (베크 만 - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, 풀러턴, CA) </li><li> Biomek FXP 소프트웨어, 버전 3.3 (베크 만 - 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, 풀러턴, CA) </li><li> 이그 저수지 (모델 부사장 756C - 1P100, V &amp; P 과학 주식 회사, 샌디에고) </li><li> 접시, 96 - 깊이 (1.5 - ML) 잘 (Abgene, 피셔 과학, 엡손, 영국) </li><li> Pierceable capmats (미국 과학, Ocala, FL) </li><li> 회전 하이브 리다이 제이션 인큐베이터 (모델 5420, VWR) </li><li> 스윙 - 버킷 원심 분리기 (모델 5810R, Eppendorf, 함부르크, 독일) </li><li> 접시, Costar 96 - 웰 (Abgene, 피셔 과학, 엡손, 영국) </li><li> 접시, 384 자 (BD 팔콘, BD Biosciences, 산호세, CA) </li></ol> 시약은 사용 : <ol><li> Pichia pastoris의과 벡터 : 변형 X33, 그리고 pPICZ 및 pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> T. reesei과 벡터 : 스트레인 QM9414 (농업 이용 연구 센터 국립 농업, 피오리아, 일리노이 미국학과) 및 pCB1004 - EV (Banerjee 외, 2010b). </li><li> Accellerase 1000 (많은 번호 1600844643) (Genencor, 주식 회사, 로체스터, NY) </li><li> 50 MM 나트륨 구연산 버퍼, 산도 4.8 </li><li> 테트라 사이클린 재고 : 10 밀리그램 / ML </li><li> Cycloheximide 재고 : 10 밀리그램 / ML </li><li> GOPOD 분석 키트, 카탈로그 K - GLUC (Megazyme, 브레이, 아일랜드) </li><li> 자일로 오스 분석 키트, 카탈로그 K - 자일로 오스 (Megazyme, 브레이, 아일랜드) </li></ol>

