Name: 살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 배우세요 살아있는 세포에서 GFP 기반 Degron 리포터를 활용하여 유비퀴틴-프로테아좀 활성을 실시간 모니터링하는 방법을. 이 기술은 안정적인 세포주를 생성하여 형광 측정으로 단백질 분해 활성을 정량적으로 분석할 수 있습니다.

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이 연구는이 지원되었습니다 오스트리아 과학 재단 (FWF), 유럽위원회 (European Commission) 통합 프로젝트 MiMAGE과 PROTEOMAGE, 네덜란드 이​​니셔티브 유전체학에 의한 노화 (NFN S93)에서 국립 연구 네트워크 / 학술 연구에 대한 네덜란드기구 (NGI / NWO, 05040202과 050 - 060-810 NCHA), 유럽 연합 (EU)은 우수 수명 (FP6 036894)의 네트워크를 재정 지원하고, 유전체학에 대한 혁신 지향 연구 프로그램 (SenterNovem, IGE01014 및 IGE5007).

1. 플라스미드 건설 <ol><li> 주문 맞춤 oligo-세포핵의 dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) 및 dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE)에 대한 인코딩 및 dgn / dgnFS (그림 1)과 함께 GFP의 융합을 얻기 위해 pEGFP-C1 벡터로를 ligate. </li><li> pENTR 방향 TOPO의 복제 키트의 프로토콜과 pLenti6/V5 방향 TOPO 복제 키트 (그림 6)를 계속에 따라 PCR에 의해 GFP-dgn과 GFP-dgnFS의 코딩 순서를 증폭. </li></ol> 2. 바이러스 제작 <ol><li> 그들은 transfection의 날에 90~95%의 합류 될 수 있도록 T75 플라스크에 HEK 293FT 세포에서 transfection 전날 (1 일) 씨. </li><li> transfection의 날 혈청과 15 ML 매의 항생제없이 DMEM의 1.5 ML에 lipofectamine 2,000 시약 36 μl를 희석. 또 다른 15 ML 매를 사용하여 두 GFP에 대한 보완 DNA가 구축 들고 3 μg pLenti6/V5을 희석 - dgn 또는 GFP-dgnFS, 혈청과 항생제가없는 DMEM의 1.5 ML의 2.5 μg 봉투 인코딩 플라스미드 pMD2.G와 7.5 μg 벡터 백본 psPAX2. 5 분 후에 희석 된 DNA가 희석 lipofectamine 2,000 시약과 결합되어 있습니다. </li><li> 양식에 DNA-lipofectamine 단지를 허용하도록 실온에서 20 분의 혼합물을 품다. </li><li> HEK 293FT 세포의 매체를 제거 중 7 ML (항생제 제외)으로 조심스럽게 교체하고 혼합에 대한 술병과 앞뒤로 바위를 (2 일)에 DNA-lipofectamine 혼합물을 추가합니다. humidified 5% CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 술병을 품다. </li><li> 중간 다음 날 (; 3 일 항생제없이 10 ML 매체) 변경합니다. </li><li> 48 시간 후 (5 일) 수확 표면에 뜨는, 룸 온도에서 5 분 300 XG에서 원심 분리기와 0.45 μm PVDF 필터를 통해 표면에 뜨는을 필터링합니다. </li></ol> 문화 매체 - DMEM (HEK 293FT) 십t "&gt; DMEM 10% FBS 0.1 MM 가상 NEAA 6 MM L-글루타민 1 ㎜의 가상 나트륨 Pyruvate 1퍼센트 펜 - 패 혈성 (선택 사항) 500 μg / ML Geneticin (선택 사항) 3. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 강수량의 바이러스 농도 <ol><li> 4의 표면에 뜨는과 2 시간에 품다 ° C. 네 개의 볼륨, 하나의 볼륨 폴리에틸렌 글리콜 솔루션을 (PEG 50 ㎜의 폴리에틸렌 글리콜, 41 MM NaCl, 압력솥, 산도 = 7.2)를 추가 조심스럽게 그것을 반전으로 모든 20-30 분 섞는다. </li><li> 4 ° C.에 30 분에 1,500 XG에 스핀 다운 흰색 펠렛이 표시됩니다. </li><li> 표면에 뜨는을 대기음, 4 ° C.에서 5 분 1500 XG에서 다시 원심 분리기 나머지 PEG 솔루션을 기음. </li><li> 중간하거나 펠렛을 Resuspend 인산염 버퍼 생리 (PBS)를 pipetting 아래에서 20 명 정도로 30 초 힘차게 소용돌이에 의해. 가이드 라인은 한 T75 술병과 나누어지는 그 100 μl에 500 μl를 사용하여 있습니다. -80에서 바이러스를 저장 ° C. </li></ol><ol><li> 5 아웃 씨 × 6 잘 판 transfection 전날의 각 잘에 10 4 U2-OS 세포. </li><li> transfection의 날 문화 매체를 제거하고 DMEM 8 μg / ML polybrene (hexadimethrine 브롬화)를 포함하는 1 ML하여 교체하십시오. 