Name: 에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 C. elegans 축삭 재생 연구를 위한 저예산 레이저 절단 시스템 구축 및 정렬 방법. 정밀한 레이저 빔 정렬로 최소한의 조직 손상으로 축삭을 절단하고 시간 경과에 따른 재생 과정을 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 신경 과학에 대한 일행 기증 기금, 크리스토퍼와 다나 리브 재단​​과 Amerisure 자선 재단에 의해 지원되었다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

다른 레이저 시스템 3,5-11와 레이저 미세 몇 가지 좋은 토론이 있습니다. Femtosecond IR 레이저가 영상 시설과 관련된 경우 12 편리한 subcellular 레이저 절제의 &quot;금 표준&quot;입니다,하지만 그들은 개별 사용자에 대해 종종 너무 비용이 많이 드는 있습니다. 이 때문에 화상의 깊이 화상 샘플을위한 femtosecond IR 레이저가 필요한 경우 그때는 아마 레이저 axotomy 하나가 필요합니다. 표면의 30-50 음 내의 대상 axons 투명한 조직은 아마 높은 NA의 침지 렌즈를 통해 대상 20 uJ / 펄스 범위의 파란색과 녹색 펄스 레이저로 가능 있습니다. 특히 대상 축삭 증가의 깊이로 femtosecond 레이저와 비교하여 나노 및 피코 초 레이저로 더 많은 피해있을 것입니다. C.이 elegans은 투명 모든 axons은 표면의 20-30 음 내에 있습니다. 우리는 정기적으로 표면의 5 음 내에있는 모터 axons를 잘라. 우리는 또한 쉽게 도끼를 차단표피 표면으로부터 약 20 음하는 신경 링 내에서 기능. 우리는 어른 벌레의 직경을 통해 약 30-50 음 ... 수 axons를 절단에 대한 제한을 발견했습니다. 그것은 여기에 설명한 레이저 박리 시스템이 대상 axons의 투명성과 깊이의 기준에 맞게 여러 가지 준비를 잘 작동한다고 가능성이 높습니다. 아직도, 그것은 femtosecond IR 레이저, 그 나노 및 picosecond 355 NM 및 532 nm의 레이저의 이론적 장점을 감안할 때, 조금 놀라운 것은 C로 레이저 axotomy에 대해 너무 잘 수행 elegans 6,13. 우리는 nanosecond 440 NM, nanosecond 532 NM, 그리고 femtosecond 레이저와 IR 레이저 axotomy에 대한 응답으로 축삭 재생에 차이를 볼 수 없습니다. 솔리드 스테이트 355 나노미터 자외선 레이저는 532 nm의 다이오드는 수동적 Q - 스위치 고체 레이저 펌핑과 같은 비용에 대해 있지만, 효율적으로 이러한 짧은 파장을 통과 하나 높은 능력이나 광학을 필요로합니다. 대부분의 광학은 보이는 400과 잘 수행하기 위해 설계되었습니다 -700 NM 라이트. 355 나노미터 레이저는 6 등 감소 플라즈마 임계값, 작은 스폿 크기, 그리고 효율적으로 대상으로 절제 레이저의 100 %를 직접 샘플 신호의 손실없이 GFP의 동시 이미징을 허용 것이다 긴 통과 이색성 같은 장점을 제공합니다. 블루 440 나노미터 레이저는 가시 광선 레이저 (표준 광학 및 안전과 좋은 성능) 작업의 장점을 유지합니다. 불행히도, DPP Q - 스위치 고체 440 nm의 레이저의 가격은 현재와 비슷한 전력 355nm 또는 532 nm의 레이저의 3 배 비용입니다. 우리는 C.위한 새로운 시스템을 설계했다면 elegans은 대상 깊이는 최소한 어디에, 우리는 1 UV 투명 렌즈 (355nm에서 50-70%의 투과율과 비용 40X 1.3na 석유 렌즈에 대한 약 $ 3,000) 및 5-10 uJ / 맥박을 생산 355 나노미터 레이저을 선택 것입니다 -20에 kHz에서. 축삭의 박리는 플라즈마 형성에 의한 것으로 생각됩니다. 짧은 펄스는 낮은 전력과 플라즈마 볼륨 w에서 플라즈마 임계값을 생산합니다<html> 병이 6 작은 수 있습니다. 목표는 가장 낮은 전원 펄스 에너지를 조정하여 가장 작고 짧은 - 살았 플라즈마를 생산하는 것입니다. 큰 긴 plasmas이 캐비테이션 거품을 생성하는 것으로 세포를 둘러싼 손상. 우리는 일반적으로 가장 높은 빈도 (예 : 2.5kHz)에서 50-100에 대한 펄스를 사용하는 것을 절제를 발견하면 최상의 결과를 제공합니다. 이것은 손상이 점차 더 손상의 정도를 제어하는​​ 펄스의 연속을 통해 통합될 수 있습니다 제안합니다. 빔을 정렬하고 정확하게 확장하는 경우 여기에 설명된 레이저 박리 시스템은 매우 용서입니다. 우리는 10 % 레이저의 파워 (0.3 MW의 평균 2,500 Hz에서에서 측정 및 1 uJ / 펄스 예상)에서 성인 벌레에 axons 절단 시작하고 14 % 전력을 통해 제한된화된 손상 절약하실 수 있습니다. 