Name: 엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 학습하세요 인간 B세포에서 Epstein-Barr 바이러스로 변형된 림프모구 세포주를 생성하는 방법을. CD23 high CD58 positive 세포를 조기 식별하여 변형 성공을 3-4일 내에 예측할 수 있습니다.

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이 연구는 NIH 보조금 K08 AI062732, K12 HD001401 및 1UL1RR024139 - 02과 SB - M에 찰스 H. 후드 재단의 아동 건강 연구소 부여에 의해 투자되었다. 와 스토니 브룩 뉴욕 주립 대학의에서 연구 재단.

1. EBV 재고 준비 <ol><li> 멸균 기술을 사용하여 75cm이 조직 문화 플라스크에서 3 × 10 5 세포 / ML에서, 기하 급수적으로 B95 - 8 세포 (13 ATCC # CRL 1612) 성장 Subculture. 전지는 37 0.5 μg / ML에서 각각 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS), 페니실린 / 100U/ml에서 스트렙토 마이신과 100 μg / ML을 포함하는 완전한 RPMI 1640에서 성장하고, Amphotericin B 아르 ° C를 면전에서 5% CO 2. </li><li> 마흔 여덟 시간 후, 1 × 10 6 세포 / ML에서 신선한 완료 RPMI 1640에 resuspend 세포. 바이러스 생산을 유발하기 위해서, 표준 CO 2 배양기에서 1 시간 동안 20ng/ml tetradecanoyl phorbol 아세테이트 (TPA)와 세포를 자극. TPA를 제거하는 RPMI 1640과 세포 세 번 씻으십시오. </li><li> 전체 RPMI 1640의 원래 볼륨 (1.2부터)에 세포를 Resuspend 및 96시간에 대한 CO 2 배양기에서 술병을 배치. 이 방법은 전염성 바이러스 파의 높은 titers을 생산하기 위해 표시되었습니다ticles 6. </li><li> 4 10 분 600 X g에서 원심 ° C 세포에서 EBV - 포함된 문화 뜨는 분리 수 있습니다. 년 이상 -70에서 0.45 - 마이크론 필터, 나누어지는 및 저장 ° C를 통해 필터 뜨는. 대안은 ATCC (VR - 1492)에서 EBV를 포함하는 B95 - 8 세포에서 뜨는을 획득하고 ATCC에서 권장하는 희석에 사용하는 것입니다. </li></ol> 2. 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)의 분리 <ol><li> heparinized 주사기 또는 heparinized 혈액 튜브에 기증자 10 ML 혈액을 그립니다. 50 ML 원뿔 튜브의 상온 20 ML PBS로 혈액을 희석. </li><li> 15 ML Ficoll Hypaque 림프구 분리 매체와 밑받침 희석 혈액. 30 분 동안 상온에서 브레이크없이 225 X g에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 버피 코트와 송금을 제거합니다. PBS로 50 ML에 볼륨을 인상하고 10 분 동안 상온에서 600 XG에 스핀. </li><li> Pou뜨는 해제 R. 50 ML PBS에서 펠렛을 resuspending 10 분 상온에서 600 X g에서 회전하여 세포를 씻으십시오. 비슷한 방식으로 두 번 이상 씻으십시오. </li><li> Resuspend 완료 RPMI 1 ML에서 세포를 씻어. Trypan 파란색으로 10분의 1 희석을 준비하는 세포의 5 μL를 사용하십시오. hemocytometer를 사용하여 라이브 세포를 세어보세요. </li><li> 2 × 10 6 / ML의 세포 농도를 구하는 25cm이 조직 문화 플라스크에 완료 RPMI를 사용하여 볼륨을 조정합니다. </li></ol> 3. EBV로 감염 <ol><li> 2.6 20 NM의 최종 농도로 세포 현탁액에 FK506을 (AG 과학) 추가합니다. 37 CO 2 배양기에 넣어 플라스크 ° 한 시간 만이라도 C. </li><li> 신속 EBV의 나누어지는을 녹여. 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 10분의 1 희석에있는 세포에 EBV를 추가합니다. 일반적으로이 희석은 방어 50-100을 제공합니다. 37 믹스와 CO 2 배양기에서 똑바로 그것을 배치 소용돌이 플라스크 ° C. </li></ol> 참고 일성공적인 결과를 예측 수행 4 단계에서 단계는 선택 사항입니다. 4 단계는 수행할 수있다면, 당신은 통제로이 X 10 6 세포 / ML에서 취소 감염 PBMC의 추가 휴대용 술병을 품어해야합니다. 4. 세포 proliferating 인구 (선택 단계)를 식별 <ol><li> PBS + 5퍼센트 FBS : FACS 버퍼를 준비합니다. 4 저장 ° C. </li><li> 다음과 같은 항체 단계 4.6에서 세포를 얼룩 50 μL 부피 각 혼합합니다. 항체 dilutions는 마우스 IgG (시그마)의 1mg/ml이 항체에 의한 비 특정 바인딩을 억제하기 위해 포함 FACS 버퍼에하여야한다. <ol class="lroman"><li> PE 복합 백신 CD23 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진 </li><li> FITC 복합 백신 CD58 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진 </li><li> PE - Cy5 복합 백신 CD19 항체 (50분의 1 희석)로 단일 얼룩진 </li><li> CD23, CD58, CD19 및 (50분의 1 희석 각)의 트리플 얼룩진 </li><li> PE 복합 isotype 컨트롤과 함께 단일 얼룩진항체가 (안티 CD23 항체와 같은 농도에서) CD23 - PE와 일치 </li><li> (안티 CD58 항체와 같은 농도에서) CD58 - FITC FITC와 일치 복합 isotype 제어 항체와 단일 얼룩진 </li><li> 로 단일 PE - Cy5 묻은 복합 isotype 제어 항체는 일치 CD19 - PE - Cy5 (안티 CD19 항체와 같은 농도에서) </li><li> 세 isotype 제어 항체와 트리플 얼룩. </li></ol> 임시 어둠의 4 ° C에서 믹스를 저장합니다. </li><li> EBV에 3 일이 후 노출에 부드럽게 소용돌이 플라스크는보다 균일한 세포 현탁액을 얻을 수 있습니다. 2ml Eppendorf 튜브에 플라스크에서 2ml를 제거합니다. 