농축 바이러스에게 표면에 뜨는 1시 10분과 1:100을 희석 잘 하나에 각각 1 μl를 추가합니다. 높은 바이러스 농도는 1 μl, 5 μl하고 나머지 우물에 집중 바이러스 표면에 뜨는 10 μl를 사용합니다. 하나는 잘 긍정적 인 제어로 남아 있습니다. </li><li> 다음 날 DMEM 2 ML하여 매체를 교체하십시오. </li><li> 선택 다음날로 시작합니다. 각도에 10 μg / ML Blasticidin을 적용합니다. 매초마다 하루 항생제 포함하는 매체를 교체하십시오. </li><li> 약 6-7일 선택을 시작한 후 untransduced 세포가 죽었어요. 착색은 PBS로 세포를 세 번 씻고 크리스탈 바이올렛 (10 MG / L 크리스탈 바이올렛과 ​​세포를 표지20 % 에탄올)과 상온에서 5-10 분에 품다 인치 기음 크리스탈 바이올렛은 (몇 번 재사용 할 수)와 ddH 2 O와 두 번 우물을 씻어 판을 건조. </li><li> 식민지을 계산하고, 1,000 해당 희석 (그림 7)에 곱합니다. 이 절차는 바이러스 / ML의 transfection 단위 (TU)를 계산 할 수 있습니다. </li></ol> 문화 매체 - DMEM (HFF-2/U2-OS) DMEM 10% FBS 6mM L-글루타민 1퍼센트 펜 - 패 혈성 5. 인간 Diploid의 섬유 아세포의 도입 (이 절차는 모든 세포 유형에 대해 사용할 수 있습니다.) <ol><li> 5 아웃 씨 × 10 4 인간의 diploid의 섬유 아세포 (HDFs) 6 - 잘 접시에 전달 전날. </li><li> 한 밀리리터의 총 8 μg / 전달 증강 등의 ML의 polybrene과 함께 두 감염의 다중성을 사용합니다. </li><li> 다음 날 중간 변경합니다. </li><li> 언제세포가 confluency 시작 10 μg / ML blasticidin로 선택의 70~80% 이용하실 수 있습니다. 선택이 완료되면 (더 이상 untransfected 세포가 죽는 없음) 세포의 확장이 시작 수 있으며, 세포 실험을위한 준비가되어 있습니다. blasticidin과 만성 선택은 안정적인 세포 라인 overexpressing GFP-dgn 또는 GFP-dgnFS 융합 단백질, proteasome 활동을 측정 할 준비를 생성 할 수 있습니다. 이 절차는 셀 타입의 독립적 인 매우 높은 transfection 효율을 보장합니다. </li></ol> 6. 유동 세포 계측법에 의한 측정 <ol><li> 1 아웃 씨 × 10 5 세포 (GFP-dgn 또는 GFP-dgnFS 중 하나를 들고) 실험 전날. </li><li> 제어 세포에게 사전에 3 시간 proteasome 억제제와 측정, 예를 들어 100 μg / ML의 LLnL을 취급합니다. </li><li> PBS로 두 번 세척하고 트​​립신의 0.5 ML를 사용하여 세포를 수확. trypsinisation 문화 매체의 4.5 ML을 사용하고 15 ML 팔콘로 셀을 전송 중지합니다. </li><li> 스핀 t상온에서 5 분 300 XG에서 그는 세포. </li><li> 37, 매체를 대기음 PBS에있는 세포를 resuspend 5 분 300 XG에서 다시 스핀 다운 ° C. </li><li> FACS 버퍼 (10 MM의 Hepes, 140 MM NaCl, 2.5 MM CaCl 2, 산도 = 7.4) 400 μl에 resuspend PBS를 대기음 및 FACS 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 유동 세포 계측법에 의해 얼음과 측정 샘플에있는 세포를 유지. 셀은 4 ° C.에 이상 30 분에 저장하지 않아야합니다 </li></ol> 7. 대표 결과 GFP-dgn 융합 단백질은 proteasome 따라서 단백질이 즉시 타락을 타겟으로하는 시퀀스를 수행, 그것은 GFP 형광 신호의 감소에 해당합니다. frameshift 돌연변이 (GFP-dgnFS)이 순서의 변형 버전을 들고 proteasome에 의해 저하가 아니라 높은 녹색 형광로 연결됩니다. 이러한 이유로, 젊은 예상 높은 proteasome 활동으로 HDFs하고 GFP-DG와 transducedN 유동 세포 계측법 측정 모두와 epifluorescence (그림 2A와 B, 그림 3)의 낮은 (6 % 긍정적 인 세포) 형광 신호를 보여줍니다. 같은 HDFs 긍정적 인 세포의 39.7 %를 표시 GFP-dgnFS와 transduced. proteasome 억제제를 LLnL (N-아세틸-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal)과 세포의 치료, GFP-dgn과 GFP-dgnFS 세포 (그림 2A와 B 모두에서 62.9 %의 최대 신호를 제기 ). 고령자 인간의 피부 샘플에 proteasome 활동에 가능한 감소를 확인하려면, 젊은 중년 및 이전 기증자로부터 격리 피부 섬유 아세포는 GFP-dgn과 GFP-dgnFS 감염된 위의 설명 및 유동에 의한 분석을하기 전에 동일한 통로 번호로 재배 세포 계측법. 