당신은 15~39% 레이저 파워 피해의 큰 영역을 볼 수 있지만, 오직 40 % 전력 (약 1 MW의 평균 2,500 Hz에서에서 측정) 위에 벌레 대형 캐비테이션 거품과 벌레의 표피 손상에 의한 폭발 않습니다. e_content &quot;&gt; Steinmeyer 외. 2010이 종이, 레이저 박리 시스템을 구축을위한 훌륭한 리소스입니다. 리온 에이버리는 또한 저렴한 N2 가스 337 NM 레이저를 기반으로, 레이저 박리 시스템의 좋은 실용적인 설명을 이뤘고, 좋은 실천을 제공합니다 조언 (elegans.swmed.edu / Worm_labs / 애버리 /). 자신의 시스템을 설계할 때 먼저 현미경 목표로 절제 레이저를 대상으로하는 방법을 결정하기 위해 귀하의 현미경 담당자와 상담해야합니다. 귀하의 현미경이 진동 절연 테이블에 장착해야합니다 (뉴 포트, TMI, 토르). 브레드 보드의 상단 최적이지만, 견고한 스틸 맨은 여전히​​ 자기 positioners와 함께 사용할 수 있습니다. 모든 광학 요소가 자리에 남아있을 수 있기 때문에 수직 범위에있는 전용 중개 모듈이 좋은 것입니다.하지만, 저렴하고 카메라 포트 (거꾸로) 또는 에피 형광등 포트에 연결된 &quot;결합기&quot;를 사용하기 더욱 편리있을 수 있습니다. 당신은 (에 다시 조리개와 투과율의 크기를 알아야<html> 목적 렌즈의 blation 레이저 파장)은 당신이 사용하는 것입니다. 일단 레이저 (예 : Crylas, 가득하며, 크리스탈, 또는 CRC)는 정확한 광학 요소를 선택, 하드웨어 및 안전 장비와 관련하여 도움이 토르 또는 뉴 포트에 문의를 결정합니다. 우리는 공간을 절약하기 위해 이중 갈릴리 빔 확장기 결정하지만 간단 Keplerian의 확장기가 옵션 (f2/f1 = 팽창 계수)입니다. 사용자 정의 빔 확장기가 가장 비싼되지만, 뉴 포트, 토르, 그리고 레이저 제조 업체의 여러 우수한 품질의 상용 빔 확장기를 제공합니다. 일부 레이저 제조 업체는 비용 효율과 공간 절약있을 수 있습니다 설명서 및 전자 제어 attenuators를 제공하고 있지만, Glan - 톰슨 편광자 및 하프 웨이브 플레이트처럼 다목적 없습니다. 당신은 또한 레이저를 제어하는​​ 방법을 결정해야합니다. 당신은 레이저 회사에서 제공하는 상업 TTL 발생기, 또는 소프트웨어를 사용, LabView 기반의 컨트롤러를 디자인할 수 있습니다. 특정 레이저 제조 업체 옵션을 논의. 십t &quot;&gt; 우리는 일반적인 가이드에만 사용이 하드웨어의 목록을 제공합니다. 시스템은 기존 이미징 시스템에 추가할 때 $ 15,000 달러의 비용이 여기에 설명된. 가까운 물리 부서에서 자주 실질적인 소개를 제공하기 위해 기꺼이 누군가를해야합니다 안전하게 무료 빔 레이저와 협력. 고정 및 C. 시간 경과 영상을위한 대체 방법 elegans은 최근에 설명되어있다. 14 문제 해결 가장 어렵고 중요한 단계는 현미경의 광축 중심으로 확대 빔을 정렬합니다. 일단 당신이 센터에 최종 정렬에 대한 운영 미러를 사용하기 전에 현미경의 광학 축의 5 음 내에서가 정렬하려면 열심히해야 갈릴리 렌즈를 통해 중심과 확장된 광선을합니다. 현미경으로 빔을 정렬 운영 거울 과도하게 사용이 빔을 통해 축을 벗어 이동합니다팽창기. 해당 ND 필터와 함께 레이저 빔을 감쇠와 직접 반사 대상 (전면 표면 거울)에 레이저 빔 프로파일을 볼 수 각별히 조심을 사용합니다. (그것이 당신이 레일의 높이를 조정하는 데 필요한 위 / 아래 범위에 중심 수없는 경우) 당신은 부드럽게 정확 센터보기의 목적 60X 필드에 광선을하기 위해 현미경을 슬쩍 찌르다 수 있습니다. 빔 프로파일이 정확하게 중심 원형이다 빔과 대칭 &quot;플레어&quot;를 제공하기 위해 현미경 광학 축을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 비대칭 불을 현미경 축이 완벽하게 (또는 레일 레벨되지 않습니다) 정렬되지 나타냅니다. 마지막으로, L3를 조정하고 빔의도 및 대칭 확장과 수축이 나타납니다. 가장 작은 지점에 레이저 빔을 초점 L3 조정 후 대상 표면에 정확히 현미경을 집중합니다. 이제 LSCM 또는 CCD 시스템을 통해 몇 군데와 절제 자리 이내로 때 레이저 빔을가 중심의 5 음 사이는 것을 발견한다Z의 초점 1um. 당신이 찾아내는 경우에 당신은 벌레를 &quot;폭파&quot;또는 지속적으로 문제가 가장 가능성이 절제 레이저의 미세 정렬됩니다 axons를 잘라 대형 캐비테이션 거품을 생성하고 있습니다. 최소 (&lt;500nm)가 절제 명소가 Z 초점 (L3 렌즈 컨버전스를 조정)하고 XY 신탁 지점 (마지막 kinematically 장착된 거울로 조정)에 현지되어 있는지 확인하십시오. 가까이 표면에 axons을 타겟팅하면 더 적은 레이저 전원을 필요합니다. 마찬가지로, 작은 동물 (L1 및 L2)은 성인에서 동일한 axons을 타겟팅에 비해 axotomy을위한 더 적은 레이저 전원을 필요합니다. 당신의 야생 유형 axons이 재생 또는 axons의 표백제하지 않으면 당신은 이미징 레이저 전원을 감소하거나 샘플링 속도를 감소 시도해야합니다. 