Name: 패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 + 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 망막 조각을 아가로스에 포장하여 양극성 세포 신경 말단의 미세회로를 연구하는 방법을. 패치-클램프 기법으로 단일 시냅스 말단에서 직접 전기생리학 기록을 수행할 수 있습니다.

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우리가 실험실에서 프로토콜을 사용하여 시작할 때 우리는 한천 - 임베디드 망막 슬라이스 준비 그의 종류 설명 박사 프레드 Rieke 감사합니다. 우리는 또한 도식 개요 및 Drs의 그림에 대한 로리 Vaskalis 주셔서 감사합니다. 텍스트 및 비디오에 도움이 덧글에 대한 Veeramuthu Balakrishnan과 Soyoun 조. 이 작품은 네이 - NIH RO1 교부금에 의해 지원되었고, 또한 부분적으로 한국 정부에 의해 자금을 한국 학술 진흥 재단 그랜트에 의해 지원되었다 [KRF - 2008-357 - E00032].

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</ol>

우리는 공개 경쟁 관심이 없습니다.

우리의 프로토콜에서 중요하고 어려운 단계는 한천 용액 (3.4 프로토콜)에 망막의 작품의 전송이다. 그것은 조심스럽게 망막 조각에서 유리체 유머와 잔여 슬라이스 솔루션을 제거하고 왜곡이나 굴곡없이 전송하는 것이 필요합니다. 이것을 달성하기 위해, 우리는 제보가 망막을 위치에 직각 팁 포셉 (11251-35, 파인 과학 도구)와 함께, 90 ° 각도를 형성하기 위해 구부리고 작은 주걱을 (21-401 - 25B, Fisherbrand)을 사용 슬라이스 솔루션의 전송 과정에서 조각. 망막 슬라이스와 주걱에 잔류 슬라이스 솔루션은 접혀 또는 압연 Kimwipes (킴벌리 클락)의 모서리와 표면의주의 dabbing하여 제거할 수 있습니다. 가로 망막 조각을 준비하는 또 다른 일반적인 방법은 필터 종이 기반 프로토콜 23입니다. 간단히, 전체 망막의 반전 부분은 Millipore 필터 디스크의 사각형 조각 (신경절 세포가 누워에 첨부되...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 낮은 겔화 온도 한천 </td><td> 시그마 </td><td> A0701 </td><td> 아가로 오스 유형 VII - A </td></tr><tr><td> 패치 피펫 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B150F - 4 </td><td> 두꺼운 벽으로 둘러싸인 (1.5 mm 외경) borosilicate 유리 </td></tr><tr><td> 수직 풀러 </td><td> Narishige </td><td> PP830 </td><td></td></tr><tr><td> 치과 왁스 </td><td> Cavex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 봄 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15003-08 </td><td></td></tr><tr><td> 45 ° 직각 좋은 팁 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> 면도날 </td><td> Personna </td><td></td><td> 양날, 70 % 에탄올과 H 2 O로 세척 </td></tr><tr><td> 원통형 튜브 </td><td> Fisherbrand </td><td> 03-338 - 1B </td><td> 폴리에틸렌 샘플 튜브 2.5 ML </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> 시그마 </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome 슬라이 </td><td> Leica </td><td> VT1000S 또는 VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> 직립 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> BX51WI </td><td></td></tr><tr><td> 60x 물 침지 목표 </td><td> 올림포스 산 </td><td> LUMPlanFl </td><td> NA 0.90 </td></tr><tr><td> CCD 카메라 </td><td> 소니 </td><td> XC - 75 </td><td></td></tr><tr><td> 카메라 컨트롤러 </td><td> 하마 마츠 </td><td> C2400 </td><td></td></tr><tr><td> 모니터 &lt;/ TD&gt; <td> 소니 </td><td></td><td> 13 &quot;흑백 모니터 </td></tr><tr><td> 주사기 필터 </td><td> Nalgene </td><td></td><td> 0.2 μm의 </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> 셔터 악기 </td><td> MPC - 200 </td><td></td></tr><tr><td> 잠금 기능 증폭기 </td><td> HEKA </td><td></td><td> EPC-9/10 증폭기는 소프트웨어 에뮬레이션을 가지고 </td></tr><tr><td> 회전 디스크 레이저 공촛점 현미경 </td><td> Yokogawa </td><td> CSU - X1 </td><td> 패치 후 라이브 세포 이미징은 전체 휴대폰 녹음 클램프 </td></tr><tr><td> Slidebook 소프트웨어 </td><td> 지능형 이미징 인 스트 루먼트 (3i) </td><td></td><td> 이미징 데이터 수집 및 분석 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 용액 </td><td> 노병BCO </td><td> 70,013 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost 슬라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td></td><td> 슬라이드 유리 </td></tr><tr><td> 안티 페이딩 대리인 </td><td> Biomeda 법인. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 </td><td> LSM 710 </td><td> 고정 조직의 영상 </td></tr><tr><td> 주걱 </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-401 - 25B </td><td></td></tr><tr><td> 마누엘 수직 슬라 이서 </td><td> Narishige </td><td> ST - 20 </td><td></td></tr><tr><td> 오레곤 그린 488 BAPTA - 1 </td><td> Invitrogen </td><td> O - 6806 </td><td> 칼슘 2 + 민감한 형광 염료 </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 555 히드라 지드 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 20501MP </td><td> 형광 염료 </td></tr></tbody></table>