이 실험에서, 젊은 사람들 사이 GFP 신호의 분명한 증가 (11.2 ± 0.88 % GFP 양성 세포)와 중년이 기증자는 (20.4 ± 2.27 % GFP 양성 세포, P = 0.003)을 나타내는, 관찰되었습니다 프로 티어 식물 감소노인 기증자 7 (그림 4)에서 얻은 샘플에 ome 활동. proteasome 활동에 더 감소는 오래된 개인 (그림 4)에서 분리 섬유 아세포에서 관찰되지 않았습니다. GFP-dgnFS에 대한 형광 강도는 모든 경우에 있었어요 ~ 90 % (데이터가 게재되지 않음) 세 가지 다른 연령 그룹에 대한 높은 transfection 효율을 나타냅니다된다. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 1 그림. GFP-dgn과 GFP-dgnFS 순서. 표시는 GFP (녹색) pEGFP-CL1 벡터 (회색)과 dgn / dgnFS 순서 (빨간색)의 여러 복제 사이트의 3' 엔드입니다. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. GFP-dgn과 GFP-dgnFS 인간의 diploid의 섬유 아세포의 유동 세포 계측법 분석. A. 젊은 사람의 포피의 섬유 아세포 (HFF-2)은 녹색 형광 단백질을 운반 lentiviral 벡터에 감염되었다 (GFP) dgn 유전자 또는 GFP-dgnFS (frameshift)는 등의 표시 및 유동 세포 계측법을 (FACS 캔토 II, Becton 디킨슨)를 사용하여 GFP 형광에 대한 분석 구성합니다. 표시 할 경우, 세포는 proteasome 억제제 N-아세틸-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLnL)로 3h 치료를했다. 감염되지 않은 세포는 제어로 사용되었습니다. 실험은 triplicates에서 수행되었다. B. 데이터 세 독립적 인 실험을 대표합니다. 번호는 GFP 양성 세포의 양을 반영합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3327/3327fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. GFP-dgn과 GFP-dgnFS HFF-2 세포의 형광 현미경 분석. HFF-2 영은 그림 2에서와 같이 취급되었다. 감염 후 구일에서 셀은 V 있었다형광과 위상 대비 현미경으로 isualized. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 4 그림. 인간의 피부 노화에 proteasome 활동의 변화. 지정된 연령 그룹의 9 개 다른 기증자로부터 인간의 포피의 섬유 아세포는 최소한 확장과 GFP-dgn에 대한 코딩 lentiviral 구조에 감염되었습니다. 감염 후 구일에서, 셀 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 데이터 중복의 연령 그룹 당 3 샘플 (± SE)에 취득했다. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 실험 방법은. dgn와 dgnFS에 대한 사용자 정의 - oligo 세포핵은 pEGFP-C1 벡터로 복제되어 바이러스는 HEK 293FT 세포를 사용하여 각 구조에 대한 생산됩니다. 바이러스의 titer가 결정된다. 세포는 바이러스에 transduced 및 확장하고 있습니다. 선호 치료 후 세포 분석유동 세포 계측법에 의한 형광 신호. <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"> 6 그림. pLenti GFP-dgn의지도는. GFP-dgn 시퀀스를 포함하여 pLenti6/V5-DEST 벡터의지도가 표시됩니다. 약어 : PCMV (CMV 프로모터), GFP-dgn (GFP-dgn의 순서), P SV40 (SV40 초기 발기인), EM7 (EM7 발기인), Blasticidin (Blasticidin 저항 유전자), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR로 삭제 U3 지역), SV40 PA (SV40 polyadenylation 신호), 암피실린 (암피실린 저항 유전자), pUC 오라 (pUC 원본), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR 하이브리드 발기인), Ψ (HIV-1 Ψ 포장 신호 ), RRE (HIV-1 수익 응답 요소). <img src="/files/ftp_upload/3327/3327fig7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"> 그림 7. U2-OS의 titering 판. U2-OS는 6 잘 판에 나가 놓는하고 다른 바이러스 농도 (1백분의 1과 1 / 10의 희석, 1, 5 및 공동 10 μl와 transfected되었습니다) 바이러스 표면에 뜨는을 ncentrated. 하나는 잘 untransfected 제어 (NT)로 사용되었다. 6-7일 후, 전지 크리스탈 바이올렛, 공기 건조 물들했다.