당신의 벌레가 죽어거나 될 경우 병약한 1 % 단계에서 %의 아가로 오스를 줄여보십시오. 당 높은 사용하는 경우이 종종 그들이 죽는 원인이되므로이 장착 벌레 후 coverslip을 이동하지 있는지 확인centage 아가로 오스와 microspheres. 당신의 벌레가 시간 경과 세션 중에 파열 또는 죽으면 그것으로 인한 것입니다 : 1. 아가로 오스 비율이 너무 높습니다. 2. 절제 레이저로 표피 손상. 3. 장착 후 coverslip의 운동. 표피에 손상이 잘못에있다면 그것은 단지 절제 레이저 타겟으로 탑재된 웜 영향을 미칩니다. 당신의 벌레가 시간 경과 세션 중에 너무 많이 움직이면 0.5 % 단계의 비율 아가로 오스를 늘려보십시오. 건강한 웜의 건강한 axons는 항상 &quot;적극적&quot;이며 형광의 일관된 수준을 표시합니다. 이 형광 또는 활동에 갑자기 감소를 볼 경우 웜은 죽어 있거나 죽어있다. 여러 페르시 또는 조각 axons 죽어가는 혹은 죽은 벌레의 확인 서명이 있습니다. 당신은 전체 시간 저속 세션 동안 초점에 axons를 지키는 문제가있다면 여러 가지 문제가있을 수 있습니다. 처음 10 H 이상의 유리 슬라이드에 영상에 의해 불활성 샘플을 당신의 무대 드리프트를 확인RS. 몇 미크론 드리프트는 열 불안정으로 인해 수도 있지만 이상 5 음 아마도 현미경으로 기계적 문제로 인해 발생합니다. 장착에 문제가 더 일반적입니다. 시간의 경과를 시작하기 전에 마운트 웜 30 분 동안 현미경 스테이지와 평형합시다. 귀하의 바셀린의 인감이 시간 저속 세션 과정 중에 누출을 개발하지 않았 있는지 확인하십시오.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 535 NM 레이저 </td><td> Crylas </td><td> FDSS532Q3 </td><td> (가득하며, 크리스탈, 그리고 CRC도 비교 레이저를 제공합니다) </td></tr><tr><td> 모든 광학 및 하드웨어 </td><td></td><td></td><td> (토르는 비교 광학 및 하드웨어를 제공합니다) </td></tr><tr><td> SUPREMA 광학 마운트, 1.0에서 직경 </td><td> 뉴 포트 </td><td> SS100 - F2KN </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 게시, 1&quot;높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 포스트 포크 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 수색 성의 제로 주문 Wavel 플레이트, ½ 웨이브의 지체, 400 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> 10RP52 - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 회전 스테이지, 1 &quot;Aperature </td><td> 뉴 포트 </td><td> RSP - 1T </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 게시, 1&quot;높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 포스트 포크 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> Glan - 레이저 방해석의 편광판, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> 10GL08AR.14 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 편광판 회전 마운트 </td><td> 뉴 포트 </td><td> RM25A </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 직경 게시물 ¼ &quot;1 스페이서&quot; </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 0.25 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> ½ &quot;높이 1&quot;직경 포스트 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 0.5 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 포크, 1 &quot;직경 포스트 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 빔 덤프 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PL15 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 현미경 