살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 GFP Deron 융합 단백질을 사용하여 살아있는 세포 내의 프로테아좀 활성을 측정하는 것입니다. 먼저 Deron 및 Deron 프레임시프트용 맞춤형 올리고뉴클레오타이드를 클로닝하십시오. P-E-G-F-P-C one 벡터에 삽입하고 Vitrogen의 gateway 시스템 프로토콜을 수행한 후, HEK 2 93 FT 세포를 사용하여 각 컨스트럭트에 대한 바이러스를 생성하십시오. 타이터를 결정한 후 바이러스로 세포를 형질도입하고 항생제 선택을 적용한 다음, 결과로 얻은 GFP DRON 또는 GFP Dron 프레임시프트 발현 안정 세포를 증식시키십시오.

이 기술은 형광 신호 측정을 통해 주어진 처리에 대한 세포 반응을 모니터링하는 실험을 용이하게 합니다. 예를 들어, 에피 형광 현미경이나 유세포 분석기를 사용하여 프로테아좀 활성을 쉽게 평가할 수 있습니다. 전세포 분석을 이용한 발광 또는 형광 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 프로테아좀 활성을 측정한다는 점입니다. 형질전환을 위해 36 µL의 lipo 2000 시약을 1.5 mL의 DMEM에 희석하십시오. 다른 15 mL 팰콘 튜브에 DNA 구조체를 1.5 mL의 DMEM에 희석하십시오.

5분 후, 두 용액을 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 이제 T 75 플라스크에 confluent 상태로 배양된 HEK 2 93 FT 세포의 배지를 7 mL의 DMEM으로 교체합니다. 그런 다음 DNA 리포좀 혼합물을 플라스크에 넣고 앞뒤로 흔들어 섞어줍니다.

플라스크를 5% CO2 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 10 mL DMEM으로 교체합니다. 48시간 후, 상층액을 수확합니다. 바이러스가 포함된 상층액을 0.45 µm PVDF 필터로 여과합니다.

바이러스를 농축하려면, 상층액 4부피에 PEG 용액 1부피를 첨가하고 4°C에서 주기적으로 도립 혼합하며 2시간 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 바이러스를 회수하고, 흰색 펠릿의 상층액을 흡입하여 제거한 후 다시 원심분리하여 남아있는 PEG 용액을 모두 제거합니다. 최종 펠릿을 파이펫으로 PBS에 재현탁한 다음, 20~30초 동안 강하게 볼텍싱합니다.

바이러스 100 µL 분주액을 -80 °C에서 보관하십시오. U2 OS 세포를 6-웰 플레이트에 파종하고 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환을 위해 배양액을 8 µg/mL의 Polybrenan이 포함된 DMEM 1 mL로 교체하십시오. 한 개의 웰은 양성 대조군으로 설정하고, 나머지 웰에서는 일련의 바이러스 농도를 테스트하십시오.

다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 배지를 2 mL의 DMEM으로 교체하고 24시간 동안 배양합니다. 10 µg/mL의 blasticidin으로 선택 배양을 시작하고, 이틀마다 항생제가 포함된 배지를 계속 교체합니다.

약 6~7일 후, 형질도입되지 않은 세포의 사멸 여부를 확인합니다. 그 다음, 세포 염색을 위해 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 덮고 실온에서 5~10분 동안 배양한 후, 염료를 흡입하여 제거하고 웰을 2회 증류수로 헹군 뒤 플레이트를 자연 건조합니다.

마지막으로, 콜로니 수를 세어 밀리리터당 바이러스의 형질전환 단위를 계산합니다. Polybrene을 형질전환 촉진제로 하여 8 µg/mL 농도로 6-웰 플레이트에 인간 이배체 섬유아세포를 배양합니다.

총 1 mL 부피에서 감염 다중도(MOI)를 2로 설정하여 사용하십시오. 배지를 교체합니다. 다음 날 배양 세포의 밀도가 70~80% 도달했을 때 진행하십시오.

10 µg/mL 농도로 만성 선택을 시작합니다. 수일에 걸쳐 배양하며, 세포 사멸이 완료되어 선택 과정이 끝났음을 나타낼 때까지 모니터링합니다. GFP DERON 또는 GFP Deron Frameshift 융합 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 생성하기 위해 안정적으로 형질전환된 세포를 확장합니다. GFP DRON 또는 GFP DRON frameshift를 가진 세포를 분주하는 것으로 시작하며, 다음 날 팩스(facts) 3시간 전에 수행합니다.

대조군 세포를 프로테아좀 억제제로 처리합니다. PBS로 두 번 세척하고 0.5 milliliters의 트립신을 사용하여 세포를 회수합니다. 트립신 반응을 중단시키기 위해.

4.5 mL의 배지를 사용하여 세포를 15 mL Falcon 튜브로 옮깁니다. 원심분리를 통해 세포를 수확합니다. PBS로 한 번 세척한 후, 펠릿을 400 µL의 fax 버퍼에 재현탁합니다. 세포를 fax 튜브로 옮겨 얼음 위에 둡니다.

이제 유세포 분석법으로 샘플을 측정합니다. GFP Deron 융합 단백질은 즉각적인 분해를 위해 프로테아좀을 표적으로 하는 서열을 포함하고 있습니다. 반면, 프레임시프트 돌연변이체인 GFP Deron FS는 프로테아좀에 의해 분해되지 않습니다.

따라서, GFP Deron을 형질도입했을 때, 예상되는 높은 프로테아좀 활성을 가진 젊은 인간 배양 섬유아세포는 에피 형광 현미경 하에서 낮은 형광 신호를 보입니다. 동일한 세포에 GFP Deron Frameshift를 형질도입한 경우 39.7%의 양성 세포가 나타납니다. 해당 세포를 프로테아좀 억제제 ll 및 L로 처리하면 GFP dron 및 GFP Dron frameshift 세포 모두에서 신호가 증가하여 최대 약 63%에 이르게 됩니다.

젊은 층, 중년 층 및 고령의 기증자로부터 분리한 진피 섬유아세포에서 유사한 측정을 수행한 결과, 젊은 개체와 중년 기증자 사이에 GFP 신호가 명확하게 증가한 것이 나타났으며, 이는 고령의 기증자로부터 얻은 시료에서 프로테아좀 활성이 감소했음을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 렌티바이러스 입자를 생산하고, 세포를 형질전환시키며, 살아있는 세포 내의 프로테아좀 활성을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.