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ubiquitin proteasome - 활동 기자 기판으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 첫 번째 출판 2000 12 년에 출판되었다. 그 후, GFP 세포 활동, 특히 ubiquitin-proteasome 프로세스를 시각화 할 수있는 일반적인 도구가되었습니다. 생체 내 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 GFP 기반 기자와 유전자 변형 마우스 모델은 13 도입되었습니다. 생체 연구에 추가이 간행물 14에서 사용하는 비슷한 degron-불안정 GFP 기자와 다른 유전자 변형 마우스 모델을 만들었습니다. 불행하게도, 기자 등 GFP는 Dantuma 외에 의해 게재 된 일부 결함이 있습니다.와 보먼 외. 12,15. 첫째, 불안정 GFP 인해 알 수없는 이유로 proteasome의 억제없...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> pEGFP-C1 벡터 </td><td> BD Bioscience Clontech </td><td> 6084-1 </td></tr><tr><td> pENTR 방향 TOPO 복제 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K2400-20 </td></tr><tr><td> pLenti6/V5 방향 TOPO 복제 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> V496-10 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 </td><td> D5546 </td></tr><tr><td> PVDF 필터 (Rotilabo-Spritzenfilter) </td><td> 로스 </td><td> P667.1 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 글리콜 </td><td> 시그마 </td><td> P2139 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 머크 </td><td> 1.06404.1000 </td></tr><tr><td> Dulbecco의 인산이 Sali 버퍼NE 1X (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td></tr><tr><td> hexadimethrine 브로마이드 </td><td> 시그마 </td><td> 10,768-9 </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invitrogen </td><td> R21001 </td></tr><tr><td> 크리스탈 바이올렛 </td><td> 시그마 </td><td> C3886 </td></tr><tr><td> FACS 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린의 스트렙토 마이신 (펜 - 패 혈성) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140130 </td></tr><tr><td> L-글루타민 200 MM </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> 가상 비 필수 아미노산 (NEAA) 100x </td><td> Invitrogen </td><td> 11140035 </td></tr><tr><td> 가상 나트륨 Pyruvate 100 MM </td><td> Invitrogen </td><td> 11360039 </td></tr><tr><td> D-(+)-포도당 (45 %) </td><td> 시그마 </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Geneticin </td><td> Invitrogen </td><td> 11811023 </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 머크 </td><td> C5080 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 시그마 </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.05 %) </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td></tr></tbody></table>

