에서 축삭 재생을 연구하는 저예산 레이저 Axotomy 시스템 구축 C. elegans

이 절차의 전반적인 목표는 CL gans에서 축삭 재생을 연구하기 위해 레이저 절제 시스템을 조립하고 정렬하는 방법을 보여주는 것입니다. 이를 위해서는 먼저 레이저 글랜드, Thompson polarizer, half wave plate turning mirror, periscope rail 및 rail mirror를 브레드보드에 장착해야 합니다. 절차의 다음 단계는 레이저 빔을 microscope condenser lens에서 나가는 빔에 정렬하는 것입니다.

그런 다음 레이저 빔 확장 렌즈를 장착, 정렬 및 배치하여 레이저 빔을 중앙에 배치하고 발산을 제로로 만듭니다. 절차의 마지막 단계는 미세 조정을 통해 레이저 절제 스폿을 이미지 초점과 일치하게 만드는 것입니다. 궁극적으로, 불완전한 XY NC 정렬일 때 회절 제한 레이저 빔을 사용하여 최소한의 측부 조직 손상으로 반 미크론 축삭돌기를 정밀하게 절단할 수 있습니다.

Femto 두 번째 레이저와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 15, 000으로 상대적으로 저렴하다는 것입니다. 상대적으로 유지 보수가 필요 없으며 매우 정밀한 축삭 절단을 제공합니다. 이 방법은 바다 엘간 축삭 재생에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 파리, 제브라피시 마우스, 말초 신경계 및 체외 세포와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

기본적으로 표면에서 30-50마이크로미터 이내에 있는 모든 세포입니다. 브레드보드에 배치된 구성 요소부터 시작하여 레이저 잠망경 포스트와 고가 레일 지지대를 볼트로 고정합니다. 이 시스템은 눈을 쉽게 손상시킬 수 있는 클래스 3 B 레이저를 사용하므로 레이저 안전 안전을 중요하게 생각하십시오.

자유 빔 레이저를 안전하게 사용하는 방법에 대해 지역 물리학 부서의 누군가와 이야기하십시오. 정렬 프로세스 중에는 항상 레이저를 가장 낮은 전력으로 설정하십시오. 접안렌즈를 통해 볼 때 레이저가 기계적으로 셔터링되어 있고 레이저가 꺼져 있는지 확인하십시오.

이제 현미경을 먼저 배치하고 레일 축에 정렬합니다. 둘째, 현미경 집광 렌즈에서 투과된 광선에 맞춥니다. 셋째, 레일에 부착된 조정 가능한 조리개 또는 렌즈를 사용하여 레일의 양쪽 끝을 콘덴서 빔에 맞춥니다.

계속하기 전에 레벨과 랩 잭을 사용하여 레일 높이를 조정하십시오. 레일의 양쪽 끝이 정렬되어 있는지 확인하십시오. 이제 레이저 빔이 글랜드, Thompson 편광판 및 중간 플레이트를 통과하고 가장자리가 회전하는 것에 부딪히지 않는지 확인하십시오.

중간 플레이트는 브레드보드에 고정된 모든 구성 요소로 레이저의 출력을 조정합니다. 레이저를 켜고 펄스 주파수를 100 연속 모드로 설정한 다음 중간 플레이트를 사용하여 전력을 최소로 줄입니다. 포스트잇 또는 렌즈 용지를 사용하여 레이저 빔을 시각화합니다.

이제 브레드보드에서 레이저 빔을 위로 가져옵니다. 레이저에서 순서대로 운동학적으로 장착된 미러를 조정하고 고정하여 빔을 고가 레일의 끝에 장착된 미러로 가져옵니다. 완료되면 레이저 빔을 미러의 중심에 대략적으로 정렬해야 하며, 레이저 빔을 현미경의 투과광 빔에 정렬하기 전에 미러를 레이저 빔 축에 대해 대략 45도 각도로 정렬해야 합니다.

중간 모듈에서 ND 필터와 조리개를 제거하거나 엽니다. 이제 우리는 과도한 부수적 손상 없이 축삭을 정밀하게 절단하기 위한 가장 중요한 단계를 시작합니다. 가장 낮은 레이저 출력에서 x, y, Z 축의 레이저를 정밀하게 정렬하여 가장 작은 절제 지점을 제공할 것입니다.

레이저와 투과된 광선은 종이에 대해 동시에 볼 수 있습니다. 시작하려면 현미경 포트 근처에 용지를 놓습니다. 이제 잠망경 상단의 거울과 레일 끝에 있는 거울의 코스 조정을 사용하여 레이저를 정렬하기 시작합니다.

정렬된 콘덴서 렌즈와 열린 대물렌즈 포탑 사이에 종이를 놓습니다. 레일 미러의 미세 조정을 계속 사용하여 레이저 빔을 더 큰 투과 광선의 중앙에 정렬합니다. 이제 클램프로 현미경을 제자리에 고정하십시오.