3 분 상온에서 3,000 rpm으로 microcentrifuge에 튜브를 돌려. </li><li> 5 X 10월 6일부터 1일까지 X 10 7 세포 / ML에서 FACS 버퍼에 뜨는 및 resuspend 세포를 기음. </li><li> 여덟 50μl 개별 Eppendorf 튜브에 aliquots 또는 96 - 웰 V - 바닥 플레이트를 제거합니다. 스핀 튜브 또는 1,500 X g에서 판3 분. </li><li> 뜨는 및 와동 튜브 / 접시를 폐기하십시오. 각각의 튜브에 Resuspend 세포 / 음 4.2 준비 적절한 항체 dilutions을 포함 FACS 버퍼 50 μL 인치 </li><li> 30 분 어둠 속에서 얼음 튜브 / 플레이트를 품어. 3 분 3,000 rpm으로 원심 분리기 세포는 표면에 뜨는 제거 및 FACS 버퍼 200 μL를 추가합니다. 또 세포를 원심 분리기와 세척을 완료 뜨는 제거합니다. 두 번 더 씻는다를 반복합니다. </li><li> 200 μL FACS에서 Resuspend 세포가 20,000 사건 / 튜브를 취득 흐름 cytometer를 사용하여 데이터를 버퍼와 취득. </li><li> WinMDI를 (PC에서 FACS 데이터 분석을위한 프리웨어)를 사용하여 데이터를 분석할 수 있습니다. 순방향 및 측면 산란 프로파일을 사용하여 라이브 세포 게이트. 그런 다음, 안티 CD19 항체에 일치하는 isotype 제어 항체 물들일 세포와 비교 후 CD19 + (B 세포 마커)의 표현을위한 게이트 살 세포. 플롯 CD19 + B 사는 Y 축에 대한 X 축 및 CD58에 대한 형광 강도에 CD23에 대한 형광 강도와 세포. 결정 CD23 + 및 CD58 + 일치 isotype 제어 항체 물들일 EBV 노출 세포에 비교하여 세포. EBV 노출 문화에 CD23 CD58 + 세포 안녕하세요 (그림 2C)의 존재는 EBV에 감염된 세포 성장 변화의 성공적인 파생물을 예측합니다. 세포 EBV (그림 2A)에 노출 또는 EBV (그림 2B)의 비 immortalizing 변형에 노출되지 않은 경우 반대로, CD23 CD58 + 안녕하세요 전지는 등장하지 않습니다. CD23 안녕 CD58 + 세포가 실험적으로 확산을 받아야 시연 및 이후 LCL (14)을 수립하고 있습니다. </li></ol> 5. LCL의 확장 및 cryopreservation <ol><li> 가벼운 현미경에 의한 세포의 시각화 : EBV 감염 후 일주일함으로써, 세포의 클러스터는 가벼운 현미경으로 볼 수 있습니다. 그림 3은 플라스크에 초기 미세한 클러스터 (그림 3B)의 예를 보여줍니다. </li><li> 시간이 진행되면서 미세한 클러스터는 큰 그러한 것을 대단히 짧은 시간이 표시되는가macroscopically 술병 인치 그림 3C는 가벼운 현미경에 의해 설립된 LCL의 세포의 큰 클러스터를 보여줍니다. </li><li> 세포를 먹이 : 일 12 일 문화 플라스크에 배지의 볼륨을 두 번. 그 후, 전체 RPMI를 사용하여 볼륨을 2-3 배 증가하여 문화를 확장합니다. </li><li> 먹이 세포의 주기성은 세포 성장 속도에 따라 결정되어야합니다. 문화 매체가 노란색 켜면, 일반적으로 위와 같이 미디어를 대체하는 시간이다. 일반적으로이 한번 주당 발생합니다. 그러나, 일부 세포 라인은 더 많거나 적은 빈도로 공급해야 할 수 있습니다. 다음 몇 주 동안 75-100 ML에 문화를 확장합니다. </li><li> Cryopreservation : 세포를 냉동하면 상온에서 10 분 동안 600 X g에서 원심 세포. 1 X 10 7 세포 / ML 90 % FBS를 포함하는 차가운 냉동 미디어와 10 % dimethylsulfoxide에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 액체 질소에 넣어 튜브. </li></ol> 6. 대표 결과 : 성공적인 결과는 CD23 CD58 + 세포 안녕의 존재가 예측됩니다. EBV에 노출된 후 3-4일에 살고 세포의 약 2-3 %가이 프로필 (그림 2C)가한다. 기타 CD23의 하위 인구 +, CD23 - CD58 +, CD58과 - 전지는 EBV에 노출된 후 최소한의 확산 14 보여주 관찰했다. EBV의 비 immortalizing 부담을 품고 HH514 - 16 세포 (그림 2B)에서 EBV에 노출된 취소 감염된 세포 (그림 2A)와 세포는 CD23 CD58 + 세포 안녕을 설명하지 않습니다. 일주일 이내에, 앞서 언급한 EBV 감염 후 플라스크에 세포의 작은 클러스터 조명 현미경 (그림 3B)에서 볼 수 있습니다 : 당신은 또한 성공적인 결과를 모니터링하는 가벼운 현미경으로 세포를 시각화 수 있습니다. 시간 진행과 세포가 LCL로 발전로서 미세한 클러스터는 대단히 짧은 시간은 술병에 macroscopically 볼 수 있습니다 그러한 (3C 그림) 큰됩니다. 그림 1. lymphoblastoid 세포 라인의 생성 및 cryopreservation을위한 워크플로. 주변 혈액 Ficoll 기울기를 통해 centrifuged입니다. 설립 그라디언트의 버피 코트를 입고 PBMC 선물은 EBV의 또한 다음 FK506에 노출되어 있습니다. EBV - 노출된 세포는 37 ° C 수립 이후 cryopreservation에 대한 LCL을 확대하여 5 % CO 2의 존재에 재배하고 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg"> 그림 2. EBV에 노출 후 확산을 받아야 것으로 예상 B 세포의 하위 인구의 식별. 취소 감염된 PBMC (A) 또는 PBMC가 HH514 - 16 세포 (B) 또는 FK506의 존재에 B95 - 8 세포 (C)에서 파생된 EBV에 노출하는 것은 일 3 수확했다. 세포는 CD19, CD23, CD58에 대한 감독 및 fluorochrome - 복합 항체로 얼룩진했다. 라이브 세포에 게이팅 후의, 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B와 C) CD19 + B 세포는 CD23과 CD58의 표현을위한 검사되었습니다. CD23의 CD58와 높은 수준 (CD23 CD58 + 하이)를 표현하는 B 세포의 하위 인구가 그려져 있습니다, 오직 능력 변환 EBV (B95 - 8 세포에서 파생된)에 노출 세포에서 관찰했다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg"> 그림 3. EBV에 감염된 세포에서 세포 클러스터의 시각화. PBMC는 FK506과 치료 및 EBV에 감염되었습니다. 취소 감염 (A)와 EBV 노출 (B) 세포 위상 콘트라스트 현미경 (10X 배율)로 일주 후 감염 검사되었습니다. 다섯 주 오래된 lymphoblastoid 전지 라인은 C로 표시됩니다

