Name: 포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: 배우세요 생쥐 신생아 뇌에서 올리고덴드로사이트 전구세포를 분리 및 정제하여 성숙한 올리고덴드로사이트로 분화시키는 방법입니다. 배신경절 신경세포와의 공동 배양을 통해 수초 형성 과정을 연구할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 캐나다의 여러 경화증 협회에서 RKRWO을 부여하여 투자했던 것은 캐나다의 여러 경화증 협회에서 학생이기의받는 사람입니다. SDR 건강 연구의 캐나다 캐나다 연구소의 다중 경화증 사회에서 포스트 박사 장학금을받는 사람입니다.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 보고서는 OL - 풍부한 문화 또는 DRGN / OL 공동 문화의 차별 화를위한 murine OPCs를 분리하는 방법을 설명합니다. 혼자 교양 경우, OPCs은 MBP로 차별화 + 곳을 OLs을 막의 시트 myelin 같은 생산. neurite 침대 DRGN에 추가하면, OLs은 MBP로 DRGN의 neurites을 싸다 +하신 막합니다. 이 모델은 OL - 중재 axonal ensheathment를 지배하는 복잡한 토대의 조사를 장점. 큰 가치가 있지만, 그러한 문화의 설립은 기술적 도전이다. 특히, 까다로운 측면 효율적인 조직 소화 / 분리, 균형 문화 미디어 산도의 유지 보수 및 DRGN 미디어 변경 사항을 포함합니다. 소화의 길이가, 조직의 금액은 소화 및 분쇄의 금액은 조직 분리의 효능과 최종 결과에 영향을 받고 있다고 의심하는 것이 중요합니다. 그것은 dissociated 신경계 조직에서 낮은 세포 수율을 얻는 경험 연구원 드문되지 않습니다. 또한, murine OPCs 특히 알칼리성 조건, 문화 미디어의 산도 변화에 민감한 경향이 있습니다. 8.5 %의 CO 2에 문화의 유지 보수 OPCs 더 기본 이상의 약산성 조건을 내버려 표시 있기 때문에, 이것을 방지하는 것을 목표로하고있다. 수유 DRGNs와 관련, 미디어 변경은 뉴런을 마르다하지 최대한 빨리 수행되어야하지만, 개발 neurite 침대를 중단하지로 부드럽게해야합니다. 돌발 미디어 변경은 기판에서 neurite 침대와 coverslip로부터 완전한 분리의 가능성이 결과를 이동시키다 수 있습니다. 이 모델 시스템의 잠재적인 장점은 크게는 기술적으로 까다로운 성격을 overshadows. 이 시스템의 장점 중 하나는 배아 조직을 수확하기 위해 번식 여자를 희생의 필요성을 우회, 세포 배양 유래에 대한 사후 산후 마우스를 사용하는 것입니다. 또 다른 장점은 OPCs의 확장에 대한 성장 요인에 대한 요구의 부족 (GFS)입니다. 혼합 glial 문화 astrocyte - 파생 영양 요인의 존재로 인해 아마도 OPCs의 전파를 지원하는 환경을 제공합니다. 이러한 neurospheres 7,8를 통해 유도와 같은 다른 방법은, 이러한 기본적인 fibroblast의 성장 인자 (bFGF), 표피 성장 인자 (EGF)와 OPC 확장에 대한 혈소판 - 유래 성장 인자 (PDGF)로 GFS의 mitogenic 속성에 의존하고 있습니다. 마찬가지로, 출생 후의 (P5 - 10) DRGNs 위해 마우스를 사용하면 신경 성장 인자 (NGF), 배아 DRGNs 9, 10의 체외 생존에 필요한 neurotrophic 요인과 문화 미디어를 보완의 요구 사항을 방지합니다. 그것은 DRGNs 4 교양 때 부정 OLs의 myelinating 용량에 영향을 미친다으로 NGF를 사용하지 않도록 관심을 것입니다. 의 사용 피하 GF를 보충 대규모 사용할 때 이러한 시약은 비용이 증가함에 따라 미디어 또한, 경제적 이점을하고 있습니다. 아마이 문화 모델의 가장 중요한 이점은 따라서 유전자 변형 마우스 라인의 다양한에서 OPCs 및 DRGNs 모두를 파생하는 기회를 제공, 마우스 전용 티슈로부터 파생됩니다. 이것은 모두 DRGN 및 / 또는 myelination에 적용 OPC 특정 속성의 연구 있습니다. 이것은 axons의 OL - 중재 myelination 규제 수용체 / 리간드 상호 작용을 elucidating 특히 중요한 것입니다. 모두에서는,이 기술은 myelination를 기본 분자 신호를 이해하는 방향으로 애플 리케이션에 의한 신경 과학 연구에 관해 훌륭한 가치입니다.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 제품 이름 </td><td> 회사 </td><td> 제품 번호 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319-005 - CL </td></tr><tr><td> 행크의 밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> 최소 필수 미디어 (멤) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> 폴리 - L - 리신 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 (BSA) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> 인간 merosin 정화 단백질 (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> 재조합 쥐 ciliary neurotrophic 요인 (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L - 티록신 </td><td> Biochemika </td><td> 89,430 </td></tr><tr><td> 홀로그램 트랜스페린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> GIBCO </td><td> 0080085 - SA </td></tr><tr><td> 보빈 인슐린 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5 - Triiodo - L - thyronine </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> 나트륨 Selenite </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5 - 플루오로 - 2&#39; - deoxyuridine (FuDR) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papain 솔루션 </td><td> 워싱턴 </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L - 시스테인 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24 잘 조직 문화 요리 </td><td> Cellstar </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> 