렌즈 마운트 목표 </td><td> 뉴 포트 </td><td> LH - OBJ1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 게시, 1&quot;높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - 1 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1 &quot;직경 포스트 포크 </td><td> 뉴 포트 </td><td> PS - F </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 높은 에너지 ND : YAG 레이저 미러, 25.4 mm의 직경, 45 °, 532 NM </td><td> 뉴 포트 </td><td> 10Q20HE.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SUPREMA 광학 마운트, 1.0 인치 직경 통관 장착 구멍 </td><td> 뉴 포트 </td><td> SN100C - F </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 고정밀 손잡이 조정 나사, 12.7mm 여행, 100TPI </td><td> 뉴 포트 </td><td> AJS100 - 0.5K </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 스레드 어댑터, ¼ -20 남성, 동경 8-32 여성 </td><td> 뉴 포트 </td><td> SS - 1 - B </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 1.5 인치 직경로드에 대한로드 클램프 </td><td> 뉴 포트 </td><td> 340 - RC </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 로드, 높이 14 인치 (35.5 cm) </td><td> 뉴 포트 </td><td> 40 </TD&gt; <td> 일 </td></tr><tr><td> X26, 스퀘어 40mm 길이 레일 캐리어 </td><td> 뉴 포트 </td><td> CN26 - 40 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 스틸 레일, 384mm (15 &quot;) 길이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> X26 - 384 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 1.5 인치 직경로드에 대한로드 플랫폼 </td><td> 뉴 포트 </td><td> 300 P </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 로드, 높이 14 인치 (35.5 cm) </td><td> 뉴 포트 </td><td> 40 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 평요의 렌즈, 12.7mm 직경 - 25mm EFL, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> KPC025AR.14 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 렌즈 볼록 렌즈, 25.4mm 직경 50.2mm EFL, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> KPX082AR.14 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 렌즈 볼록 렌즈, 25.4mm 직경 62.9mm EFL, 430 - 700nm </td><td> 뉴 포트 </td><td> KPX085AR.14 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 고정 렌즈 마운트, 0.5 &quot;직경 1.0&quot;축 높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> LH - 0.5 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> 고정 렌즈 마운트, 1.0 &quot;직경 1.0&quot;축 높이 </td><td> 뉴 포트 </td><td> LH - 1 </td><td> 이 </td></tr><tr><td> Microspheres 0.1um </td><td> Polysciences </td><td> 00,876 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> RPI </td><td> A20090 </td><td> EEO 사항 </td></tr><tr><td> Muscimol </td><td> 시그마 </td><td> M1523 </td><td></td></tr></tbody></table>