genplat : 바이오 매스의 효소 발견과 칵테일 최적화를위한 자동 플랫폼

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

바이오매스 분해를 위한 효소의 높은 비용은 리그노셀룰로오스 원료를 에탄올과 같은 액체 운송 연료로 경제적으로 전환하는 데 있어 주요한 장애물입니다. 본 연구진은 다양한 전처리/바이오매스 조합으로부터 당을 방출시키기 위한 새로운 효소 및 효소 칵테일을 발굴하고 개발하기 위한 GENPLAT이라는 통합 고처리량 플랫폼을 개발하였습니다. GENPLAT은 개별 순수 효소, 실험계획법(DoE)의 통계적 설계, 바이오매스 슬러리와 효소의 로봇 피펫팅, 그리고 방출된 Glc 및 Xyl의 자동 비색 측정이라는 네 가지 요소로 구성됩니다. 개별 효소는 Pichia pastoris 또는 Trichoderma reesei에서의 발현을 통해 생산하거나, 상용 칵테일 또는 새로운 미생물 추출물로부터 크로마토그래피 정제를 통해 생산합니다. 단순 격자(부분 요인) 혼합 모델은 상용 실험계획법 통계 소프트웨어를 사용하여 설계됩니다. 높은 복잡성을 가진 효소 혼합물은 로봇 피펫팅을 이용하여 96-well 포맷으로 구축됩니다. 방출된 Glc 및 Xyl의 측정은 효소 결합 비색 분석법을 사용하여 자동화됩니다. 최대 16가지 성분을 포함하는 최적화된 효소 혼합물이 다양한 원료 및 전처리 조합에 대해 테스트되었습니다.
GENPLAT은 순수 효소 혼합물, 상용 제품 혼합물(예: Accellerase 1000 및 Novozyme 188), 신규 미생물 추출물 또는 이들의 조합에 맞게 조정하여 적용할 수 있습니다. 다음과 같은 혼합물을 제조하고 테스트하려면 &tilde;순수 효소 10종에는 100 미만이 필요합니다. &mu;단백질당 15 mg/g 글루칸의 최종 총 부하량으로 운전할 때, 각 단백질의 양은 g 단위이며 총 반응 횟수는 100회 미만입니다. 당사는 여러 출처의 효소를 사용합니다. 효소는 진균 배양물(예: Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, 그리고 Galerina marginata), 또는 (증가하는 미생물 게놈 서열로부터 확보한) 인코딩 유전자를 다음과 같은 숙주에서 발현시켜 제작할 수 있습니다. E. coli, Pichia pastoris또는 다음과 같은 사상균 T. reesei단백질은 상용 효소 칵테일(예: Multifect Xylanase, Novozyme 188)로부터도 정제할 수 있습니다. glycosyl hydrolase, 세포벽 활성 esterase, protease 및 lyase를 포함하여 점점 더 많은 종류의 순수 효소를 Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), PROZOMIX (www.prozomix.com)와 같은 상업적 공급처에서 구할 수 있습니다.
Design-Expert 소프트웨어(Stat-Ease, Inc.)를 사용하여 심플렉스 격자 설계(simplex-lattice designs)를 생성하고 반응(본 사례의 경우 Glc 및 Xyl 방출)을 분석합니다. 혼합물은 4-20개의 성분을 포함하며, 각 성분의 비율은 0에서 100% 사이에서 변할 수 있습니다. 분석 지점에는 일반적으로 극점(extreme vertices)과 유효한 모델을 생성하기 위한 충분한 수의 중간 지점이 포함됩니다. 실험 설계 용어로, 본 연구의 대부분은 "혼합물(mixture)" 실험으로, 이는 모든 성분의 합이 총 고정 단백질 부하량(mg/g glucan으로 표시)이 됨을 의미합니다. 심플렉스 격자 내의 혼합물 수는 혼합 성분의 수와 다항식의 차수(2차 또는 3차) 모두에 따라 달라집니다. 예를 들어, 6개 성분 실험의 경우 3원 상호작용을 검출할 수 있는 확장 특수 3차 모델(augmented special cubic model)을 사용하면 63개의 개별 반응이 필요하지만, 확장 2차 모델(augmented quadratic model)을 사용하면 23개의 개별 반응만으로 충분합니다. 8개 이상의 성분을 포함하는 혼합물의 경우 2차 실험 설계가 더 실용적이며, 본 연구진의 경험상 이러한 모델은 대개 통계적으로 유효합니다.
모든 효소 부하량은 최종 총 부하량(본 실험에서는 일반적으로 15 mg protein/g glucan)에 대한 백분율로 표시합니다. "핵심(core)" 효소의 경우, 하한선을 5%로 설정합니다. 이 한계치는 핵심 효소가 0%로 존재할 경우 Glc 및/또는 Xyl의 수율이 매우 낮거나 거의 없었다는 당사의 경험을 바탕으로 도출되었습니다. 너무 많은 샘플에서 Glc 또는 Xyl 수율이 매우 낮게 나타나면 모델의 품질이 저하됩니다. 하한선을 설정하면 결과적으로 상한선이 결정됩니다. 즉, 6개 성분 실험에서 각 단일 성분의 하한선을 5%로 설정하면, 각 단일 성분의 상한선은 75%가 됩니다. "보조(accessory)"로 간주되는 다른 모든 효소의 하한선은 0%로 설정합니다. "핵심"과 "보조"는 어느 정도 임의적인 지정이며 기질에 따라 달라지지만, 당사의 연구에서 옥수수대(corn stover)로부터 Glc를 방출하기 위한 핵심 효소는 T. reesei 유래의 다음 효소들로 구성됩니다: CBH1 (Cel7A로도 알려짐), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10) 및 BX (β-xylosidase).
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GENPLAT (GLBRC 효소 플랫폼)는 바이오 매스 열화에 대한 효소 칵테일의 발견과 최적화를위한 자동화 플랫폼입니다. 이것은 여러 feedstocks 및 여러 구성 요소를 포함하는 효소의 혼합물에 적용할 수 있습니다.

