Name: 배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 배우세요 E12.5 마우스 배아 중뇌에서 오가노타이픽 슬라이스 배양법을 통해 도파민성 뉴런의 발달과 이동 행동을 연구하는 방법입니다. 타임랩스 이미징과 면역형광 현미경을 활용하여 신경발달 역학을 분석할 수 있습니다.

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우리는 organotypic 슬라이스 문화 시스템 볼프강 Hübner와 원고의 중요한 읽기위한 Liviu 가브리엘 Bodea를 확립 그들의 도움 마틴 Emond와 이사벨 Brachmann 감사드립니다. 우리는 쉬 CreER 마우스에 대한 R26 기자의 마우스와 클리프 Tabin에 대한 프랭크 Costantini 감사하고 싶습니다. 이 연구는 북 - 라인 베스트 팔렌 (Programm zur Förderung 데르 Rückkehr DES wissenschaftlichen Spitzennachwuchses 호주 민주 공화국 Ausland)의 과학 연구의 교육부에서 연구 수상에 의해 투자되었다.

이 프로토콜의 일부는 Daza 외에서 수정할 수 있습니다. 2007 년 7. 1. 준비 <ol><li> 사전에 일일 준비할 수 <ol><li> : 1X Krebs 버퍼 (1.5 L)를 준비 126 MM NaCl, 2.5 MM KCl, 1.2 MM은 아니 2 PO 4 : H 2 O, 1.2 MM MgCl 2, 2.5 MM CaCl 2, 11 MM 포도당, 25 MM NaHCO 3, 7.4로 산도를 조정합니다. 소독 필터 (0.22 μm의 기공 크기)와 4 저장 ° C. </li><li> 5 ML의 HBSS, 9 ML DMEM 높은 포도당, 30 % 포도당을 850 μL, 5 ML 말 혈청 (25 %) : 문화 매체를 (20 ML) 준비합니다. 200 μL 100X Penicllin / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 4 저장 ° C. </li></ol></li><li> 절개를 시작하기 전에 준비 <ol><li> 1X Krebs 버퍼 4퍼센트 낮은 용융 아가로 오스 (LMP 아가로 오스) 100 ML 준비 : 전자 레인지 솔루션을 아가로 오스가 완전히 해산 후 45 ° C 물 목욕으로 아가로 오스를 배치 때까지. </li><li> vibra을 채워메 버퍼 얼음처럼 차가운 1X Krebs 버퍼와 트레이 (4 ° C에서 보관) 냉각 요소를 시작합니다. 블레이드 캐리어와 메스, 좋은 붓을와 조각을 데리러 미니 구멍 스푼으로 설정 vibratome 지역의 면도날을 수정. 조각을 모으기위한 1X Krebs 버퍼와 함께 멸균 배양 접시를 (35 × 10 ㎜) 준비합니다. 얼음 계속. </li><li> 해부에 대한 무균 배양 접시 (100 X 15mm)과 작은 멸균 배양 접시 (35 X 10mm) 포함을 위해, 작은 가위, 두 훌륭한 포셉 (뒤몽 5), 미니 구멍 스푼, 유리 해부 영역을 설정 원형과 광택 파스퇴르 피펫 화재 얼음이 제보 및 1X Krebs 버퍼 1 L를 마감했다. 70 % 에탄올로 모든 해부 도구를 닦아주십시오. </li><li> 여섯 잘 플레이트 (1.5 ML / 음)의 우물에 배지를 추가하고 37 ° C 배양기에 배치합니다. </li><li> 1.5 ML / 잘 멸균 1X Krebs 버퍼와 15 μL Penicilin / 스트렙토 마이신 (100X) / 잘있는 여섯 잘 접시를 준비합니다. 무균 조건 하에서, 밀 배치우물에 licell의 세포 배양 삽입. 