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서에서 설명하는 방법은 빠른 불멸화 및 cryopreservation 시간으로 기증자 말초 혈액에서 LCL를 생성합니다. FK506의 사용을 통해, T 세포 면역 반응 억제제를, 그리고 전염성 바이러스의 높은 titers 우리는 주변 혈액 mononuclear 세포에서 EBV에 감염된 B 세포의 증식을 촉진 할 수 있습니다. 이러한 개입은 후속 실험을 위해 세포의 급속한 확대의 결과로, 설명한 방법보다 효율적으로합니다. 전통적으로 성장 변화는 EBV 6 15 노출 후 주일 가벼운 현미경에 의한 세포의 클러스터의 시각화에 의해 감시되었다. 그러나, 세포의 클러스터링은 EBV - 인한 성장 변환의 특정 표시되지 않습니다. 우리는 이전에 삼일 후미 빠르면 성공적인 결과를 결정하기 위해 정확하고 구체적인 방법을 제공 유동세포계측법 14를 통해 proliferating 세포 인구의 지속적인 신분을 증명하고있다EBV에 B 세포의 보틀 노출.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> 피셔 Bioreagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> 시그마 </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청, 열 inactivated </td><td> 시그마 </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque의 림프구 분리 미디어 </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG 과학 </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> 마우스 혈청에서 IgG </td><td> 시그마 </td><td> 전 8765 </td></tr><tr><td> PE에 복합 마우스 안티 - 인간 CD23 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555,711 </td></tr><tr><td> PE에 복합 마우스 isotype IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554,680 </td></tr><tr><td> FITC에 복합 마우스 안티 - 인간 CD58 </td><td> 피어스 써모 SCientific </td><td> MA1 - 82159 </td></tr><tr><td> FITC에 복합 마우스 isotype IgG1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550,616 </td></tr><tr><td> PE - Cy5에 복합 마우스 안티 - 인간 CD19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555,414 </td></tr><tr><td> PE - Cy5에 복합 마우스 isotype IgG1 </td><td> Dako </td><td> X 0,955 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 미디어 </td><td> 시그마 </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl phorbol 아세트산 (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407,952 </td></tr><tr><td> FACS 버퍼 (1X 인산은 식염수 버퍼 + 5% 태아 소 혈청)을 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 lymphoblastoid 전지 라인 구축