환기 캡과 T25 - 조직 문화 flasks </td><td> 코닝 </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10cm 조직 문화 요리 </td><td> 코닝 </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10cm 페트리 접시 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 0,875,713 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 μm의 필터 (옵션) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Myelin 기본 단백질 (MBP) 항체 </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 항체 </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Myelin - 관련 당단백질 (마그) 항체 </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39; - 순환 - 염기 3&#39; - phosphodiesterase (CNP) 항체 </td><td> Covance </td><td> SMI - 91R - 100 </td></tr><tr><td> 굴지 팬 AB - 5 항체 </td><td> 피츠제럴드 </td><td> 10R - A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilament - 200 (NF) 항체 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubulin 베타 - 3 체인 (Tuj1) 항체 </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 토끼 IgG (H + L) 이차 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 555 염소 안티 - 마우스 IgG (H + L) 이차 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 647 염소 안티 쥐 (IgG) (H + L) 이차 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> 염소 항 마우스 IgG (H + L) - HRP 복합 이차 항체 </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> 염소 안티 쥐 IgG (H + L) - HRP 복합 이차 항체 </td><td> 산타크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> 미디어 요리법 100X OL - 보충 * <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 추가 금액 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1.02 g </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> 0.6 MG </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> 161 MG </td></tr><tr><td> 나트륨 Selenite </td><td> 0.05 MG </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5 - Triiodo - L - thyronine </td><td> 4 MG </td></tr></tbody></table> -80시 * 보관 ° C 250 μL aliquots에 t &quot;&gt; OL 미디어 <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 추가 금액 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23.75 ML </td></tr><tr><td> 100X OL - 보충 </td><td> 250 μL </td></tr><tr><td> 보빈 인슐린 (1 MG / ML 주식에서) </td><td> 125 μL </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 250 μL </td></tr><tr><td> 홀로그램 트랜스페린 (33 MG / ML 주식에서) </td><td> 37.5 μL </td></tr><tr><td> B27 보충 </td><td> 500 μL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 μL </td></tr><tr><td> CNTF (50 μL / NG 주식에서) </td><td> 25 μL </td></tr></tbody></table> 혼합 glial 문화 미디어 (DMEM에서 만든) <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> 펜 / Strep (재고의 0.33 %) </td><td> 33 단위 / ML 페니실린 33 μg / ML 스트렙토 마이신 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 1퍼센트 </td></tr></tbody></table> DRGN 미디어 (DMEM에서 만든) <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> 펜 / Strep (재고의 1 %) </td><td> 100 단위 / ML 페니실린과 100 μg / ML 스트렙토 마이신 </td></tr></tbody></table> 소화 솔루션 요리법 : OPC papain 솔루션 (멤에서 만든) <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> Papain 솔루션 </td><td> 1.54 MG / ML </td></tr><tr><td> L - 시스테인 </td><td> 360 μg / ML </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 μg / ML </td></tr></tbody></table> DRG papain 용액 (HBSS에서 만든) <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> Papain </td><td> 1.54 MG / ML </td></tr><tr><td> L - 시스테인 </td><td> 360 μg / ML </td></tr></tbody></table> DRG Collagenase 용액 (HBSS에서 만든) <table border="1"><tbody><tr><td> 성분 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 4 MG / ML </td></tr></tbody></table>