뇌 조각은 즉시 sectioning 후 필터 세포막에 전송할 수 있도록 vibratome 옆에있는 여섯 잘 접시를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 2. 해부 및 배아 두뇌 퍼가기 <ol><li> isoflurane을 사용하여 임신 여성 마우스를 마취하고 경추 전위 (배아는 무대 E12.5에 있어야 함)하여 마우스를 희생. 집게와 함께 자궁을 당기는하여 마우스의 자궁을 절개하다. 자궁에서 멀리 mesometrium을 구분하기 위해 다른 집게를 사용하십시오. 얼음처럼 차가운 1X Krebs 버퍼에있는 자궁을 놓습니다. 배아의 자궁, Reichert의 막이와 내장 난황의 근육 벽을 분리하는 훌륭한 집게를 사용하십시오. 자궁에서 태아를 제거합니다. 멸균 1X Krebs 버퍼와 함께 별도의 페트리 접시에 해부하는 배아를 놓습니다. </li><li> stereomicroscope에서 머리를 절개하다. 두뇌를 해부하다하려면 먼저 배아의 머리를 잘라. 머리를 수정머리 (눈높이)를 통해 미세 집게를 관통하여. 조심스럽게 피부와 두개골을 제거하는 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 조심스럽게 머리를 밖으로 리프트 및 살균 1X Krebs 버퍼가있는 페트리 접시에 그것을 전송하는 집게를 사용하십시오. 이것은 뇌 조직에 손상이 vibratome에 sectioning 도중 문제 (예 : 조직 분쇄 등) 만들 수 있기 때문에 전체 뇌의 무결성이, 해부 동안 유지하는 것이 매우 중요합니다. </li><li> 한번 4퍼센트 낮은 용융 점 (LMP) 아가로 오스의 머리를 씻으십시오. 신선한 4% LMP 아가로 오스에 한 번에 2-3 머리를 삽입할 수 있습니다. 가능한에도 얼음에 포함 요리를 놓습니다. 아가로 오스의 바닥이 확정 때까지 두뇌를 리프트에 불을 세련된 라운드 팁과 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 두뇌는 아가로 오스 블록의 아래쪽에 수평 평면 위치에 정착한다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 (약 3 분 후) 확정되면, 두뇌를 둘러싼 아가로 오스 및 접착제 표본 무대에 아가로 오스 블록 트림vibratome니다. 언제 gluing 블록, 머리가 수평 섹션 비행기에서 컷해야부터 두뇌의 복부 측면은 플랫폼에 평행하게되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 3. Vibratome의 sectioning <ol><li> sectioning 위해 면도날을 사용합니다. 그대로 조각을 얻으려면 것은 sectioning 동안 4 ° C에서 온도를 유지하는 것은 매우 중요하다. </li><li> 50 Hz의 주파수에서 제 300 μm의 두께가 수평 슬라이스, 블레이드 1.1 mm의 진폭과 25mm / 초의 속도. </li><li> 뇌의 슬라이스를 수집하고 살균 얼음처럼 차가운 1X Krebs 버퍼와 함께 접시에 그들을 전송하는 미니 구멍 스푼에 조각을 밀어 좋은 붓을을 사용합니다. (그림 1 참조) 복부 midbrain 조직을 포함하는 슬라이스를 선택합니다. E12.5 마우스 두뇌에 dopaminergic 신경을 포함한 복부 midbrain 조직을 포함 한 300 μm의 수평 슬라이스가 있습니다. </li></ol> 4. 슬라이스 문화 단계 4.2-4.5는 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. <ol><li> 1X Krebs 버퍼 (포인트 1.2.5 참조) 여섯 잘 플레이트에 Millicell 셀 문화 막 삽입에 뇌 조각 전송합니다. 