살아있는 세포에서 ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (gfp) 기반 리포터 단백질을 사용하여

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome은 이상, misfolded, 손상되었거나 산화 단백질 1, 2의 proteolytic 저하에 관련된 주요 세포 세포 기관입니다. proteasome 활동의 유지 보수는 세포의 스트레스 반응 3, 세포주기 조절과 세포 분화 4 면역 체계의 반응 5와 같은 많은 주요 세포 프로세스에 연루되었습니다. ubiquitin proteasome - 시스템의 장애는 종양 및 neurodegenerative 질병 4, 6의 개발에 관한되었습니다. 또한, proteasome 활동에 감소는 세포 노화 및 노화 organismal 7, 8, 9, 10의 기능으로 발견되었다. 여기, 우리는 GFP-dgn 융합 단백질을 사용하여 생활 세포에 ubiquitin-proteasome 활동을 측정하는 방법을 제시한다. 기본 세포를 생활에 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 있도록, 보완 DNA는 (녹색 형광 단백질 (GFP) dgn 융합 단백질에 대한 코딩 구성합니다 GFP-dgn, 불안정)과 frameshift 변이 (GFP-dgnFS, 안정적 11) 운반 변종 lentiviral 표현 벡터에 삽입되어 있습니다. 이 셀 형식이나 기증자의 나이와 무관 한 매우 높은 transfection 효율을 보장하기 때문에 우리는 기존의 transfection 기술을 통해이 기술을 선호합니다. GFP-dgnFS (안정적) 단백질과 proteasome 억제제의 부재 또는 존재의 불안정 단백질 (GFP-dgn)에 의해 표시되는 형광의 차이점은 각 특정 세포 변형에 ubiquitin-proteasome 활동을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 차이는 epifluorescence 현미경에 의해 모니터링 될 수 있거나 유동 세포 계측법에 의해 측정 할 수 있습니다.

생활 세포의 ubiquitin proteasome - 활동을 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. degron-불안정 GFP-(GFP-dgn)과 안정적인 GFP-dgnFS 융합 단백질이 생성되고 lentiviral 발현 벡터를 사용하여 셀에 transduced 있습니다. 이 기술은 ubiquitin-proteasome 활동이 쉽게 epifluorescence 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가 할 수있는 안정적인 GFP-dgn/GFP-dgnFS 표현 세포 라인을 생성 할 수 있습니다.

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

프로테아좀은 비정상적이거나 미접힘, 손상 또는 산화된 단백질의 단백질 분해 분해에 관여하는 주요 세포 내 소기관입니다 1, 2. ...