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 ca 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

시각적 자극은 척추 망막 전문 뉴런에 의해 빛의 강도 및 주파수 변화 넓은 동적 범위에서 감지하고 전달하고 있습니다. 망막 뉴런, photoreceptors 및 바이폴라 전지의 두 클래스는 오랜 기간 동안 지속과 높은 처리량 신경 전달 물질 자료를 활성화 리본 타입의 활성 영역을 사용하여이 작업을 수행할. 빛의 자극에 depolarize 및 혼합로드 및 원뿔 photoreceptor 입력을받을 금붕어 망막에서 타입의 혼합 바이폴라 셀 (MB) 터미널, 그들의 큰 크기로 인해 모두 리본 타입의 시냅스 (~ 10-12의 연구에 적합 μm의 직경)와 amacrine 세포 dendrites 자신의 여러 측면과 상호 시냅스 연결합니다. 패치 - 클램프 기법과 금붕어 망막 조각에서 MB 바이폴라 전지 터미널에 직접 액세스 presynaptic 칼슘 2의 측정을 허용 + 전류, 멤브레인 용량 변경, GABA에 의해 중재 상호 시냅스 피드백 억제 &lt;서브&gt; A 및 GABA C 수용체가 터미널에 표시됩니다. exocytosis의 Presynaptic 막 커패시턴스 측정 하나는 흥분성의 신경 전달 물질 방출 14,15의 단기 소성을 공부하실 수 있습니다. 또한, amacrine 세포의 억제 신경 전달 물질 방출의 단기 및 장기 소성도 MB 터미널 21에 도착 상호 피드백 억제의 기록 조사 수 있습니다. 시간 (예 : ~ 10들)의 짧은 기간 동안 amacrine 세포에서 GABAergic 상호 피드백 억제는 GABA 소포 풀 고갈 11을 통해 이점 - 펄스 우울증을 겪습. 망막의 내부 plexiform 계층에서 망막 microcircuits의 시냅스 역학 따라서 직접적으로 공부하실 수 있습니다. 두뇌 - 슬라이스 기술은 40 년 이상 전에 발표했지만 여전히 매우 모두 하나의 세포 소마 단일 dendrite 또는 축삭에서 뉴런의 전기적 특성의 조사에 유용하고, m가되었습니다icrocircuit 시냅스 레벨 19. 깔끔히 챔버에 직접 접착 너무 작은 조직은 종종 첫번째 한천에 포함된 (또는 필터 종이에 위치) 그리고 20, 23, 18, ​​9 슬라이스하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 금붕어 망막을 사용하여 미리 포함 한천 기술을 사용합니다. 금붕어 망막 우리의 조각에있는 거대한 바이폴라 셀 단말기의 일부가 깔끔히 절차를 수행하는 동안 (축삭 절단) axotomized 있습니다. 이것은 axotomized 터미널에서 녹화가 소마 - 돌기 구획에서 신호를 배제하기 때문에 우리, 하나 presynaptic 신경 터미널 입력을 분리 할 수​​ 있습니다. 또한, 하나도 깔끔히 절차를 수행하는 동안 컷되지 않은 axons에 연결된 터미널에서 기록하여, 손상 MB 바이폴라 세포에서 녹화할 수 있습니다. 전반적으로,이 실험 프로토콜의 사용이 망막 신경 생리학, microcircuit 기능 분석 및 리본 시냅스에서 시냅스 전달 연구에 도움이됩니다.