전송하려면 슬라이스가 미니 구멍 스푼 (파인 과학 도구)와 벌금 붓을을 사용합니다. 최대 3 조각 한 막에 둘 수 있습니다. </li><li> 문화 매체와 여섯 잘 판에 슬라이스 (포인트 1.2.5 참조) 멤브레인을 전송합니다. 멤브레인의 상단은 매체에 의해 적용되지 않습니다. 뇌 슬라이스는 위에서 아래 공기에서 중간받습니다. </li><li> 37 5퍼센트 CO 2 배양기에서 여섯 잘 플레이트를 배치 ° C. 그것은 조각이 절개의 초기 단계 후 2 시간 이내에 배양기에 배치하는 것이 매우 중요합니다. 보다 확장된 준비 시간은 조각의 가난한 생존이 발생할 수 있습니다. </li><li> 조각은 3 일 이내에 체외로 유지하실 수 있습니다. 2 차 당일에 문화 매체의 50 %를 변경합니다. </li></ol><ol><li> 시간이 경과 이미징을 시작하기 전에 4-5시간에 대한 조각이 인큐베이터에서 회복합시다. </li><li> 시간이 경과 이미징 들어, 멤브레인 삽입에 조각을 유지하고 35mm Ibidi의 μ - 요리 (접시의 바닥이 높은 광학 품질 소재로 구성되어 있습니다)에 삽입을 전송합니다. </li><li> 접시에 배지 1 ML 플러스 1.5 μL 아스코르비 산 (200 MM)를 추가합니다. 아스코르비 산은 phototoxicity에 대한 슬라이스를 보호합니다. </li><li> 37 환경 챔버의 조각 품어 ° C 시간이 경과 이미징 동안 5 % CO2와 함께. </li></ol> 6. 대표 결과 그림 1은 E12.5 마우스 뇌에서 organotypic 슬라이스 문화의 준비를 보여줍니다. 그림 2는 가로 organotypic 조각이 (급성과 문화에 몇 일 후) 양식 E12.5 마우스 머리를 취득 보여줍니다. 동등한 발달 단계 비교, 냉동 뇌 섹션에 대한표시됩니다. Midbrain dopaminergic 신경은 티로신 hydroxylase (TH)에 대한 immunohistochemistry와 시각입니다. Midbrain dopaminergic 신경 프로젝트 forebrain에서 표적 수 있습니다. 이러한 추정치는 E12.5에서 양식 및 후속 일간 forebrain쪽으로 확장하는 시작합니다. 우리는 문화에 dopaminergic 신경의 정상적인 발전을위한 좋은 표시대로 forebrain의 예측의 발전을 고려하십시오. 수평 조각의 midbrain에서 dopaminergic 뉴런들은 적절한 forebrain 대상 지역으로 계획을 확장. 세 DIV (체외에서 일)하거나 forebrain 대상 영역이 손상되면 탈선 예상 지느러미 midbrain쪽으로 확장. E12.5 midbrain의 코로나 조각의 예는 다음은 그림 3에 표시됩니다. Dopaminergic의 뉴런은 TH의 지느러미 midbrain에 탈선 계획을 확장을위한 immunostaining와 시각. 그림 4는 organotypic 슬라이스 문화에 괴사성 및 apoptotic 세포를 proliferating의 분석을 보여줍니다. BrdU 인스턴트 메신저proliferating 세포를 시각화하는 munostaining하면 세포는 1 DIV 이후 문화 상황에서 분아 따위에 의해 중식 것을 보여줍니다. 확산 4 DIV 이후 줄어 듭니다. 세 DIV 후, 복부 midbrain의 많은 세포가 괴사 (propidium의 요오드화물 얼룩) 및 apotosis을 (죽습 caspase - 3에 대한 immunostaining) 받고있다. 