포스트 - 나탈 murine 조직의 공동 문화를 myelinating 풍부한 oligodendrocyte 문화와 oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

OL 개발을 기본 분자 메커니즘을 파악하면 OL 생물학 우리의 지식을 발전에만 중요한 것이 아니라, 또한 여러 경화증 (MS)와 같은 demyelinating 질병의 pathogenesis을 이해하는 데 의미가 있습니다. 세포 개발은 일반적으로 기본 세포 배양 모델 공부입니다. 기본 세포 배양은 생체내에 존재하는 외부 변수의 자유로운 제어 환경을 제공하여 주어진 세포 유형의 평가를 용이하게합니다. 쥐에서 파생된 OL 문화가 OL 생물학에 대한 통찰력의 방대한 양의를 제공하는 동안 마우스의 OL 문화를 확립에 유사한 노력은 주요 장애물을 만났되었습니다. 문화 murine 기본 OLs하는 방법을 개발하는 것은 가능한 유전자 변형 마우스 라인을 활용하기 위해 필수적입니다. 설치류 조직에서 OPCs의 추출을위한 여러 방법 neurosphere의 유도, 차동 부착 정화와 1-3 immunopurification 이르기까지, 설명되었습니다. 많은 방법이 성공을 제공하는 동안, 대부분의 광범위한 문화 시간 및 / 또는 비용이 많이 드는 장비 / 시약을 필요로합니다. 이것을 회피하려면, 원래 맥카시 &amp; 데 Vellis 2 설명한 방법의 적응과 murine 조직에서 OPCs을 정화하는 것이 좋습니다. 이 방법은 신생아 쥐 cortices에서 파생된 혼합 glial 문화 물리적으로 분리 OPCs을 포함한다. 그 결과 OL - 풍부한 문화로 차별화된 수있는 정화 OPC 인구입니다. 이러한 접근 방식으로 인해 자사의 비교적 짧은 문화 시간과 성장 요인이나 immunopanning 항체에 대한 불필요한 요구에 호소합니다. 정화 문화 OL 개발의 메커니즘을 탐구하는 것이 유익하는 동안, 그것은 myelin의 쉬스 형성을 평가하기위한 가장 생리학 관련성이 높은 환경을 제공하지 않습니다. 뉴런과 함께 공동 culturing의 OLs은 axons의 OL - 중재 myelination 규제 분자 토대에 대한 통찰력을 빌려 것입니다. 신경 세포 공동 문화 연구 / OL 많은 경우, 지느러미 루트 신경절의 뉴런 (DRGNs)은 선택의 신경 세포 유형적일 수있다. 그들은 추출, 오염 세포의 최소한, 그리고 짙은 neurite 침대 형성 그들의 용이성으로 인해 OLs 공동 문화에 이상적입니다. xenocultures를 myelinating 쥐를 / 마우스를 사용하는 연구가 출판되었습니다 동안 4-6는 그러한 파생하는 방법은 DRGN / OL 포스트 나탈 murine 조직의 공동 문화를 myelinating 것은 설명되지 않았습니다. 우리가 효과적으로 예상 결과의 예제와 함께, 이러한 문화를 생산하는 방법에 대한 자세한 방법을 제시한다. 이러한 방법은 OL 개발 / myelinating 함수에 관련된 질문을 해결하는 데 유용하고, 유용한 도구는 신경 과학 분야에 있습니다.

이 문서는 성숙 oligodendrocytes (OLs)를 생산하는 차별화 기본 문화에 murine oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 풍부한 인구를 유도하는 방법을 설명합니다. 또한,이 보고서는 생산 기술에 대해 설명합니다 murine 마우스 등의 루트 신경절의 뉴런 (DRGNs)의 neurite 침대에 마우스 OPCs을 심는 공동 문화 myelinating.