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

시각 자극은 척추동물의 특수 뉴런에 의해 광강도의 넓은 동적 범위와 주파수 변화에 걸쳐 감지되고 전달됩니다.

본 절차의 전반적인 목적은 시냅스 전 양극세포 신경 말단에 위치한 미세 회로를 연구하기 위해 아가(agar)에 매립된 망막 절편을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 암적응된 금붕어의 눈에서 망막을 적출하고, 이 망막에서 작은 직사각형 조각을 절단함으로써 수행됩니다. 그 후, 망막 조각을 투명하고 융점이 낮은 아가 용액에 담근 다음, 적절히 냉각된 절편 용액 내에서 응고시킵니다.다음 단계는 진동 절편기를 사용하여 직사각형 모양의 망막 조각이 포함된 고체 아가로스 블록을 절편하는 것입니다. 마지막 단계는 시각화, 식별 및 패치 과정입니다. 양극 세포 신경 말단을 고정하십시오.최종적으로, 분무 및 온전한 양극세포 말단으로부터의 막 정전용량 측정을 통해 시냅스 전 칼슘 전류와 시냅스 물리적 엑소사이토시스 결과가 나타납니다. 안녕하세요, 제 이름은 Han Kim입니다. 저는 Burham Institute의 PCO 연구실 박사후연구원입니다.오늘은 금어의 망막 냉각 절편 준비법을 소개하고, 단일 파이프라인에서의 패치 클램프 커패시턴스 측정을 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면, 스프링 가위로 안구 앞부분을 고르게 절단하여 금어의 각 안구를 절반으로 나눕니다. 그런 다음 안구 컵을 칼슘이 포함되지 않은 냉각 절편 용액에 넣습니다.필요한 경우 핀셋으로 수정체를 제거합니다. 다음으로, 45도 각도의 미세 팁 포셉을 사용하여 안구 컵에서 망막을 벗겨내어 망막에 부착된 색소 상피를 제거합니다. 그 후, 미세 포셉이나 스프링 가위를 사용하여 시신경을 절단합니다.그 다음, 변형된 파스퇴르 피펫이나 대용량 팁 전이 피펫을 사용하여 흡입합니다. 망막을 제거하려면 망막에 부착된 나머지 색소 상피를 조심스럽게 제거하십시오. 세척된 건강한 망막의 표면은 매끄럽게 보여야 합니다.그 다음, 분리된 망막을 약 0.03% 농도의 IDE로 상온에서 15분에서 30분 동안 처리합니다. 유리체를 제거할 때, 이 과정은 낮은 조도 하에서 수행해야 함에 유의하십시오. 다음 단계에서는 면도날로 곡선형 가장자리를 제거하여 망막의 전체 두께가 포함된 약 2x2 mm 크기의 직사각형 망막 조각을 절단합니다.그다음 망막 조각을 한천 용액이 채워진 작은 용기에 옮기고, 액체 한천에 넣을 때 망막 주변의 용액 양을 최소화하십시오. 이어서, 한천이 굳을 수 있도록 한천이 포함된 망막을 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액에 직접 침전시킵니다. 다음으로, 직사각형 모양의 망막 조각이 포함된 고체 한천 블록을 1x1x1 cm 크기의 정육면체로 절단하십시오.블록을 preco 슬라이스 챔버의 슬라이싱 플레이트 표면에 접착합니다. 그다음, 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액 내에서 블록을 200에서 250 µm 두께의 슬라이스로 절편합니다. vibrato를 사용하여 총 5~10개의 슬라이스를 얻을 수 있으며, 이는 약 5~6시간 동안 생존 가능합니다.그 후, 슬라이스 중 하나를 기록 챔버로 옮깁니다. 나일론 실 그리드가 부착된 U자형 백금 프레임을 슬라이스 위에 배치합니다. 카보젠(carbogen)으로 포화시킨 기록 용액을 분당 1~2 mL의 속도로 슬라이스에 지속적으로 관류합니다.이 단계에서는 0.2 micron 필터 팁이 장착된 주사기를 사용하여 유리 패치 피펫에 내부 용액을 피펫 끝부분으로부터 1~2cm 높이까지 채웁니다. 