그림 5는 급성 통에 시간 저속 영상 실험에서 모니터링 YFP - 분류 뉴런의 철새 경로를 보여줍니다 . <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. organotypic 슬라이스 문화의 준비를 설명하는 도식. 300 μm의 수평 뇌 조각은 vibratome를 사용하여 E12.5 머리를 sectioning으로 준비가되어 있습니다. E12.5 마우스 뇌 (A) 도식의 화살보기. 섹션의 레벨이 표시됩니다. dopaminergic의 뉴런을 포함하는 영역이 핑크색으로 그려져 있습니다, 예상이 파란색으로 표시됩니다. 로 지느러미에서 얻을 수 세 조각의 (B) 회로도 복부와 THAt는 forebrain (FB)과 midbrain (MB)를 모두 포함합니다. 단 하나 슬라이스가 dopaminergic 뉴런 (슬라이스 B)가 포함되어 있습니다. 해당 슬라이스는 심실의 위치 및 midbrain 및 forebrain 조직 (화살표, 섹션 A와 C와 섹션 B를 비교)의 연속성에 따라 확인할 수 있습니다. dopaminergic 신경을 포함하는 영역이 분홍색으로 표시됩니다, dopaminergic 엽 성의 전구 물질을 포함하고있는 지역은 개발 계획을 나타내는 녹색, 청색 화살표로 그려져 있습니다. (C) dopaminergic 신경을 포함하는 슬라이스는 막 삽입에 양식입니다. 약어 : vMb, 복부 midbrain, DMB, 지느러미 midbrain, 우울, 시상 하부, HB, hindbrain. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. organotypic 슬라이스 문화에 midbrain dopaminergic 신경의 예상치는 forebrain의 무결성에 의존하고 있습니다. dopaminergic 신경을 라벨 티로신 hydroxylase (TH)에 대한 Immunohistochemistry. (A) 급성 슬라이스 (0 DIV)복부 midbrain에서 dopaminergic 신경의 정상적인 위치를 보여주는. 흰 화살촉은 삽입의 높은 배율로 표시되는 영역을 나타냅니다. forebrain에 예상은 아직 개발하지 않았습니다. 일 DIV 후, forebrain에 예상 형태로 시작합니다. 계획 2-3 DIV에 forebrain로 확장합니다. 화이트 화살촉은 insets 높은 배율 (화이트 프레임)에 표시된 세포 기관의 위치를​​ 나타냅니다. 노란색 화살표는 insets 높은 배율 (노란색 프레임)에 표시된 그대로 조각의 일반적인 전망을 강조 표시합니다. 탈선 계획은 손상 forebrain과 함께 슬라이스에 개발할 수 있습니다. 빨간색 화살표는 insets 높은 배율 (빨간색 프레임)에 표시된 지느러미 midbrain에 탈선 예상을 나타냅니다. 피해는 빨간색 별표로 표시됩니다. 세 DIV 후, 대부분의 조각은 (N = 5 / 7) 지느러미 midbrain 향해 탈선 전망했다. (B) 다른 발달 단계에 가로 냉동 뇌 섹션에서 TH의 immunostaining의 발전을 보여주생체내에서 dopaminergic 예상 중. 화이트 화살촉은 insets 높은 배율 (화이트 프레임)에 표시된 세포 기관의 위치를​​ 나타냅니다. 노란색 화살표는 insets (노란색 프레임)에서 높은 배율에 표시된 예측의 위치를​​ 강조 표시합니다. 냉동 섹션의 수준이 밀접하게 organotypic 슬라이스 문화의 수준에 맞게 선정되었습니다. 한 냉동 섹션 (12 μm의) 전체 organotypic 슬라이스 (300 μm의)를 대표하지 않습니다. 따라서 E13.5 및 E14.5에 표시된 예측은 세포 기관 (노란색 별표)이있는 섹션 120여 μm의 더 많은 복부 부분에서 관찰되었다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. dopaminergic 신경에 대한 마커로 티로신 hydroxylase (TH)에 대한 스테인드 Midbrain 코로나 슬라이스 문화. 1, 2 또는 3 DIV 이후 (AC) 슬라이스. Dopaminergic 뉴런은 지느러미 midbrain (R 방향으로 탈선 계획을 개발에드 화살표). 