GENPLAT : 바이오 매스의 효소 발견과 칵테일 최적화를위한 자동 플랫폼

바이오매스 분해를 위한 효소의 높은 비용은 리그노셀룰로오스 원료를 액체로 경제적으로 전환하는 데 있어 주요한 장애물입니다...

본 절차에서는 A-G-L-B-R-C 효소 플랫폼(또는 gen plat)으로 알려진 자동화 시스템을 사용하여 리그노셀룰로오스 바이오매스를 가용당으로 전환하기 위한 효소 혼합물을 최적화합니다. 먼저, 실험계획법(DoE) 소프트웨어를 사용하여 4개에서 18개의 서로 다른 효소를 최대 96가지의 다양한 비율로 조합하는 혼합 모델을 설계합니다. 그 후, 액체 핸들링 로봇 시스템을 사용하여 바이오매스와 효소를 96 딥웰 플레이트에 분주합니다.플레이트를 밀봉하고 50 °C에서 48시간 동안 배양합니다. 배양 후, 자동 액체 핸들링 시스템을 사용하여 웰의 샘플을 채취하고, 비색 효소 결합 분석법을 사용하여 유리 글루코스와 자일로스를 측정합니다. 그 후 실험 설계 소프트웨어를 사용하여 어떤 효소 조합이 최대의 유리 글루코스와 자일로스를 생성하는지 결정합니다.이 절차의 전반적인 목표는 다양한 효소 칵테일의 효율성을 동시에 테스트하여 리그노셀룰로오스 바이오매스 재료를 에탄올 생산을 위한 발효성 당으로 전환함으로써, 궁극적으로 바이오 연료 생산 비용을 낮추는 것입니다. 본 방법은 주로 알칼리 전처리된 옥수수대(corn stover)의 효소 칵테일을 분석하는 데 사용되지만, 산 처리된 포플러, 스위치그라스 및 건조 증류 폐기물(dried distillers grains)과 같은 모든 원료의 모든 전처리 방식에 적용 가능합니다. 이 기술은 바이오매스 분해에 중요한 새로운 효소를 발견하고, 이미 알려진 효소의 더 나은 사례를 찾는 데 활용될 수 있습니다.gem plat에 사용되는 효소는 다양한 공급원에서 얻을 수 있으나, 본 시연에 사용된 효소는 300 mL 배치의 배플형 500 mL 플라스크에서 3일 동안 Pia Pastis gro 세포에 PPIC 또는 PPIC alpha를 발현시켜 생산하였습니다. 이후 4일 동안, 메탄올 유도 마지막 날 이후 매 24시간마다 메탄올 유도를 수행합니다. 배양액을 농축하고 탈염하기 위해 10 kDa 컷오프 막이 장착된 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 시스템에 샘플을 붓습니다.그 후 여과액을 25 millimolar sodium acetate pH 5로 5배 부피만큼 버퍼 교환하고, 샘플을 농축하여 부피를 10에서 25 milliliters 사이로 맞춥니다. BSA를 표준 물질로 사용하여 BCA법으로 단백질을 측정하며, 효소 스탁 솔루션의 최종 농도는 0.5 to 10 milligrams per milliliter가 되어야 합니다. 심플렉스 격자 설계(simplex lattice designs)를 위해 효소를 20% glycerol에 소분하여 minus 80 degrees Celsius에서 보관합니다.PC에서 Design Expert 프로그램을 실행하여 시작하십시오. 테스트할 효소의 수와 상한 및 하한 비율을 입력합니다. 예를 들어, 핵심 효소의 하한 비율을 5%로 설정한 후, 실험 설계가 2차(quadratic) 또는 3차(cubic)인지 지정하십시오.Excel에서 8개 이상의 성분이 포함된 혼합물의 경우 Quadratic 방식이 필요합니다. 샘플당 g의 글루칸(glucan)당 총 15 mg을 로딩하기 위해 첨가해야 할 각 효소의 양을 µg 단위로 계산하십시오. 