이 절차의 전반적인 목표는 GFP Deron 융합 단백질을 사용하여 살아있는 세포 내의 프로테아좀 활성을 측정하는 것입니다. 먼저 Deron 및 Deron 프레임시프트용 맞춤형 올리고뉴클레오타이드를 클로닝하십시오. P-E-G-F-P-C one 벡터에 삽입하고 Vitrogen의 gateway 시스템 프로토콜을 수행한 후, HEK 2 93 FT 세포를 사용하여 각 컨스트럭트에 대한 바이러스를 생성하십시오. 타이터를 결정한 후 바이러스로 세포를 형질도입하고 항생제 선택을 적용한 다음, 결과로 얻은 GFP DRON 또는 GFP Dron 프레임시프트 발현 안정 세포를 증식시키십시오.이 기술은 형광 신호 측정을 통해 주어진 처리에 대한 세포 반응을 모니터링하는 실험을 용이하게 합니다. 예를 들어, 에피 형광 현미경이나 유세포 분석기를 사용하여 프로테아좀 활성을 쉽게 평가할 수 있습니다. 전세포 분석을 이용한 발광 또는 형광 분석과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 프로테아좀 활성을 측정한다는 점입니다. 형질전환을 위해 36 µL의 lipo 2000 시약을 1.5 mL의 DMEM에 희석하십시오. 다른 15 mL 팰콘 튜브에 DNA 구조체를 1.5 mL의 DMEM에 희석하십시오.5분 후, 두 용액을 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 이제 T 75 플라스크에 confluent 상태로 배양된 HEK 2 93 FT 세포의 배지를 7 mL의 DMEM으로 교체합니다. 그런 다음 DNA 리포좀 혼합물을 플라스크에 넣고 앞뒤로 흔들어 섞어줍니다.플라스크를 5% CO2 배양기에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 10 mL DMEM으로 교체합니다. 48시간 후, 상층액을 수확합니다. 바이러스가 포함된 상층액을 0.45 µm PVDF 필터로 여과합니다.바이러스를 농축하려면, 상층액 4부피에 PEG 용액 1부피를 첨가하고 4°C에서 주기적으로 도립 혼합하며 2시간 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 바이러스를 회수하고, 흰색 펠릿의 상층액을 흡입하여 제거한 후 다시 원심분리하여 남아있는 PEG 용액을 모두 제거합니다. 최종 펠릿을 파이펫으로 PBS에 재현탁한 다음, 20~30초 동안 강하게 볼텍싱합니다.바이러스 100 µL 분주액을 -80 °C에서 보관하십시오. U2 OS 세포를 6-웰 플레이트에 파종하고 하룻밤 동안 배양합니다. 형질전환을 위해 배양액을 8 µg/mL의 Pol

monitoring-ubiquitin-proteasome-activity-living-cells-using-degron

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 세제 분획법과 함께 시클로헥시미드 처리를 사용하여 잘못 접힌 단백질에 대한 분해 분석을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 단백질의 역학을 연구하고 단백질 회전율의 심층적인 메커니즘을 밝히는 데 도움이 됩니다.

Misfolding-prone Protein Degradation Assay: Cycloheximide 처리 및 세제 분획을 사용하여 잘못 접힌 단백질 분해를 모니터링하는 기술

아프리카 트리파노좀의 글리코솜 역학은 전자 및 형광 현미경과 같은 전통적인 세포 생물학 기술로는 연구하기 어렵습니다.  동적 소기관 거동을 관찰하는 수단으로, 형광 소기관 리포터 시스템이 유세포 분석법과 함께 사용되어 살아있는 기생충의 실시간 배당체 역학을 모니터링했습니다.

형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

여기에서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해의 상대적 속도를 정량화하기 위한 강력한 생물학적 분석법을 설명합니다. 분석 판독은 액체 배양에서의 효모 성장 속도이며, 이는 필수 대사 마커에 융합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질의 세포 수준에 따라 달라집니다.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

이 보고서는 웨스턴 블롯 또는 형광 기반 분석법으로 잘못 접힌 단백질의 분해 속도를 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 잘못 접힌 다른 단백질의 분석 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있습니다.

세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석

이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

이 프로토콜 열 스트레스 단백질 핵 전 좌는 녹색 형광 단백질 (GFP) 퓨전 단백질 마커로 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 사용 하 여 추적 하는 방법을 보여 줍니다 얼룩. 프로토콜을 얼룩이 DAPI 빨리 고 GFP 단백질 subcellular 지 방화 신호 유지.

녹색 형광 단백질 태그와 4', 6-Diamidino-2-phenylindole 꼬마 선 충 에 얼룩이 단백질 Subcellular 지 방화를 감지

이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

여기에 제시된 단백질 헌팅틴의 분해를 광변환형 형광소 덴드라2에 융합한 분해를 모니터링하는 프로토콜이 있다.

포토컨버터블 덴드라2를 사용하여 노화 C. 엘레간스의 단백질 회전율의 생체 내 정량화

배우세요 살아있는 세포에서 GFP 기반 Degron 리포터를 활용하여 유비퀴틴-프로테아좀 활성을 실시간 모니터링하는 방법을. 이 기술은 안정적인 세포주를 생성하여 형광 측정으로 단백질 분해 활성을 정량적으로 분석할 수 있습니다.

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

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