그 후 팁에서 기포를 제거합니다. 피펫을 홀더에 고정합니다.피펫에 양압을 가하고 마이크로 조작기를 사용하여 팁을 슬라이스 방향으로 내리면서 목표 말단(terminal) 쪽으로 이동시킵니다. 팁에 의해 슬라이스가 함께 끌려가지 않도록 피펫을 측면으로 쓸어내리듯 이동시킵니다. 그 다음, 말단 주변으로 피펫 팁을 움직여 막 표면을 세척합니다.팁을 단말의 가장자리에 대고 아래로 눌러 딤플(dimple)을 만든 후 양압을 해제합니다. 기가옴 씰(giga ohm seal)이 즉시 형성되지 않으면 피펫에 약간의 음압을 가합니다. 기가옴 씰이 형성되면 EPC-9 패치 클램프 증폭기를 온셀(onsell) 기록 모드로 전환하고 유지 전위를 -60 또는 -70 mV로 변경합니다.빠른 커패시턴스 보정(fast capacitance correction)을 적용하고 씰(seal)이 5~10 GΩ 사이에서 안정화될 때까지 기다립니다. 그 후, 날카롭고 부드러운 흡입을 통해 막을 파열시켜 전체 세포 기록(whole cell recording) 구성을 수립합니다.주사기 대신 입 흡입(mouth suction) 방식을 사용할 수도 있습니다. 원자화된 MB 단자에 전체 세포 구성(whole cell configuration)이 설정되면, -70 mV에서 0 mV까지 200 millisecond의 단계적 탈분극을 가합니다. 이 탈분극 전후에 전압 클램프 모드에서 2 kHz 사인파가 인가된다는 점에 유의하십시오. 막 커패시턴스를 측정하기 위해, 이 탈분극 단계에서는 세슘 기반 내부 용액을 사용하여 전압 개폐 L형 칼슘 채널의 개방으로 활성화되는 내향 칼슘 전류를 직접 측정할 수 있습니다.이와 동시에, 막 표면적을 증가시키는 시냅스 소포의 칼슘 의존적 엑소사이토시스(exocytosis)로 인해 발생하는 정전용량(capacitance)의 급증을 모니터링할 수 있습니다. 손상되지 않은 MB 양극세포의 시냅스 말단에 피펫으로 패치 클램프를 수행할 경우, MB 양극세포의 간극 연접 결합(gap junction coupling)으로 인한 큰 누설 전류 때문에 뚜렷한 칼슘 전류는 관찰되지 않습니다. 이때 관찰되는 것은 커다란 외향성 누설 유사 전류입니다.하지만, 제시된 탈분극 단계의 전후로 활성화된 고주파 사인파 자극을 통해 정전 용량 점프(capacitance jump)를 여전히 모니터링할 수 있습니다. 다음은 M 양극 세포 말단의 I-R-D-I-C 예시 이미지입니다. 온전한 말단은 A와 B에서 보는 바와 같이 타원형으로 나타날 가능성이 높은 반면, C는 둥근 원형으로 보이는 혼합 말단을 보여줍니다.염료 충전법은 세포 말단을 분류하는 데에도 사용할 수 있습니다. 여기 D에서는 축삭이 온전한 MBI 양극 세포 말단, e에서는 축삭이 부분적으로 절단된 경우, F에서는 축삭이 완전히 제거된 경우의 형광 이미지 예시를 보여줍니다. 이들의 말단 부위는 파란색 화살표로 표시되어 있습니다. 여기서는 칼슘 이미징 신호의 엑소사이토시스와 억제성 피드백의 직접 측정 결과가 제시되어 있습니다.MB 양극 세포 말단에서, MB 말단 텔레리아(teleria) 내의 일시적인 칼슘 농도 상승은 전압 클램프 단계 탈분극에 의해 활성화되었으며, 이에 해당하는 MB 텔레리아의 형광 이미지는 B에서 확인할 수 있습니다. 신경전달물질 방출의 단기 시냅스 억제 예시는 C에 나타나 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 망막을 키트 한천(agar)에 배치할 때 망막 주변의 용액 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 이는 한천 블록에서 라틴화(Latinized)의 부착력을 향상시킵니다.