그런 다음, 스톡의 단백질 농도를 기준으로 각 반응에 첨가할 각 효소의 양을 µL 단위로 계산하십시오.실험 설계에 따라 물과 효소의 분주를 위해 원본 LabWare 소스 웰, 대상 LabWare, 대상 웰 및 전송 부피를 지정하여 추가 Excel 워크시트를 생성하십시오. 마지막으로, 파일에서 전송(transfer from file) 기능을 사용하여 워크시트를 Biome FX 소프트웨어로 가져와 전처리된 옥수수 스토브 바이오매스 슬러리를 생성하십시오. 건조된 바이오매스를 Wiley 밀에 붓고 0.5 millimeter 스크린을 통과하도록 분쇄하십시오.분쇄된 바이오매스를 비커에 수집합니다. 글루칸 함량은 JoVE 식물 세포벽의 종합적 성분 분석 1부 리그닌에 기술된 표준 방법으로 측정합니다. 글루칸 함량이 결정되면, 최종 글루칸 농도가 0.5%가 되도록 바이오매스를 시트르산 나트륨 완충액과 혼합합니다. 패들 저장조의 전원을 켜고 바이오매스 슬러리를 그 안에 붓습니다.효소들을 얼음 위에 둔 상태에서, 필요한 각 효소의 양은 분주할 바이오매스의 실험 규모에 따라 달라집니다. 면도날을 사용하여 팁 끝부분의 0.5 centimeter를 잘라내어 슬러리용 광구경 팁을 제작합니다. 100 µL 피펫 팁 8개를 준비합니다.트리밍된 span eight 팁은 재사용이 가능합니다. 트리밍 후, SPAN eight에서 자동으로 팁을 흡입할 수 있도록 팁을 피펫 박스에 배치하십시오. 본 기기에는 개별 웰에 개별 용액을 분주할 수 있는 일회용 팁 기능의 SPAN eight 포드와, 96웰 플레이트에 96개의 동일한 용액을 한 번에 옮길 수 있는 고정형 AP 96 포드가 장착되어 있습니다. 그 다음 액체 핸들링 시스템의 데크를 배치하십시오.이는 1개의 96딥웰 반응 플레이트, 물이 담긴 팁 박스 덮개, 1.5 milliliter eend orph 튜브에 담긴 효소가 들어 있는 효소 랙, 그리고 기기 설정에 프로그램된 덱 위치에 배치된 여러 개의 팁 박스로 구성됩니다. 덱 준비가 완료되면 프로그램에 오류가 없는지 확인하십시오. Beckman fx를 시작하십시오.SPAN 8-암(arm)이 먼저 바이오매스 슬러리 200 µL를 96-웰 딥웰 반응 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 그 다음 SPAN 8-포드(pod)가 Biome FX 소프트웨어로 가져온 스프레드시트에 따라 각 웰에 효소를 분주합니다. 분주가 완료되면 덱에서 96-딥웰 플레이트를 제거하십시오.플레이트를 pi 또는 캡 매트로 밀봉하십시오. 그런 다음 플레이트를 뒤집어 한두 번 가볍게 두드려 표면 장력을 제거합니다. 원심분리 배양 후, 플레이트를 하이브리다이제이션 오븐에 48시간 동안 넣어둡니다.플레이트가 회전하는 동안 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 1,500 ×g에서 3분 동안 96-deep well 플레이트를 원심분리합니다. Beckman FX를 프로그래밍하여 AP 96 포드로 각 웰에서 100 µL를 일반 96-well 플레이트로 피펫팅하도록 설정합니다. 원심분리가 끝난 후, 플레이트를 기기에 넣고 피펫팅을 시작합니다.피펫팅이 완료되면, 플레이트 히터를 사용하여 100 °C에서 10분 동안 플레이트를 배양하여 효소를 불활성화한 후, 플레이트를 1,500 ×g에서 30초 동안 원심 분리합니다. GLC 측정을 위해, 먼저 Beckman fx의 AP 96 pod용으로 작성된 프로그램을 사용하여 192 µL의 glucose oxidase peroxidase 시약을 첨가합니다.