레이저의 정렬을 평가하는 추가 단계는 작성된 원고에서 찾을 수 있습니다. 300mm 대물렌즈의 후면 조리개를 채우기 위해 300미크론 레이저 빔을 33배 확장하려면 이중 갈릴레이 빔 확장기를 설치해야 합니다. 먼저 4개의 렌즈를 캐리어에 장착합니다.

그런 다음 렌즈를 레일에 부착하여 모두 동일한 광축에 있고 레이저 빔과 정확히 직각을 이루도록 합니다. 레이저를 켜고 최소 전력과 연속 모드로 조정하십시오. 각 렌즈를 통해 빔 정렬을 대략적으로 조정합니다.

종이를 사용하여 빔을 확인합니다. 이제 레이저를 끕니다. 레이저에 안전 셔터를 적용하고 레이저 빔의 경로에서 현미경을 제거합니다.

레이저를 다시 켜고 근처 벽에 대해 시각화합니다. 렌즈의 미세 조정을 사용하여 빔을 확장하십시오. 그런 다음 마지막 두 개의 운동학적으로 장착된 미러를 조정하여 대물렌즈 후면 조리개의 예상 위치에서 균일한 밝기의 원으로 빔을 정렬합니다.

종이에 대한 빔의 크기와 균일성을 봅니다. 그런 다음 종이가 렌즈에서 멀어짐에 따라 빔 크기가 어떻게 변하는지 확인하여 빔을 0 수렴으로 조정합니다. 레이저를 끄고 기계식 셔터를 작동시킵니다.

고정 클램프를 사용하여 현미경을 레이저 빔 경로로 다시 밀어 넣어 올바른 정렬을 정의합니다. cl 교체amp현미경의 다른 쪽에 있지만 단단히 조이지 마십시오. 이제 레이저를 켭니다.

안전 셔터를 제거하고 대물렌즈 포탑을 종이를 사용하여 열린 위치로 회전합니다.tage 및 콘덴서에서 투과된 광선을 중심으로 확장되고 균일한 레이저 빔이 보여야 합니다. 중앙에 있지 않은 경우 현미경 cl을 풀어 빔의 중심을 잡습니다.amps를 누르고 현미경을 조심스럽게 살짝 밀어 넣습니다. 이제 안전 셔터를 잠그고 레이저를 트리거 모드로 설정합니다.

목표를 제자리에서 60회 회전합니다. 이제 대상 슬라이드의 표면 긁힘 이미지입니다. 안전 셔터를 제거하고 절제 레이저를 트리거하고 최소 절제 지점에 대한 레이저 출력을 조정합니다.

스폿은 원형이어야 하며 이미지 중앙, 중앙, 절제 스폿에서 5-10미크론 이내에 있어야 합니다. 스폿을 중앙에 유지하고 빔 프로파일을 균일하게 유지하기 위해 운동학적으로 장착된 레일 미러의 미세 조정을 사용하여 레일 장착 미러와 상단 잠망경 미러를 반복적으로 조정해야 합니다. 초점을 1미크론 단계로 체계적으로 위아래로 움직여 레이저의 Z 초점을 평가하고 각 단계에서 절제 레이저를 트리거합니다.

빔이 올바르게 확장 및 정렬되고 올바르게 조정된 수렴으로 이루어지면 이미지 초점에서 최대로 절제되어야 하며 초점보다 1미크론 높거나 낮아야 합니다. 최대 절제 지점이 이미지 초점의 위 또는 아래에 있는 경우 레이저 절제가 이미지 초점과 일치할 때까지 갈릴레이 망원경의 렌즈 L 3을 이동하여 확장된 빔의 Z 초점을 최종 조정합니다. 선충은 맞춤형 슬라이드에 장착되었으며 구성된 시스템인 Laser exo somy를 사용하여 축삭을 절제했으며 축삭 재생의 타임 랩스 이미징은 매우 강력했습니다.

전동 스테이지를 사용하여 5개의 서로 다른 동물에서 5개의 축삭을 일상적이고 정확하게 절단하고 이미지화할 수 있었습니다. 단일 슬라이드에서. 축삭돌기의 이미징 시간이 제한 요인이었습니다.

약 10%의 실험에서 고품질 타임랩스 영상이 제작되었습니다. 나머지 실험들은 모두 좋은 데이터를 제공했지만, 일반적으로 5-8시간 동안 움직이지 못한 후에 시작되는 벌레의 작은 떨림 움직임 때문에 미학적으로 덜 매력적이었다. 이 절차를 시도하는 동안 x, y 및 Z축에서 레이저의 정렬을 정확하게 평가하는 것이 항상 중요합니다.

사람들이 축삭돌기를 절단하려고 할 때 겪는 가장 일반적인 문제는 부수적 손상 또는 축삭돌기를 절단할 수 없는 것이며, 이는 거의 항상 잘못 정렬된 레이저로 인한 것입니다. c Agains에서 축삭 재생을 시각화하기 위한 이 레이저 절제 시스템 및 기술을 사용하면 축삭 재생에 대한 모든 유전적 돌연변이의 영향을 일상적으로 분석할 수 있습니다. NCL 다시.