화살촉은 dopaminergic 세포 기관의 위치를​​ 보여줍니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. midbrain organotypic 슬라이스 문화의 세포 증식 및 세포 생존 능력. (A) Proliferating 전지 18 H.위한 문화 매체 BrdU (50 NG / ML, 시그마)의 추가에 의해 라벨이 붙지만 조각은 이후 BrdU에 대한 immunostained되었습니다. 일 DIV 후, BrdU 표시된 세포는 심실 지역 (빨간색 화살표)에 위치하고 있습니다. 4 DIV 후, proliferating 세포보다 흩어져 있으며 뚜렷한 심실 영역이 더 이상 유지되지 않습니다. (B) 괴사성 세포는 2 시간에 대한 문화 매체 propidium 요오드화물의 정보뿐만 아니라 (1μg/μL, 시그마)로 표시하고 형광 현미경으로 시각되었습니다. 일 DIV 후, 복부 midbrain (vMb)는 괴사성 아니지만, 많은 propidium 요오드화물의 라벨 세포는 지느러미 midbrain과 forebrain에서 볼 수 있습니다. 세 DIV 후 세포 생존은 복부 midbra의 감소인치 스케일 바 : apoptotic 세포를 시각화하는 죽습 caspase - 3에 대한 Immunostaing 500 μm의 (C). 1 또는 2 DIV에서 단 몇 dopaminergic 뉴런 (TH)는 apoptotic 있습니다. 세 DIV 후 dopaminergic 신경은 apoptosis를 받아야하기 시작합니다. 중간과 오른쪽 패널이 왼쪽 패널에있는 박스 영역의 높은 배율입니다. 높은 배율의 이미지는 14-16 프레임의 Z - 스택의 최대 강도 전망입니다. 이미지 자이스 혈구 Apotome 설정과 모든 0.5 μm의를 촬영했다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 급성 통에 YFP - 레이블 뉴런의 이동 경로. (A) 수평 슬라이스는 YFP - 분류 뉴런의 시간 저속 이미징에 사용. 슬라이스는 이전 이미징 5 시간에 대한 incubated했다. 전지는 inducible Cre / loxP 시스템 6을 사용 분류되었습니다. 쉿 CreER 마우스 8 로사 loxP - STOP - loxP - EYFP 기자 마우스 9 우리다시 사용되는. 로사의 기자 allele (및 EYFP 표현)의 재조합은 세포에서 유도된 것을 표현 CreER (쉬 - 표현 세포),하지만 Tamoxifen (시그마)의 관리에 따라. 이 예제에서는, Tamoxifen (3 mg/40 g의 체중)을 E8.5에서 임신 마우스에 투여했다. 이 실험 주로 복부 midbrain 10,11에 dopaminergic 뉴런과 그 자손의 엽 성의 전구 물질의 라벨 결과를 설정합니다. 스케일 바 : 500 μm의. (B) 급성 통에 YFP - 레이블 뉴런의 이동 경로를 추적. YFP - 라벨 운명 매핑 뉴런의 시간 저속 이미지는 5 시간의 총 시간 자이스 혈구 Axio - 옵저버 현미경 (목적 EC PlnN 10X / 0.3)에서 30 분마다 30 분을 인수했다. 조각은 37 ° C에서 환경 챔버 (인큐베이터 XLS1 Pecon)에 incubated 및 이미징 동안 5 % CO 2와 함께 제공했다. 세포의 초기 위치가 빨간색 화살표로 표시되어있다, 마이 그 레이션 순위는 빨간색 별표로 표시됩니다.