그 다음 AP 96 포드를 사용하여 12 µL의 샘플을 일반 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 50 °C에서 20분 동안 배양하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정합니다. xlo 측정의 경우, 키트 설명서에 따라 분석 시약을 첨가하십시오.그 후 AP 96 pod를 사용하여 각 웰의 4 µL를 384 웰 플레이트로 옮기고 340 nm에서 흡광도를 측정합니다. Design Expert 소프트웨어를 사용하여 동봉된 문서에 설명된 대로 데이터 분석을 수행합니다. 0.5 mm의 입자 크기 분쇄, glucan g당 15 mg의 효소 투입량 및 가수분해 조건이라는 유사한 조건 하에서 5가지 기질과 3가지 전처리를 비교하였습니다.여기서 볼 수 있듯이 50°C에서 48시간 동안 진행하였습니다. 원료와 전처리 방식 사이에 뚜렷한 차이가 있습니다. 분명히, 효소 칵테일 Accelerates 1000만으로는 전처리와 원료에서 나타나는 모든 변동성을 처리할 수 없습니다.본 실험에서는 A FEX로 전처리된 옥수수 기질(A-F-E-X-C-S), 알칼리 과산화물로 전처리된 옥수수 기질(A-H-P-C-S) 및 A FEX로 전처리된 건조 술지게미(A-F-E-X-D-D-G)를 비교합니다. 막대 그래프 상단의 숫자는 바이오매스 샘플 내 총 글루코스 대비 글루코스 수율을 백분율로 나타낸 것입니다. 전처리 방법과 바이오매스 기질에 따라 칵테일의 구성이 크게 달라진다는 점에 유의하십시오.gem plat의 주된 용도는 순수 효소의 합성 혼합물을 만드는 것이지만, 상용 효소 제제의 최적화된 혼합물을 생산하는 데에도 사용할 수 있습니다. 패널 A는 A-F-E-X-D-D-G로부터 포도당을 방출하기 위해 최적화된 4가지 효소의 도식도를 보여주며, 패널 B는 이 최적화된 혼합물을 사용하여 얻은 수율을 다른 세 가지 효소 제제와 비교하여 보여줍니다. 우리는 개별 순수 효소를 사용하여 바이오매스 분해를 돕는 gen plat의 활용 방법을 입증하였습니다.각 효소는 식물 세포벽을 개별 당으로 완전히 분해하는 데 기여하는 특정 촉매 활성을 가지고 있습니다. 하지만 바이오매스 분해에서 효소의 중요성을 평가하기 위해 해당 효소의 정확한 촉매 활성을 반드시 알 필요는 없습니다. Gen pla를 사용하여 어떤 효소가 중요하고 어떤 비율로 존재하는지 파악하는 것은 바이오프로스펙팅을 안내하는 데 매우 중요합니다.단백질 공학을 위한 새로운 효소와 통합 바이오프로세싱(consolidated bioprocessing) 미생물 개발 과정에서 때로는 놀라운 결과가 나타나기도 합니다. 예를 들어, Conover로부터 포도당을 방출하는 경우, 서로 관련 없는 두 가지 Xin ais의 조합이 각각의 Xin 단독 사용보다 더 우수하다는 것을 발견했습니다. 또한, 건조 증류주 박(dry distiller grain)으로부터 포도당을 방출하는 데에는 더 우수한 manase가 중요하다는 점을 확인했습니다.이 물질은 낮은 효율과 함량을 보이지만, 본 방법은 연구자들이 다양한 조건에 맞는 더욱 우수한 효소 칵테일을 개발할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 특정 단백질의 효소적 기능을 정확히 알지 못하더라도, 리그노셀룰로오스 분해에 대한 해당 단백질의 기여도를 테스트할 수 있습니다.