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

안녕하세요, 오타와 대학교와 오타와 병원 연구소의 박사 과정 학생인 Ryan O'Mara입니다. 본 프로토콜에서는 마우스로부터 희석된 희소 희돌기아교세포 전구세포(oligodendrocyte precursor cells) 집단을 생산하는 방법을 설명하며, 이를 단독으로 또는 마우스 후근신경절(dorsal root ganglion) 뉴런과 조합하여 분화시켜 수초화 공동 배양(myelinating co-cultures)을 생성할 수 있습니다. 먼저 실험 절차에 대해 간략히 살펴보겠습니다.신생 쥐의 피질을 해리하여 T 25 플라스크에 배양합니다. 9일간의 배양 기간 후, 플라스크 바닥에 성상교세포 단일층이 형성되며 그 위에서 희소돌기아교세포 전구세포가 증식합니다. 이후 희소돌기아교세포 전구세포를 수집 및 정제하며, 농축 배양을 통해 성숙한 희소돌기아교세포로 분화시킬 수 있습니다.수초 형성 공동 배양을 원하는 경우, P5에서 P10 사이 생쥐의 후근신경절 뉴런을 혼합 글리아 배양물과 함께 배양합니다. 9일의 기간 동안 이 뉴런들은 조밀한 신경 돌기 층을 형성하며, 그 위에 희소돌기아교 전구세포를 파종할 수 있습니다.이를 통해 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)가 신경돌기를 감쌀 수 있게 되어, 수초화가 진행되는 저온 배양 상태가 됩니다. 먼저 P0에서 P2 단계 생쥐의 전체 뇌를 얼음처럼 차가운 MEM에 넣고 해부 현미경으로 옮긴 뒤, 메스를 사용하여 각 대뇌 피질의 뇌수막 층을 세로 방향으로 절개합니다. 그런 다음 하부 피질에서 뇌수막을 떼어냅니다. 다음으로, 뇌의 복측이 위로 향하게 한 상태에서 후각구를 제거합니다.피질이 복측 두부에 닿는 부위에 깊게 세로 절개를 가합니다. 뇌의 등쪽이 위를 향하게 한 상태에서 피질을 떼어낸 다음, 각 피질을 약 4조각으로 잘게 자릅니다. 뇌당 350 µL의 ice cold MEM이 들어 있는 15 mL 원추형 튜브로 피질을 옮깁니다.동일한 유전자형의 뇌를 동일한 튜브에 모으는데, 뇌 4개당 1400 µL의 MEM이 필요합니다. 해부가 완료되면, 모은 뇌를 37 °C 항온수조에서 3분간 유지합니다. 그다음, 멸균된 조직 배양 후드 내에서 P 1000 피펫 팁을 이용해 뇌 조각들을 통과시켜 더 작은 조각으로 분쇄합니다.원추형 튜브에 뇌 한 개당 75 µL의 미리 데워둔 OPC Pap pain을 추가합니다. 그다음 37 °C 항온수조에서 20분 동안 배양합니다. 이때 조직의 응집을 방지하기 위해 2분마다 튜브를 뒤집어 줍니다.배양이 완료되면, 뇌당 2 mL의 혼합 글리아 배양액을 소화물에 첨가하고 10분 동안 그대로 둡니다. 10분 후, 조직 현탁액을 5 mL 플라스틱 튜브에 소분합니다.튜브의 수는 준비된 뇌의 개수와 일치해야 합니다. 화염 연마된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 튜브의 내용물을 처음에는 천천히, 이후 조직 조각들이 분리되기 시작하면 강도를 높여 트라이튜레이션(trituration)합니다. 현탁액에 눈에 보이는 조직 덩어리가 남지 않을 때까지 트라이튜레이션을 수행합니다. 각 튜브의 내용물을 4 mL의 혼합 글리아 배양이 들어 있는 50 mL 원추형 튜브에 한데 모읍니다.튜브를 여러 번 가볍게 뒤집어 섞어준 후, 세포 현탁액을 15 milliliter 원뿔형 튜브에 분주합니다. 튜브의 수는 준비된 뇌의 수와 일치해야 합니다. 튜브를 300 ×g에서 5분 동안 원심 분리하고, 펠렛을 1 milliliter의 혼합 글리아 배양 배지에 다시 현탁합니다. 각 원뿔형 튜브에서 재현탁된 세포를 5 milliliter의 혼합 글리아 배양 배지로 미리 평형화한 poly L lysine 코팅 T 25 플라스크에 첨가합니다.플라스크의 수는 적출한 뇌의 수와 동일해야 합니다. 플라스크를 37°C, 8.5% CO2 배양기에서 배양하십시오. 3~4시간 후에는 세포가 기질에 부착되어야 합니다. 하지만 배지 내에 많은 잔해물이 남아 있을 수 있으며, 이는 세포 생존율에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.이를 방지하기 위해, 가능하면 3~4시간 후에 배지를 신선한 혼합 글리아 배양 배지로 교체하십시오. 이 배지 교체 과정을 통해 세포 파편의 상당 부분을 제거할 수 있습니다. 다음 날.플라스크 바닥에 많은 세포가 관찰되어야 합니다. 3일째에는 플라스크 바닥에 성상교세포 단층이 형성되어야 합니다. 이때 배지 4 mL를 제거하고 새로운 배지 4 mL를 다시 첨가하여 배지의 2/3를 교체합니다.