에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 axotomy 시스템 구축 c. elegans</em

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

시간이 경과 현미경에 의해 다음 레이저 axotomy는 C로 축삭 재생의 phenotypes에 민감한 분석입니다 elegans 1. 이 분석의 주요 어려움은 레이저 박리 시스템 2,3을 구현하는 데 필요한 인식 비용 ($ 25 100K) 및 기술 전문 지식이다. 그러나 겸손한 비용 (&lt;$ 10K)의 솔리드 스테이트 펄스 레이저는 대상 axons은 조직의 표면에 &quot;가까운&quot;입니다 투명 준비의 레이저 절제를위한 강력한 성능을 제공할 수 있습니다. 시스템의 건설과 정렬은 하루에 수행할 수 있습니다. 초점 콘덴서에서 절제 레이저 빛을 제공하는 광학 경로는 편리한 정렬 가이드를 제공합니다. 제거된 모든 광학과 중간 모듈은 절제 레이저에 헌신되며 광학 요소, 레이저 박리 세션 동안 이동하지해야한다는 보장 수 있습니다. 중간 모듈에서 이색성은 동시 영상과 레이저 박리 수 있습니다. 레이저 빔 T를 중심으로O는 초점 현미경의 콘덴서 렌즈에서 나가는 빔은 시스템의 초기 정렬을 안내합니다. 렌즈의 다양한 상태로 사용하고 선택한 객관적인 렌즈의 뒤쪽 구멍을 채울 수있는 레이저 광선을 확장하고 있습니다. 최종 정렬 및 테스트는 앞 표면 미러 유리 슬라이드 목표로 수행됩니다. 레이저 파워는 최소 크기의 절제 자리를 (&lt;1um) 제공하도록 조정됩니다. 절제 장소는 이미지 창에 고정 머리카락을 건너 마지막 kinematically 탑재 거울 미세 조정 중심이다. axotomy에 대한 레이저 전원이 대상 슬라이드 (이것은 여러분이 사용하는 대상과 다를 수 있습니다)에 최소 절제 장소에 필요한보다 높은 약 10X 것입니다. 웜는 아가로 오스 패드 (또는 microfluidic 실 4)에 장착하여 레이저 axotomy 및 시간 - 저속 영상에 대한 고정하실 수 있습니다. 아가로 오스 패드는 쉽게 전자 레인지에 녹인 균형 식염수에서 10 % 아가로 오스와 함께 만들어집니다. 용융 아가로 오스의 방울은 유리 슬라이드에 배치하고 서로 평평합니다패드에 유리 슬라이드 두께 약 200 음 (인접 슬라이드에 시간이 테이프의 단일 레이어는 스페이서로 사용됩니다.) &quot;Sharpie&quot;캡은 13mm의 군복을 입은 직경 원형 패드를 절단하는 데 사용됩니다. 마취 (1ul Muscimol 20mM)와 Microspheres (크리스 송곳니 엔 개인 통신) (1ul 2.65 % 폴리스티렌 0.1 음 ... 물속에) 그들이 왼쪽 측면에 누워되도록 지향 3-5 웜 뒤에 패드의 중심에 추가됩니다. 유리 coverslip이 적용됩니다 그리고 바셀린는 coverslip을 봉인하고 샘플의 증발을 방지하는 데 사용됩니다.

레이저 axotomy 시간 - 저속 영상 뒤에 것은 분석의 돌연변이의 효과를 민감한 방법입니다<em&gt; C. elegans</em&gt; 축삭 재생에. 고품질하지만, 저렴한 가격, 레이저 박리 시스템은 쉽게 대부분의 현미경에 추가할 수 있습니다. 15시간 시간이 지남에 저속 영상은 웜주의 고정이 필요합니다.