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 B 세포의 감염은 체외에서 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL)의 설립에 결과 증식 및 후속 불멸화 발생합니다. LCL은 latently EBV에 감염되므로, 그들은 EBV 지연 및 바이러스 기반의 B 세포 증식과 tumorigenesis 1 조사 모델 시스템을 제공합니다. LCL은 immunologic의 assays 2, 3의 다양한 항원을 제시하는 데 사용되었습니다. 또한, LCL은 인간 단클론 항체 4, 5를 생성하고 기본 생물 학적 물질에 대한 액세스가 6, 7 제한됩니다 잠재적으로 무제한 소스를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 다양한 방법은 LCL을 생성 설명했습니다. 이전 방법은 phytohemagglutinin, lipopolysaccharide 8로 mitogens의 사용을 포함하고, EBV - 중재 불멸화의 효율성을 높이기 위해 mitogen 9 pokeweed있다. 최근 다른 immunosuppr를 사용한같은 시클 로스 포린과 같은 essive 에이전트는 감염된 B 세포 7, 10-12의 T 세포 - 매개 살인을 억제합니다. EBV 감염의 세포 라인 설립 시간의 상당한 길이는 EBV 중심 B 세포의 성장 변환에 대한 더 빠르고, 좀 더 신뢰할 수있는 방법에 대한 요구 사항을 드라이브. 높은 titer EBV와 immunosuppressive 대리인의 조합을 사용하여, 우리는 지속적으로, 감염 변환, 그리고 주변 혈액에서 B 세포의 LCL를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 세포의 체외 클러스터에 감염된 말초 혈액 mononuclear 세포의 작은 금액이 시연 수 있습니다 사용합니다. FK506, 면역 반응 억제제 T 세포의 존재에 EBV와 CD23의 존재. 전통적으로, proliferating B 세포의 가지는 EBV로 감염 후 일주일에 대한 세포의 미세한 클러스터의 시각화에 의해 모니터링됩니다. LCL의 대단히 짧은 시간은 몇 주 후에 육안으로 볼 수 있습니다. 우리는 결정하기 위해 분석을 설명하는 초기 EBV - 중재 g 경우rowth 변환은 세포의 현미경 클러스터가 시연 수 있습니다 전에도 성공이다. CD23의 존재는 하이 CD58 + 세포로 초기 셋처럼 일 후 감염에게 관찰은 성공적인 결과를 나타냅니다.

