배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서

이 실험 절차의 전반적인 목적은 발달 중인 도파민성 뉴런을 분석하기 위해 E 12.5 배아 중뇌에서 기관형 절편(organotypic slices)을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 배아 뇌를 해부한 후, 뇌를 저융점 aeros에 매립함으로써 수행됩니다.

세 번째 단계는 진동 절편기(vibrator)를 사용하여 뇌 슬라이스를 절편하는 것입니다. 마지막 단계는 배양 및 타임랩스 이미징에 적합한 뇌 슬라이스를 선택하는 것입니다. 최종적으로, 타임랩스 이미징과 면역형광 현미경법을 통해 도파민성 뉴런의 초기 단계, 이동 행태 및 분화를 보여줍니다.

이 방법은 발달 중인 복측 뇌에서의 뉴런 및 이동 행동 추적과 같이 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 해부 전날, 1X Krebs 완충액을 준비하고, 해부 약 2시간 전에 동반된 원고에 따라 배양 배지를 준비하십시오. Krebs 완충액에 4% 저융점 아가로스를 100밀리리터 준비하되, 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지로 가열하십시오.

그 후 aros를 45°C 항온수조에 넣습니다. 다음으로, Vibram 버퍼 트레이에 차가운 Krebs 버퍼를 채웁니다. 냉각 장치를 켜고 4°C로 유지합니다.

그 후, 블레이드 캐리어에 면도날을 고정합니다. 나중에 진동기 영역에서 절편을 수거하여 섹셔닝(sectioning)하는 데 사용할 메스, 세밀한 붓, 그리고 미세 천공 스푼을 준비합니다. 그런 다음, 멸균 페트리 접시에 Krebs 완충액을 넣고 얼음 위에 보관합니다.

해부 영역에서, 해부용 대형 멸균 페트리 접시 3개와 임베딩용 소형 멸균 페트리 접시 2개, 소형 가위 한 쌍, 미세 핀셋 두 쌍, 미세 타공 스푼, 끝이 둥글게 가열 연마된 유리 파스퇴르 피펫, 그리고 얼음에 둔 1L의 Krebs buffer를 준비하십시오. 모든 해부 도구를 70% ethanol로 닦아내십시오. 다음으로, 6-웰 플레이트의 각 웰에 배양액을 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양하십시오.

다음으로, 멸균 상태에서 다른 6-웰 플레이트의 각 웰에 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 Krebs 완충액 1.5 milliliters를 넣습니다. 웰에 밀리 세포막 인서트를 배치합니다. 뇌 절편을 필터 막으로 옮길 수 있도록 6-웰 플레이트를 바이브라톰 옆에 둡니다.

절단 직후, 배아 단계가 E 12.5인 임신한 암컷 생쥐를 희생시키고 핀셋으로 자궁을 들어 올려 적출합니다. 그런 다음 다른 핀셋을 사용하여 자궁에서 자궁근층을 떼어냅니다. 이후 자궁을 현미경 하의 차가운 Krebs 완충액에 넣습니다.

미세 핀셋을 사용하여 배아로부터 자궁의 근육벽, 리커 막(riker's membrane) 및 내장 난황낭을 분리합니다. 그런 다음 배아를 자궁에서 꺼내어 멸균된 Krebs 완충액이 담긴 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 이어서 각 배아의 머리 부분을 절단합니다.

미세 핀셋을 사용하여 안구 높이에서 머리를 관통시켜 고정합니다. 다른 핀셋을 사용하여 피부와 두개골을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 뇌를 조심스럽게 들어 올려 멸균된 Krebs 버퍼가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다.

그 후, 4% 저융점 agarose로 뇌를 세척합니다. 4% 신선한 저융점 agarose에 뇌를 한 번에 2~3개씩 넣습니다. 이때 끝을 불로 가공하여 둥글게 만든 파스퇴르 피펫을 사용하십시오.

그 다음, 임베딩 디쉬를 얼음 위에 최대한 평평하게 배치합니다. 이어서, aros 바닥면이 응고될 때까지 뇌를 들어 올려 뇌가 균일하게 안착되어 aros 블록의 바닥과 평행이 되도록 합니다. aros가 완전히 응고되면 뇌 주변의 aros를 다듬어 줍니다.

그 후, 블록을 진동 절편기의 시료대에 고정합니다. 블록을 고정할 때 뇌의 복측면이 플랫폼과 평행하도록 하십시오. 주파수 50 hertz, 칼날 진폭 1.1 millimeters, 속도 25 millimeters per second의 조건으로 300 micron 두께의 수평 절편을 제작합니다.

세밀한 붓을 사용하여 뇌 절편을 미세 천공 스푼으로 밀어 수집합니다. 그다음 현미경 하에서 멸균된 얼음 냉각 Krebs 완충액이 담긴 배양 접시로 절편을 옮깁니다. 복측 중뇌 조직이 포함된 절편을 선택합니다.

이 단계에서는 미세 타공 스푼과 세밀한 붓을 사용하여 뇌 절편을 미리 준비한 Krebs 버퍼가 담긴 6-웰 플레이트의 밀리셀 멤브레인 인서트로 옮깁니다. 다음으로, 절편이 놓인 멤브레인을 배양이 담긴 다른 6-웰 플레이트로 옮기며, 뇌 절편이 아래에서는 배지를 공급받고 위에서는 공기에 노출될 수 있도록 멤브레인 상단은 건조한 상태로 유지합니다.

절편을 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 배양기에 넣습니다. 해부의 첫 단계 후 2시간 이내에 절편을 배양기에 넣는 것이 매우 중요합니다. 이 절편들은 in vitro에서 3~4일 동안 유지될 수 있습니다.

4~5시간 동안 회복시킨 후, 이미징 직전에 슬라이스를 타임랩스 이미징에 사용할 수 있습니다. 광독성으로부터 슬라이스를 보호하기 위해 1.5 µL의 200 mM 아스코르브산(ascorbic acid)을 디쉬에 첨가하십시오.

타임랩스 이미징(time-lapse imaging)을 수행하는 동안 슬라이스를 37°C, 5% 이산화탄소 농도의 환경 챔버에서 배양하십시오. 여기는 전뇌로 향하는 투사(projection)가 아직 발달하지 않은, 복측 중뇌의 도파민성 뉴런의 일반적인 위치를 보여주는 급성 슬라이스입니다. 배양 하루 후, 노란색 화살표로 표시된 것과 같이 전뇌로 향하는 투사가 형성되기 시작합니다.

흰색 화살표는 삽입도의 고배율 이미지에서 보여지는 세포체의 위치를 나타냅니다. 여기에는 YFP로 표지된 뉴런의 이동 경로가 나와 있습니다. 급성 수평 절편에서 세포의 초기 위치는 빨간색 화살표로 표시되었습니다.

본 영상을 시청한 후, 생존 가능한 온전한 절편을 얻기 위해 E 12.5 해양 배아 중뇌에서 유전자형 절편을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 배아 뇌의 박리를 주의 깊게 수행하는 것과, 배양 및 타임랩스(TimeLapse) 이미징을 위해 진동 절편기(vibratome) 섹셔닝 후 적절한 뇌 절편을 선택하는 것이 중요합니다.