에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans</em

레이저 축삭 절단 후 타임랩스 현미경 관찰은 C. elegans의 축삭 재생 표현형을 분석하는 민감한 분석법입니다. 이 분석법의 주요 어려움은...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 CL gans의 축삭 재생을 연구하기 위한 레이저 절제 시스템을 조립하고 정렬하는 방법을 보여주는 것입니다. 이를 위해 먼저 레이저 글랜드, Thompson 편광자, 반파장판, Turning 미러, 페리스코프 레일 및 레일 미러를 브레드보드에 장착합니다. 다음 단계는 레이저 빔을 현미경 콘덴서 렌즈에서 나오는 출력 빔에 맞춰 정렬하는 것입니다.그 다음, 레이저 빔 확장 렌즈를 장착하고 정렬 및 배치하여 레이저 빔을 중심에 맞추고 발산을 없게 합니다. 절차의 마지막 단계는 미세 조정을 통해 레이저 어블레이션 지점을 이미지 초점과 일치시키는 것입니다. 최종적으로, XY NC 정렬이 완벽하지 않더라도 회절 제한 레이저 빔을 사용하면 주변 조직 손상을 최소화하면서 0.5 µm 크기의 축삭을 정밀하게 절단할 수 있습니다.펨토초 레이저와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 15,000달러라는 상대적으로 저렴한 비용입니다. 또한 유지보수가 거의 필요 없으며 매우 정밀한 축삭 절단이 가능합니다. 이 방법은 예쁜꼬마선충의 축삭 재생에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 초파리, 제브라피시, 생쥐, 말초 신경계 및 인비트로(in vitro) 세포와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.기본적으로 표면에서 30 to 50 µm 이내에 있는 모든 세포입니다. 브레드보드 위에 구성 요소들을 배치한 후, 레이저 페리스코프 포스트와 높이 조절 레일 지지대를 볼트로 고정하는 것으로 시작하십시오. 이 시스템은 눈에 쉽게 손상을 줄 수 있는 Class 3B 레이저를 사용하므로, 레이저 안전 수칙을 엄격히 준수하시기 바랍니다.공간 빔 레이저를 안전하게 다루는 방법에 대해 소속 물리 학과의 담당자와 상의하십시오. 정렬 과정 중에는 항상 레이저 출력을 최저로 설정하십시오. 접안렌즈를 통해 관찰할 때는 레이저 셔터가 기계적으로 닫혀 있고 레이저 전원이 꺼져 있는지 반드시 확인하십시오.이제 현미경의 위치를 잡습니다. 먼저, 현미경을 레일 축에 맞춥니다. 둘째, 현미경 콘덴서 렌즈에서 나오는 투과광 빔에 맞춥니다. 셋째, 레일에 부착된 조절 가능한 조리개나 렌즈를 사용하여 레일의 양 끝을 콘덴서 빔에 맞춥니다.진행하기 전, 수평계와 실험실 잭을 사용하여 레일 높이를 조절하십시오. 레일의 양 끝이 정렬되었는지 확인하십시오. 이제 레이저 빔이 글랜드, Thompson 편광자와 반파장판을 통과하며 회전 시 가장자리에 닿지 않는지 확인하십시오.하프 플레이트(halfway plate)를 사용하여 모든 구성 요소가 브레드보드에 고정된 상태에서 레이저 출력을 조정합니다. 레이저를 켜고 펄스 주파수를 100 연속 모드로 설정한 후, 하프 플레이트를 이용해 출력을 최소로 낮춥니다. 포스트잇이나 렌즈 페이퍼를 사용하여 레이저 빔을 시각화하십시오.이제 브레드보드에서 레이저 빔을 위로 올립니다. 레이저부터 시작하여 키네마틱 마운트 거울들을 순차적으로 조정하고 고정하여, 빔이 상승 레일 끝에 장착된 거울까지 도달하게 합니다. 완료 후, 레이저 빔은 거울의 중심부에 대략적으로 정렬되어야 하며, 현미경의 투과 광빔과 레이저 빔을 정렬하기 전 거울들은 레이저 빔 축에 대해 대략 45도로 배치되어야 합니다.중간 모듈의 ND 필터와 조리개를 모두 제거하거나 개방하십시오. 이제 부수적인 손상을 최소화하면서 축삭을 정밀하게 절단하기 위한 가장 중요한 단계를 시작하겠습니다. 가장 작은 어블레이션 스폿을 얻기 위해 최저 레이저 출력에서 x, y, z축의 레이저 정렬을 정밀하게 수행하겠습니다.레이저와 투과광 빔을 종이 위에서 동시에 확인할 수 있습니다. 먼저 종이를 현미경 포트 근처에 배치하십시오. 이제 페리스코프 상단의 거울과 레일 끝의 거울에 있는 조동 나사를 사용하여 레이저 정렬을 시작하십시오.정렬된 콘덴서 렌즈와 열려 있는 대물렌즈 터렛 사이에 종이를 놓습니다. 