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신경과학

칼리에서 패치 클램프 커패시턴스 레코딩을위한 방법

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

이 비디오는 플랫 마운트 마우스 망막에서 전기 생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 전극이 있는 얇은 유리 피펫을 사용하여 망막 내의 별방울 무축삭 세포(SAC)에 접근합니다. 씰을 형성한 후 흡입이 가해져 멤브레인을 파열하고 전체 세포 패치 클램프 구성을 형성합니다. 마지막으로, SAC 시냅스 수용체를 통한 이온의 흐름은 구성을 사용하여 측정됩니다.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

이 비디오는 뇌 절편을 고정하고, 전체 세포 구성을 달성하기 위해 피펫을 배치하고, 시냅스후 반응을 기록하도록 시냅스전 뉴런을 자극하여 뉴런 연결을 매핑하는 절차를 보여줍니다.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices(급성 뇌 절편에서 뉴런 연결의 쌍을 이룬 패치 클램프 기록)

이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

8 시간 - 몸에서 제거되면, 신경 조직은 크게 6 후 조직의 궁극적 인 저하로 이어지는, 환경 조건에 의해 영향을 받는다. 밀접하게 모니터링하고, 조직의 세포 외 환경을 조절하는 독특한 배양 방법을 사용하여 조직 생존을 현저&gt; 24 시간 동안 연장 될 수있다.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

여기에서, 우리는 측방 geniculate 핵을 포함하는 급성 두뇌 조각의 준비를 위한 프로토콜 및 망막 생성 성 및 코르티코겐iculate 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사를 제시합니다. 이 프로토콜은 동일한 급성 뇌 슬라이스에서 높은 방출 및 낮은 방출 확률로 시냅스를 연구하는 효율적인 방법을 제공합니다.

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

망막 보철물은 시각적 지각을 생성하는 능력이 있습니다. 새로운 보철물의 개발을 앞당기기 위해서는 이식 전에 장치를 테스트하기 위한 생체 외 방법이 필요합니다. 이 논문은 전기 자극을 받았을 때 망막 신경절 세포층의 칼슘 활성을 연구하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

동적 클램프 전기생리학은 신경 발화 결함과 이온 채널 기능 장애 사이의 인과 관계를 확립할 수 있습니다. 우리는 마우스 소뇌 푸르킨제 뉴런의 동적 클램프 방법 및 프로토콜을 설명하고 유용한 리소스와 기술적 고려 사항을 언급합니다. 대표적인 연구에서 우리는 반복적인 발화를 구출하기 위해 Tsc1-/- Purkinje 뉴런에 모델링된 나트륨 전도도를 추가합니다.

자폐증과 관련된 손상된 신경 흥분성을 조사하기 위한 동적 클램프 방법

배우세요 망막 조각을 아가로스에 포장하여 양극성 세포 신경 말단의 미세회로를 연구하는 방법을. 패치-클램프 기법으로 단일 시냅스 말단에서 직접 전기생리학 기록을 수행할 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA^{2 + 영상}

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