이 단계는 3일마다 반복해야 합니다. 6일째가 되면 성상교세포 단층이 뚜렷하게 보이며, 그 위에서 희소돌기아교세포 전구세포가 증식하게 됩니다. 이 시점에 배양액에 인슐린을 최종 농도 5 µg/mL가 되도록 보충하십시오. 9일째가 되면 희소돌기아교세포 전구세포를 성상교세포 단층으로부터 분리할 준비가 된 것입니다.이를 위해 플라스크를 오비탈 셰이커와 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다. 플라스크가 인큐베이터 온도에 적응하도록 1시간 동안 둡니다. 그 후 50 RPM으로 45분 동안 세포를 배양하며 흔들어 줍니다.이 단계에서는 느슨하게 부착된 많은 오염 세포들을 제거합니다. 모든 배지를 제거하고 4 mL의 신선한 배양 배지를 다시 추가하여 전체 배지 교체를 수행하십시오. 플라스크를 5% CO2 배양기에 넣고 3시간 동안 평형을 맞춥니다.3시간이 되었을 때, 배양 배지의 색상을 확인하십시오. 배양 배지가 붉은색을 띠어야 pH가 균형 잡힌 상태임을 나타냅니다. 색상이 주황색이나 보라색에 가깝다면, 그에 맞춰 인큐베이터의 CO2 수치를 조절하십시오.밤새 흔들어 배양하는 동안 희소돌기아교세포 전구세포의 생존을 위해서는 균형 잡힌 pH를 유지하는 것이 중요합니다. 균형 잡힌 pH가 달성되면, 플라스크를 220 RPM으로 약 16시간 동안 흔들어 줍니다. 다음 날 아침, 셰이커에서 플라스크를 꺼내고 플라스크 내의 배지를 10 centimeter 조직 배양 접시로 옮깁니다.이 배양 접시들은 차등 접착법을 통해 희소돌기아교세포 전구세포를 추가로 정제하는 수단으로 사용됩니다. 각 접시에 플라스크 두 개 분량의 배지를 넣고, 5%CO2 조건에서 30분 동안 배양합니다. 15분이 경과했을 때, 희소돌기아교세포 전구세포가 플라스틱에 부착되는 것을 방지하기 위해 각 접시를 가볍게 흔들어 줍니다.30분간 배양한 후, 위상차 현미경으로 디시를 관찰합니다. 희소돌기아교세포 전구세포는 작은 세포 덩어리 형태로 나타납니다. 이 세포들 중 일부는 디시에 부착되었을 수 있습니다.완만한 흔들림을 통해 디쉬에 부착된 희소돌기아교세포 전구세포를 떼어냅니다. 주의하십시오. 과도하게 흔들면 오염된 세포 유형까지 함께 떨어져 나올 수 있습니다.세포 현탁액을 15 Milliliter 원추형 튜브로 옮기고 300 Times gravity에서 5분간 원심분리합니다. P 1000 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 이어서 P 200 피펫 팁을 사용하여 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 정제된 희소돌기아교세포를 라미닌 코팅된 커버슬립 위에 분주하여 1일 차에 농축된 희소돌기아교세포 배양물로 분화시킬 수 있습니다.농축된 희소돌기아교 전구세포는 파종 후 몇 개의 돌기만을 뻗은 비교적 단순한 형태를 보입니다. 3일 차가 되면, 분화 중인 희소돌기아교세포는 미성숙 희소돌기아교세포와 유사하게 수많은 돌기를 뻗게 됩니다. 6일 차까지 희소돌기아교세포는 이 기간 중 어느 시점에서든 수초와 유사한 막성 시트를 형성하여 뻗어 나갑니다.코스 커버슬립은 고정 후 면역세포화학법으로 처리할 수 있습니다. 정제된 희소돌기아교세포 전구세포를 라미닌으로 코팅된 커버슬립에 파종하는 대신, 수초 형성 공동 배양물을 생성하기 위해 배측 신경절 신경돌기 층 위에 파종할 수 있습니다. 다음 섹션에서는 이러한 배양물을 제작하는 방법에 대해 설명합니다.먼저 P5에서 P10 마우스의 척수 전체를 분리하여 해부 가위와 함께 해부 현미경으로 옮깁니다. 척수의 복측 내측 영역을 세로 방향으로 절개합니다. 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 배근신경절(DRG)을 조심스럽게 제거합니다.신경절을 페트리 접시에 담긴 Hank's buffered salt solution으로 옮깁니다. DRG의 과도하게 긴 신경근을 다듬어 줍니다. P 1000 wide boar pipette tip을 사용하십시오.신경절을 1.5 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 모든 마우스의 처리가 완료될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. DRG 분리가 완료되면, 튜브를 약 300 ×g에서 원심분리합니다.튜브를 멸균된 조직 배양 후드로 옮기고 상층액을 제거합니다. 미리 데워둔 DRG papine 500 µL를 튜브에 넣고 37 °C 항온수조에서 10분 동안 배양합니다. papine 소화가 완료되면 원심분리한 후 Papine 용액을 교체합니다.