레일 거울의 미세 조정 다이얼을 계속 사용하여 레이저 빔을 더 큰 투과광 빔의 중심에 맞춥니다. 이제 클램프로 현미경을 고정합니다.레이저 정렬을 평가하는 추가 단계는 서면 원고에서 확인할 수 있습니다. 300 µm 레이저 빔을 33배로 확장하여 10 mm 대물렌즈의 후방 개구부를 채우기 위해 듀얼 갈릴레이 빔 확장기를 설치해야 합니다. 먼저 4개의 렌즈를 캐리어에 장착하십시오.그런 다음 모든 렌즈가 동일한 광축 상에 위치하고 레이저 빔에 정확히 수직이 되도록 레일에 부착합니다. 레이저를 켜고 출력을 최소로 조절한 뒤 연속 모드로 설정합니다. 각 렌즈를 통과하는 빔 정렬을 대략적으로 조정합니다.종이를 사용하여 빔을 확인하십시오. 이제 레이저를 끕니다. 레이저에 안전 셔터를 장착하고 레이저 빔 경로에서 현미경을 제거하십시오.레이저를 다시 켜고 근처 벽면에 투사하여 확인합니다. 렌즈의 미세 조정 다이얼을 사용하여 빔을 확장합니다. 그다음, 마지막 두 개의 키네마틱 마운트 거울을 조정하여 대물렌즈 후면 조리개의 예상 위치에 균일한 밝기의 원형 빔이 정렬되도록 합니다.종이를 사용하여 빔의 크기와 균일도를 확인하십시오. 그런 다음, 종이를 렌즈에서 더 멀리 이동시킴에 따라 빔 크기가 어떻게 변하는지 관찰하여 빔을 제로 컨버전스(zero convergence) 상태로 조정하십시오. 레이저를 끄고 기계식 셔터를 닫으십시오.고정 클램프를 사용하여 현미경을 레이저 빔 경로로 다시 밀어 넣어 정확한 정렬을 정의합니다. 현미경의 반대편에 클램프를 다시 장착하되, 꽉 조이지는 마십시오. 이제 레이저를 켭니다.안전 셔터를 제거하고 대물렌즈 터렛을 개방 위치로 회전시킨 후, 스테이지 위에 종이를 놓아 콘덴서에서 나오는 투과광 빔 중앙에 확장되고 균일한 레이저 빔이 보이는지 확인합니다. 빔이 중앙에 위치하지 않은 경우, 현미경 고정 클램프를 풀고 현미경을 조심스럽게 밀어 빔의 중심을 맞춥니다. 이제 안전 셔터를 닫고 레이저를 트리거 모드로 설정합니다.60배 대물렌즈를 제자리에서 회전시킵니다. 이제 타겟 슬라이드 상의 표면 스크래치 이미지를 촬영합니다. 안전 셔터를 제거하고, 어블레이션 레이저를 작동시킨 후, 최소 어블레이션 스팟이 생성되도록 레이저 출력을 조정합니다.스팟은 원형이어야 하며 이미지 중심, 즉 어블레이션 스팟의 중심에서 5~10 µm 이내에 위치해야 합니다. 빔 프로파일을 균일하게 유지하고 스팟을 중심에 맞추기 위해, 키네마틱 마운트 레일 미러의 미세 조절 장치를 사용하여 레일 장착 미러와 상단 페리스코프 미러를 반복적으로 조정해야 합니다. 포커스를 1 µm 단계로 체계적으로 위아래로 이동시키며 각 단계에서 어블레이션 레이저를 트리거하여 레이저의 Z 초점을 평가하십시오.빔이 올바르게 확장 및 정렬되고 수렴도가 정확하게 조정되었다면, 이미지 초점에서 최대 절제가 일어나야 하며, 초점 상단 또는 하단 1 µm 지점에서는 절제가 약하거나 전혀 일어나지 않아야 합니다. 최대 절제 지점이 이미지 초점보다 위에 있거나 아래에 있다면, 갈릴레이 망원경의 렌즈 L3를 이동시켜 레이저 절제가 이미지 초점과 일치할 때까지 확장 빔의 Z 초점을 최종 조정하십시오. 선충을 맞춤형 슬라이드에 고정하고 구축된 시스템을 사용하여 축삭을 절제하였으며, Laser exo somy 및 축삭 재생의 타임랩스 이미징 결과가 매우 견고하게 나타났습니다.전동 스테이지를 사용하여 다섯 마리의 서로 다른 동물에서 유래한 다섯 개의 축삭을 하나의 슬라이드 상에서 일상적이고 정밀하게 절단하고 이미징할 수 있었습니다. 축삭의 이미징 시간이 제한 요인이었습니다.약 10%의 실험에서 고품질의 타임랩스 영상을 얻었습니다. 나머지 실험들 또한 모두 양호한 데이터를 제공하였으나, 일반적으로 고정 후 5~8시간이 지난 시점부터 발생한 벌레의 미세한 떨림 현상으로 인해 시각적인 완성도는 다소 낮았습니다. 이 절차를 수행할 때는 x, y 및 z축의 레이저 정렬 상태를 정확하게 평가하는 것이 항상 중요합니다.축삭을 절단하려 할 때 발생하는 가장 흔한 문제는 부수적인 손상이 생기거나 축삭을 전혀 절단하지 못하는 것이며, 이는 거의 항상 레이저 정렬이 잘못되었기 때문에 발생합니다. c Agains의 축삭 재생 시각화를 위한 이 레이저 절제 시스템과 기술을 통해 유전자 변이가 축삭 재생에 미치는 영향을 일상적으로 분석할 수 있습니다. NCL Agains.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

