엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

본 절차의 전반적인 목표는 인간 B 세포로부터 eps. Epstein-Barr virus 변형 림프아세포 세포주 또는 LCL을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 인간 혈액에서 말초혈액 단핵세포를 분리함으로써 수행됩니다.

다음으로, FK 5 0 6 및 면역억제제가 존재하는 상태에서 세포에 EP Epstein-Barr virus를 감염시킵니다. EP Epstein-Barr virus 감염 3~4일 후, CD 23 high, CD 58 positive로 표시되며 증식할 것으로 예측되는 세포 하위 집단이 나타납니다. CD 23 high, CD 58 positive 세포는 성공적인 결과의 예측 지표로서 유세포 분석법으로 수치를 측정할 수 있습니다. 증식하는 세포는 성공적으로 형질전환된 세포 배양물에서 형성되는 림프모구 세포주 클러스터를 통해 미시적 및 거시적으로 추가 확인이 가능합니다.

마지막 단계는 동결 보존을 위해 림프모구 세포주를 확장하는 것입니다. 저희 실험실에서는 호스트와 Epstein-Barr virus 사이의 상호작용을 이해하기 위해 림프모구 세포주(LCL)를 생성합니다. 림프모구 세포주는 과학계, 특히 바이러스학자, 면역학자 및 암 생물학자들에게도 광범위한 일반적 관심 대상입니다.

du Macintosh 연구실의 박사후 연구원으로서, 림프모구 세포주를 생성하는 절차를 시연하겠습니다. 공여자로부터 혈액 10 milliliters를 채취한 후, 헤파린 처리된 혈액을 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고 1:2로 희석합니다. 튜브에 실온의 PBS 20 milliliters를 첨가하여 희석한 다음, 희석된 혈액 아래에 FICO HIA 림프구 분리 매질 15 milliliters를 층으로 깔아줍니다. 그 후, 농도 구배를 형성하기 위해 실온에서 브레이크 없이 225 ×g로 30분 동안 혈액을 원심 분리합니다.

다음으로, 버피 코트(buffy coat)를 제거하여 새로운 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. PBS를 사용하여 부피를 50 milliliters로 맞춘 후, 600 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킵니다. 상층액을 따라내고 침전물을 50 milliliters의 PBS에 재부유시킨 다음, 동일한 조건으로 세포를 두 번 더 세척합니다.

이제 세포를 1 mL의 완전 RPMI 배지에 다시 현탁하십시오. 세포 5 µL를 취해 Trypan blue로 1:10 희석한 후, 혈구계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정하고, 완전 RPMI 배지를 사용하여 부피를 조절함으로써 세포 농도를 2 × 10⁶ cells/mL로 맞춥니다. 그다음 세포를 25 cm² 조직 배양 플라스크로 옮깁니다.

Epstein-Barr virus 감염을 위해 세포를 준비하려면, 조직 배양 플라스크에 FK 506을 최종 농도 20 $\mu$M이 되도록 첨가하십시오. 그런 다음 플라스크를 37 °C, 5% 이산화탄소 배양기에 넣고 1시간 동안 배양하십시오. 세포 배양이 거의 완료되면, B 95 8 세포에서 수확한 Epstein-Barr virus의 소분량을 빠르게 해동하십시오. 그 후 플라스크를 배양기에서 꺼내고 Epstein-Barr virus를 1:10 희석 비율로 세포에 첨가하십시오. 이제 플라스크를 흔들어 Epstein-Barr virus가 용액에 잘 섞이게 한 다음, 동결 보존을 위한 배양 확장 전까지 2~3주 동안 캡을 닫은 상태로 배양기에 세워서 보관하십시오. 이때 통기성이 없는 플라스크를 사용하는 경우에는 캡을 약간 느슨하게 닫으십시오.

eps, Epstein Barr virus 감염 일주일 후, 초기 현미경 클러스터의 대표 이미지에서 보는 바와 같이 광학 현미경을 통해 세포 클러스터가 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라 현미경 클러스터의 크기가 커지며, LCL의 더 큰 클러스터들이 관찰되는 이 이미지와 같이 플라스크 내에서 거시적으로 덩어리가 보입니다. 12일째에 세포에 배지를 공급하여 배양 플라스크 내 지지 배지의 부피를 두 배로 늘립니다. 보통 일주일에 한 번꼴로 배양 배지가 노란색으로 변하면, 일반적으로 세포를 확장하기 위해 배지를 공급하고 배양 부피를 2~3배로 증가시켜야 할 시점입니다.

완전 RPMI를 사용하여 향후 몇 주 동안 75cm² 플라스크에서 배양액을 70~100mL로 확장하여 냉동 보존용 세포를 생성합니다. 이 산점도에서 보이는 것과 같이 CD 23 및 high CD 58 양성 세포의 존재는 성공적인 결과임을 예측하게 하며, Epstein-Barr virus에 노출된 후 3~4일째에 살아있는 세포의 약 2~3%가 이러한 프로파일을 나타냅니다. Epstein-Barr virus 노출 후 관찰되는 CD 23 양성, CD 23 음성, CD 58 양성 및 CD 58 음성 세포의 다른 하위 집단들은 최소한의 증식만을 보이며, 감염되지 않은 세포나 불멸화되지 않은 Epstein-Barr virus 균주에 감염된 세포는 CD 23 high를 나타내지 않습니다.

CD 58 양성 세포. 이 세포들은 광학 현미경으로도 관찰할 수 있습니다. 앞서 언급했듯이, Epstein-Barr virus 감염 후 일주일 이내에 플라스크 내에서 세포들의 작은 군집이 광학 현미경으로 관찰됩니다.

시간이 경과하여 세포가 LCL로 발달함에 따라 현미경적 클러스터의 크기가 커지며, 플라스크 내에서 덩어리가 거시적으로 관찰됩니다. 좋습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 혈액에서 말초혈액 단핵구를 분리하고, 인간 B 세포로부터 Epstein-Barr virus 변형 림프아세포 세포주를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 림프아세포 세포주의 생성은 다른 연구실에서도 설명된 바 있습니다.

본 프로토콜의 장점은 B 세포에 Epstein-Barr virus를 감염시킨 후 3~4일이라는 이른 시점에 성공적인 결과를 예측할 수 있는 방법을 연구자에게 제공한다는 점입니다.