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

여기에 제시 organotypic 슬라이스 문화 방법은 배아 복부 midbrain에서 dopaminergic 뉴런과 철새와 프로젝션 노선 개발을 체외 분석에서 단기간에 시스템을 제공합니다. 우리는 신중하게 복부 midbrain dopaminergic 신경의 정상적인 발전을 허용 조각을 얻기 위해에 참석해야 프로토콜의 중요한 단계 수가있다는 것을 발견했습니다. 가장 중요한 단계는 빠르고 정확한 모두 수있는 배아 두뇌의 해부입니다. 성인 뇌 조각의 세대와는 달리, 그것은 E12.5 두뇌의 손상 조각을 얻을 수있는 고속과 함께 낮은 주파수를 사용하는 냉각 시스템 및 장착된 vibratome에 섹션 두뇌를하는 데있어 매우 중요합니다. 마지막으로, 우리는 조각이 복부 midbrain 이외에 dopaminergic 예측의 forebrain 대상 영역이 슬라이스에 포함되도록 수평면에 sectioned되어야한다는 관찰했다.우리는 또한 forebrain가 개발 정상 dopaminergic 예측하기 위해서는 이러한 조각에 그대로...

특정 시약 및 장비 표 <table border="1"><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> 포도당 30% </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G7528 - 250 </td><td></td></tr><tr><td> 말 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., L - Gln와 나 Pyr, NaHCO3) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D6429 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> 100x 페니실린은 / 스트렙토 마이신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P4333 - 20 </td><td></td></tr><tr><td> L - 아스코르비 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A4403 </td><td> -20 ° C에서 200mM 주식 및 저장을 준비 </td></tr><tr><td> UltraPure LMP 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Millicel 삽입 </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 μ - 요리 35mm, </td><td> Ibidi </td><td> 80,136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> 면도날 </td><td> 렌즈 GmbH의 </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl 접착제 </td><td> BRAU9381104 </td><td> 브라운 Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> 다공 숟가락 디아 직경 15mm </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10,370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 5 Dumoxel </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr></table> immunostainings에 사용되는 항체 : <table border="1"><tr><tD 항체의&gt; 이름 </td><td> 회사 </td><td > 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 토끼 안티 - 티로신 hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> 희석 1:500 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 티로신 hydroxylase </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> 희석 1:500 </td></tr><tr><td> 마우스 방지 BrdU </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555,627 </td><td> 희석 1:200 </td></tr><tr><td> 토끼 반 죽습 caspase 3 </td><td> 세포 신호 기술 </td><td> 9661 </td><td> 희석 1:200 </td></tr><tr><td> 당나귀 안티 - 토끼 IgG - 알렉사 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> 희석 1:500 </td></tr><tr><td> 당나귀 안티 - 마우스 IgG - Cy3 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 715-165-150 </td><td> 희석 1:200 </td></tr></table>