우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

B 세포의 Epstein-Barr virus (EBV) 감염은 증식과 그에 따른 불멸화를 유도하여 림프아세포양...의 확립으로 이어진다.

본 절차의 전반적인 목표는 인간 B 세포로부터 eps. Epstein-Barr virus 변형 림프아세포 세포주 또는 LCL을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 인간 혈액에서 말초혈액 단핵세포를 분리함으로써 수행됩니다.다음으로, FK 5 0 6 및 면역억제제가 존재하는 상태에서 세포에 EP Epstein-Barr virus를 감염시킵니다. EP Epstein-Barr virus 감염 3~4일 후, CD 23 high, CD 58 positive로 표시되며 증식할 것으로 예측되는 세포 하위 집단이 나타납니다. CD 23 high, CD 58 positive 세포는 성공적인 결과의 예측 지표로서 유세포 분석법으로 수치를 측정할 수 있습니다. 증식하는 세포는 성공적으로 형질전환된 세포 배양물에서 형성되는 림프모구 세포주 클러스터를 통해 미시적 및 거시적으로 추가 확인이 가능합니다.마지막 단계는 동결 보존을 위해 림프모구 세포주를 확장하는 것입니다. 저희 실험실에서는 호스트와 Epstein-Barr virus 사이의 상호작용을 이해하기 위해 림프모구 세포주(LCL)를 생성합니다. 림프모구 세포주는 과학계, 특히 바이러스학자, 면역학자 및 암 생물학자들에게도 광범위한 일반적 관심 대상입니다.du Macintosh 연구실의 박사후 연구원으로서, 림프모구 세포주를 생성하는 절차를 시연하겠습니다. 공여자로부터 혈액 10 milliliters를 채취한 후, 헤파린 처리된 혈액을 50 milliliter 원추형 튜브에 넣고 1:2로 희석합니다. 튜브에 실온의 PBS 20 milliliters를 첨가하여 희석한 다음, 희석된 혈액 아래에 FICO HIA 림프구 분리 매질 15 milliliters를 층으로 깔아줍니다. 그 후, 농도 구배를 형성하기 위해 실온에서 브레이크 없이 225 ×g로 30분 동안 혈액을 원심 분리합니다.다음으로, 버피 코트(buffy coat)를 제거하여 새로운 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. PBS를 사용하여 부피를 50 milliliters로 맞춘 후, 600 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킵니다. 상층액을 따라내고 침전물을 50 milliliters의 PBS에 재부유시킨 다음, 동일한 조건으로 세포를 두 번 더 세척합니다.이제 세포를 1 mL의 완전 RPMI 배지에 다시 현탁하십시오. 세포 5 µL를 취해 Trypan blue로 1:10 희석한 후, 혈구계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정하고, 완전 RPMI 배지를 사용하여 부피를 조절함으로써 세포 농도를 2 × 10⁶ cells/mL로 맞춥니다. 그다음 세포를 25 cm² 조직 배양 플라스크로 옮깁니다.Epstein-Barr virus 감염을 위해 세포를 준비하려면, 조직 배양 플라스크에 FK 506을 최종 농도 20 $\mu$M이 되도록 첨가하십시오. 그런 다음 플라스크를 37 °C, 5% 이산화탄소 배양기에 넣고 1시간 동안 배양하십시오. 세포 배양이 거의 완료되면, B 95 8 세포에서 수확한 Epstein-Barr virus의 소분량을 빠르게 해동하십시오. 그 후 플라스크를 배양기에서 꺼내고 Epstein-Barr virus를 1:10 희석 비율로 세포에 첨가하십시오. 이제 플라스크를 흔들어 Epstein-Barr virus가 용액에 잘 섞이게 한 다음, 동결 보존을 위한 배양 확장 전까지 2~3주 동안 캡을 닫은 상태로 배양기에 세워서 보관하십시오. 이때 통기성이 없는 플라스크를 사용하는 경우에는 캡을 약간 느슨하게 닫으십시오.eps, Epstein Barr virus 감염 일주일 후, 초기 현미경 클러스터의 대표 이미지에서 보는 바와 같이 광학 현미경을 통해 세포 클러스터가 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라 현미경 클러스터의 크기가 커지며, LCL의 더 큰 클러스터들이 관찰되는 이 이미지와 같이 플라스크 내에서 거시적으로 덩어리가 보입니다. 12일째에 세포에 배지를 공급하여 배양 플라스크 내 지지 배지의 부피를 두 배로 늘립니다. 보통 일주일에 한 번꼴로 배양 배지가 노란색으로 변하면, 일반적으로 세포를 확장하기 위해 배지를 공급하고 배양 부피를 2~3배로 증가시켜야 할 시점입니다.완전 RPMI를 사용하여 향후 몇 주 동안 75cm² 플라스크에서 배양액을 70~100mL로 확장하여 냉동 보존용 세포를 생성합니다. 이 산점도에서 보이는 것과 같이 CD 23 및 high CD 58 양성 세포의 존재는 성공적인 결과임을 예측하게 하며, Epstein-Barr virus에 노출된 후 3~4일째에 살아있는 세포의 약 2~3%가 이러한 프로파일을 나타냅니다. Epstein-Barr virus 노출 후 관찰되는 CD 23 양성, CD 23 음성, CD 58 양성 및 CD 58 음성 세포의 다른 하위 집단들은 최소한의 증식만을 보이며, 감염되지 않은 세포나 불멸화되지 않은 Epstein-Barr virus 균주에 감염된 세포는 CD 23 high를 나타내지 않습니다.CD 58 양성 세포. 이 세포들은 광학 현미경으로도 관찰할 수 있습니다. 앞서 언급했듯이, Epstein-Barr virus 감염 후 일주일 이내에 플라스크 내에서 세포들의 작은 군집이 광학 현미경으로 관찰됩니다.시간이 경과하여 세포가 LCL로 발달함에 따라 현미경적 클러스터의 크기가 커지며, 플라스크 내에서 덩어리가 거시적으로 관찰됩니다. 좋습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 혈액에서 말초혈액 단핵구를 분리하고, 인간 B 세포로부터 Epstein-Barr virus 변형 림프아세포 세포주를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 림프아세포 세포주의 생성은 다른 연구실에서도 설명된 바 있습니다.본 프로토콜의 장점은 B 세포에 Epstein-Barr virus를 감염시킨 후 3~4일이라는 이른 시점에 성공적인 결과를 예측할 수 있는 방법을 연구자에게 제공한다는 점입니다.