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 대장균의 표현 metagenomic 도서관에서 cellulolytic 활동에 높은 처리량 화면을 설명합니다. 화면이 솔루션을 기반으로하고 고도의 자​​동화, 그리고 흡광도 측정으로 최종 판독과 384 잘 microplates에 한 냄비 화학을 사용합니다.

Metagenomic 도서관에서 Cellulase 활동 Biomining에 대해 높은 처리량 화면

식물 바이오 매스 샘플을 다수의 당화 잠재력을 결정하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 분석을 위해 자동화된 플랫폼은 96 접시와 잘 풀어 설탕의 전처리, 가수 분해 및 부량의 후속 성능 분석을위한 식물 바이오 매스의 준비를 포함한다.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

이 비디오에서는 불용성 발색 폴리머 하이드로겔 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석을 시연합니다. 효소는 이러한 기질을 용해성 착색 산물로 분해하며, 이는 산물의 색 강도를 측정하여 정량화할 수 있습니다.

발색 고분자 하이드로겔 기반 효소 스크리닝 분석: 합성 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소를 스크리닝하는 고처리량 방법

이 비디오는 불용성 발색 바이오매스 또는 ICB를 사용하여 식물 바이오매스에서 복합 다당류를 분해하는 데 효과적인 효소를 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 효소는 ICB를 가수분해하여 용해성 염료 결합 올리고당을 방출하고 효소 활성은 반응 생성물의 비색 분석으로 평가됩니다.

불용성 발색 바이오매스 기반 효소 스크리닝: 식물 바이오매스 분해 효소의 분해 활성을 평가하기 위한 분석

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

본 연구는 200개 이상의 효소에 이론적으로 적용할 수 있는 보편적인 유전 효소 스크리닝 시스템을 이용한 고처리량 스크리닝 방법을 제시합니다. 여기서 단일 스크리닝 시스템은 사용된 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 간단히 변경하여 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 식별합니다.

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

효소 스크리닝을 위한 고처리량 분석에 대해 설명합니다. 즉시 사용 가능한 이 멀티플렉스 분석 키트는 사전 선택된 Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) 기질과 complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) 기질로 구성됩니다. 표적 효소는 다당류를 분해하는 내효소(endo-enzymes)와 프로테아제(protease)입니다.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

이 원고는 미생물 배양 미디어의 맞춤형 디자인에 대 한 일반적인 접근 방식을 설명합니다. Kriging 기반 실험 설계 및 microbioreactor 기술을 결합 충분 한 재배 처리량, 안정성 및 액체 미디어 처리 속도 높이기 위해 연구소 로봇에 의해 지원 되는 워크플로 반복 하 여 사용이 준비입니다.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

여기서 우리는 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서생합성 효소의 합성 발현을 통해 디테르페노이드 대사산물을 생산하고 정화하기 위한 프로토콜을 쉽게 사용하고 크로마토그라피 생성물을 제시합니다. 정화. 생성된 대사산물은 분자 구조 특성화, 효소 기능성 연구 및 생체 활성 검정을 포함한 다양한 연구에 적합합니다.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

이 프로토콜은 산업 미생물을 위한 표준 고처리량 스크리닝 워크플로우를 제공합니다. 이 과정은 ARTP 돌연변이 유발을 통해 돌연변이 라이브러리를 구축하고, 자동화된 마이크로플루이딕스를 이용한 양성 액상 스크리닝을 수행하며, 이후 결과를 검증하는 과정을 포함합니다. 이 워크플로우의 신뢰성은 고수율 B. coagulans 균주를 스크리닝하여 검증되었습니다.

자동 액상 마이크로플루이딕 플랫폼을 이용한 L-락산을 과생산하는 바실루스 응고 체 돌연변이체의 고처리량 스크리닝

배우세요 GENPLAT을 이용한 바이오매스 분해 효소 칵테일 최적화 방법입니다. 자동화된 액체 처리 시스템으로 다양한 효소 조합을 테스트하여 발효당 수율을 극대화하고 바이오연료 생산 비용을 절감할 수 있습니다.

GENPLAT : 바이오 매스의 효소 발견과 칵테일 최적화를위한 자동 플랫폼

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