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Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observation Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila larvae (이광자 레이저 유도 신경 손상: 초파리 유충에서 축삭돌기 퇴행 및 재생을 관찰하는 방법)

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이 비디오는 두 개의 광자 레이저 축삭 절개술을 사용하여 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 손상으로부터 축삭 회복을 관찰하는 방법을 설명합니다.

이광자 레이저 축삭 절개술: 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 축삭 회복을 관찰하는 방법

이 영상은 고출력 레이저를 이용하여 초파리 유충에서 표적 신경 손상을 유도하는 방법을 보여줍니다. 유충을 현미경으로 관찰한 후 저전력 레이저로 형광 뉴런을 스캔한 다음 레이저 출력을 높여 국소 손상을 유도합니다. 부상은 증가된 형광과 부상 부위의 분화구에 의해 확인됩니다.

Drosophila 유충에서 고출력 레이저를 사용하여 표적 신경 손상 유도

레이저 nanodissection 결합 이광자 이미징은, 세포 내 해상도 중추 신경계 퇴행성 및 재생 공정을 연구하는 유용한 도구이다. 이 프로토콜은, 라벨 이미지 및 생체 내에서 소뇌 피질에서 하나의 등반 섬유를 해부하는 방법을 보여줍니다.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

성체 예쁜꼬마선충 피부는 상처 봉합, 흉터 형성 및 선천성 면역을 포함한 상피 상처 반응을 연구하기 위한 다루기 쉬운 모델입니다.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험 C. 엘레

여기, 우리로 초파리 감각 신경- vivo에서 결합 하는 수지상 arborization (다) 신경 부상 모델, 라이브 영상, 2 광자 레이저 axotomy/dendriotomy, 그리고 강력한 비행 유전 도구 상자, 를 사용 하 여 프로토콜을 제시 잠재적인 발기인 및 neuroregeneration의 억제제 상영을 위한 플랫폼.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

형광 표지된 엔드 결합 단백질을 사용하여 생체 내의 동적 마이크로투부레를 이미징하기 위한 프로토콜이 제시되었다. 우리는 C. elegans의후방 측측 마이크로투룰 (PLM) 뉴런에서 동적 마이크로 튜브를 라벨, 이미지 및 분석하는 방법을 설명했다.

생체 내 Caenorhabditis elegans 뉴런의 미세 투덜역학 및 오리엔테이션 평가

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

배우세요 C. elegans 축삭 재생 연구를 위한 저예산 레이저 절단 시스템 구축 및 정렬 방법. 정밀한 레이저 빔 정렬로 최소한의 조직 손상으로 축삭을 절단하고 시간 경과에 따른 재생 과정을 관찰할 수 있습니다.

에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans

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