예열된 collagenase a 용액 500 µL를 넣고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다. 원심분리 단계를 반복하고 collagenase A 용액을 1 mL의 DRGN 배양 배지로 교체합니다. 마지막 원심분리 단계 후에 DRGN 배지 1 mL를 추가하고 화염 멸균한 유리 파스퇴르 피펫으로 옮깁니다.처음에는 신경절을 천천히 으깨고, 조직이 분리되기 시작하면 강도를 높여 가며 으깹니다. 더 이상 조직 덩어리가 보이지 않으면, 세포 현탁액을 7 mL의 DRGN 배지가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다. 해당 접시를 37 °C 인큐베이터에서 8.5% CO2 조건으로 1시간 15분 동안 배양합니다.배양 후 페트리 접시를 관찰합니다. 위상차 현미경 하에서 DRG 뉴런은 세포체가 큰 세포로 확인됩니다. 많은 오염 세포들은 페트리 접시에 단단히 부착되어 있어야 합니다.배지를 15 milliliter 원심분리관으로 옮기고, 배양 접시를 4 milliliters의 DRGN 배지로 헹구어 남아 있는 뉴런을 모두 수집합니다. 원심분리관을 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 생성된 펠렛을 500 microliters의 DRGN 배지로 재부유시킵니다.HEO 사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. DRG 뉴런만을 계산하여 1 mL의 DRGN 배양액 내에서 12 mm 라미네이트 코팅 커버슬립당 30,000에서 50,000개의 뉴런이 분주되도록 합니다. 세포를 8.5% CO2 조직 배양 인큐베이터에서 배양합니다.다음 날 아침, DRGN 배지를 10 µM FUD R이 보충된 OL 배지로 교체하여 전체 배지 교환을 수행하고, 이후 이틀마다 이를 반복합니다. 그 후, FUD r이 보충된 OL 배지로 배지의 4분의 3을 교체합니다. 1일 차에 위상차 현미경으로 관찰하면 뉴런이 몇 개의 돌기를 뻗기 시작한 것을 확인할 수 있습니다. 3일 차가 되면 뉴런 돌기의 길이가 길어집니다.6일 차가 되면, 서로 뒤섞인 많은 돌기들로 구성된 신경돌기 층(neurite bed)이 형성됩니다. 9일 차에는 이 신경돌기 층의 밀도가 증가하며, 혼합 뇌 배양물을 성장시켜 희소돌기아교세포를 수용할 준비가 됩니다. 뉴런 배양과 병행하여, 뉴런 배양 9일 차에 희소돌기아교세포 전구세포를 정제할 수 있습니다.그 후 이 세포들을 뉴라이트 층 위에 안착시킬 수 있습니다. 24웰 플레이트의 각 웰에 50,000 cells를 첨가합니다. 공동 배양 6일 차가 되면, 희소돌기아교세포와 유사한 세포들이 DRG 뉴런과 상호작용하는 것을 관찰할 수 있습니다.이제 이 배양물들을 고정하여 면역세포화학 분석을 진행할 수 있습니다. 농축된 희소돌기아교세포 배양물을 희소돌기아교세포 마커인 NG2, MAG 및 MBP에 대한 항체로 라벨링하면, 면역학적 양성 세포들이 단계별 특이적 형태를 나타내는 것을 확인할 수 있습니다. 이 배양물들은 NG2 양성 희소돌기아교세포 전구세포 집단에서 시작하여, 6일간의 분화 과정을 거쳐 MAG 양성 성숙 희소돌기아교세포를 생성합니다.희소돌기아교세포가 풍부한 배양물에서 얻은 용해물에 대해 SDS page를 수행하면, 6일의 시간 경과에 따라 희소돌기아교세포가 CNPP 및 MVP를 발현하는 것을 확인할 수 있습니다. 희소돌기아교세포를 추가하기 전의 DRG 뉴런을 살펴보면, 9일차에 조밀한 Taj one 및 뉴로필라멘트 양성 신경돌기 층이 나타납니다. 희소돌기아교세포와 DRG 뉴런의 공동 배양 6일차에 고배율로 관찰하면, 많은 MBP 양성 희소돌기아교세포가 뉴런의 신경돌기와 상호작용하는 것을 볼 수 있습니다.희소돌기아교세포가 수초화와 유사하게 MBP 양성 막으로 이러한 신경돌기를 감싸는 것이 관찰됩니다. 디지털 확대 영상은 neurofilament 양성 돌기 위에 MBP 양성 막이 겹쳐진 범위를 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 오타와 병원 연구소의 박사후 연구원 Scott Ryan입니다. 이 기법들은 생쥐로부터 희소돌기아교세포와 DRG 뉴런 공배양 시스템을 구축하는 방법을 제공합니다.이 기술은 실험적으로 유도된 모델과 형질전환 모델 모두에서 탈수초성 질환을 연구하는 데 유용합니다. 또한 새로운 치료 화합물을 스크리닝하는 데에도 효과적입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해...