establishment-epstein-barr-virus-growth-transformed-lymphoblastoid

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

여기가 첫 번째 좋은 생산 관행 (GMP)을 준수하는 탯줄 혈액, 주로 나이브 T 세포의 소스에서 바이러스 특정 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 생산 방법을 설명합니다.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

여기서 엡스타인 바 바이러스에서 내인적으로 발현된 RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 연구하는 데 사용되는 방법은 인간 B-림프구및 근육 생검 유래 위성 세포가 심투로 분화되어 설명된다.

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

이 프로토콜은 phorbol 12-myristate 13-아세테이트로 바이러스 용해 주기를 유도할 때 인간 P3HR1 세포주에서 Epstein-Barr 바이러스 입자의 분리를 허용합니다. 이어서 바이러스 제제에서 DNA를 추출하고 실시간 PCR을 수행하여 바이러스 입자 농도를 정량화합니다.

P3HR1 세포주에서 엡스타인-바 바이러스의 분리 및 정량화

이 비디오에서는 마우스 thymic 림프종 세포 라인을 확립 프로토콜을 보여줍니다. 및 p53의 - / - - thymic 림프종과 생쥐이 프로토콜에 따라, 우리는 성공적으로 여러 ATM - /에서 T - 세포 라인을 설립했습니다.

에서 Thymic 림프종 T - 세포 라인의 유도 ATM - / -</sup과 p53의 - / -</sup 마우스

학습하세요 인간 B세포에서 Epstein-Barr 바이러스로 변형된 림프모구 세포주를 생성하는 방법을. CD23 high CD58 positive 세포를 조기 식별하여 변형 성공을 3-4일 내에 예측할 수 있습니다.

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

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