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

이 비디오는 성체 쥐의 뇌에서 외측 심실 벽을 분리하고 효소 조직 해리를 수행하여 단일 세포를 얻기 위한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 그런 다음 이러한 세포는 신경 줄기 세포의 증식을 선택적으로 강화하고 희소돌기아교세포와 성상세포의 공동 배양으로의 분화를 촉진하는 특정 배양 조건에 적용됩니다.

성체 마우스 신경 줄기세포에서 혼합 희소돌기아교세포와 성상교세포 배양 획득

이 동영상은 인간 배아 줄기 세포에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 생성한 후 OPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 과정을 보여줍니다. 이러한 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 생성하는 과정은 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질환의 연구와 치료를 개선할 수 있는 수많은 길을 열어줍니다.

인간 배아 줄기 세포를 희소돌기아교세포로 분화

이 비디오는 인간 유도 뉴런(iN)과 유도 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양 확립을 보여줍니다. iNm은 공동 배양에서 iOPC와 혼합된 다음 두 iNm이 뉴런으로, iOPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지원하기 위해 배양됩니다. 뉴런은 다른 뉴런 및 희소돌기아교세포와 시냅스 연결을 형성하는 반면, 희소돌기아교세포는 뉴런의 축삭돌기 주위에 수초를 발달시킵니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용을 모델링하는 공동 배양 방법

이 비디오는 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 희소돌기아교세포로 분화하고 배근신경절(DRG) 뉴런과 공동 배양에서 수초화를 유도하는 프로토콜을 보여줍니다. OPC는 수초화를 조절하는 신호 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질전환됩니다. 형질도입된 OPC는 DRG 뉴런과 공동 배양되어 희소돌기아교세포로의 분화 및 신호 단백질 유도 수초화를 평가합니다.

희소돌기아교세포 전구세포에 대한 체외 형질도입 유도 수초화 분석

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

우리는 성숙한 올리고드로시테스로 분화하는 태아 또는 성인 신경 줄기 세포에서 유래한 성상세포및 올리고드엔드로시테 전구세포의 혼합 배양, 유해자극의 시험관내 모델링을 설명한다. 셀 기반 고함량 선별 기술과 결합은 신뢰할 수 있고 견고한 약물 선별 시스템을 구축합니다.

태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양

배우세요 생쥐 신생아 뇌에서 올리고덴드로사이트 전구세포를 분리 및 정제하여 성숙한 올리고덴드로사이트로 분화시키는 방법입니다. 배신경절 신경세포와의 공동 배양을 통해 수초 형성 과정을 연구할 수 있습니다.

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