배아 복부 midbrain의 organotypic 슬라이스 문화 : dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

마우스 분자 및 유전자 데이터의 풍부한으로 인해 포유류의 두뇌 개발을 연구하는 훌륭한 모델 생물이다. 마우스 배아에 액세스할 수 및 불투명이기 때문에 그러나, 개발 마우스 두뇌는 생체내에서 쉽게 조작 및 이미징에 적합하지 않습니다. 배아 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화가 따라서 광범위하게 체외에 murine 두뇌 개발을 연구하는 데 사용됩니다.의 연결이나 glial 세포의 subpopulations이 형광 단백질이 표시 수 있도록 전 생체내 조작 또는 유전자 변형 생쥐의 사용은 유전자 표현의 수정을 허용합니다. 분류 전지의 동작은 다음 시간에 촬영된 영상을 사용하여 볼 수 있습니다. 시간 경과 이미징 늦게 배아 단계 1-2에서 대뇌 피질의 발전을 기초 셀 동작을 공부하고 특히 성공을 거두었습니다. forebrain 외부의 뇌 지역에서 배아 organotypic 슬라이스 문화 시스템은 덜 잘 establis 아르쓰인. 따라서, 세포의 연결을 마이 그 레이션을 설명하는 시간 경과 영상 데이터의 풍부한은 forebrain 3,4으로 제한됩니다. 그것은 아직 지느러미 뇌를 발견 원칙 복부 뇌 영역에 대한 진정한 보유하고 있는지, 알 수 없습니다. 복부 두뇌에서 뉴런의 연결은 클러스터가 아닌 레이어로 구성 그리고 그들은 종종 자신의 최종 위치에 도달하는 복잡한 철새의 탄도를 받아야 할 수 있습니다. 복부 midbrain은 복부 두뇌 개발에 대해서만 좋은 모델 시스템이 아니지만, 또한 질병 과정에 관련된 dopaminergic 신경로의 연결 인구가 포함되어 있습니다. dopaminergic 신경의 기능과 변성은 성인과 노화 두뇌에 좋은 상세히 조사하고있는 동안, 꼬마들은 차별화 및 마이 그 레이션 단계 5 동안 이러한 뉴런의 행동에 대해 알려져 있습니다. 우리는 여기서 배아 일 (E) 12.5 마우스 복부 midbrain에서 슬라이스 문화의 생성을 설명합니다. 이러한 슬라이스 예찬ures는 체외에서 며칠 동안 dopaminergic 신경 세포 개발을 감시하는 잠재적으로 적합합니다. 우리는 배아 개발이 초기 단계에서 뇌 조각을 생성에 중요한 단계를 강조하고 체외에서 dopaminergic 신경의 정상적인 발전을 유지하기위한 필요 조건을 토론합니다. 시간 저속 이미징 실험에서 우리는 또한 현재의 결과입니다. 이 실험에서, 복부 midbrain의 엽 성의 전구 물질 (dopaminergic 엽 성의 전구 물질 포함) 및 그들의 자손은 Cre / loxP 기반 inducible 운명 매핑 시스템 6을 사용 모자이크 방식으로 표시했다.

E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

마우스는 분자 및 유전적 데이터가 풍부하기 때문에 포유류 뇌 발달을 연구하기 위한 훌륭한 모델 생물입니다. 하지만, ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 발달 중인 도파민성 뉴런을 분석하기 위해 E 12.5 배아 중뇌에서 기관형 절편(organotypic slices)을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 배아 뇌를 해부한 후, 뇌를 저융점 aeros에 매립함으로써 수행됩니다.세 번째 단계는 진동 절편기(vibrator)를 사용하여 뇌 슬라이스를 절편하는 것입니다. 마지막 단계는 배양 및 타임랩스 이미징에 적합한 뇌 슬라이스를 선택하는 것입니다. 최종적으로, 타임랩스 이미징과 면역형광 현미경법을 통해 도파민성 뉴런의 초기 단계, 이동 행태 및 분화를 보여줍니다.이 방법은 발달 중인 복측 뇌에서의 뉴런 및 이동 행동 추적과 같이 신경 발달 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 해부 전날, 1X Krebs 완충액을 준비하고, 해부 약 2시간 전에 동반된 원고에 따라 배양 배지를 준비하십시오. Krebs 완충액에 4% 저융점 아가로스를 100밀리리터 준비하되, 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지로 가열하십시오.그 후 aros를 45°C 항온수조에 넣습니다. 다음으로, Vibram 버퍼 트레이에 차가운 Krebs 버퍼를 채웁니다. 냉각 장치를 켜고 4°C로 유지합니다.그 후, 블레이드 캐리어에 면도날을 고정합니다. 나중에 진동기 영역에서 절편을 수거하여 섹셔닝(sectioning)하는 데 사용할 메스, 세밀한 붓, 그리고 미세 천공 스푼을 준비합니다. 그런 다음, 멸균 페트리 접시에 Krebs 완충액을 넣고 얼음 위에 보관합니다.해부 영역에서, 해부용 대형 멸균 페트리 접시 3개와 임베딩용 소형 멸균 페트리 접시 2개, 소형 가위 한 쌍, 미세 핀셋 두 쌍, 미세 타공 스푼, 끝이 둥글게 가열 연마된 유리 파스퇴르 피펫, 그리고 얼음에 둔 1L의 Krebs buffer를 준비하십시오. 모든 해부 도구를 70% ethanol로 닦아내십시오. 다음으로, 6-웰 플레이트의 각 웰에 배양액을 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양하십시오.다음으로, 멸균 상태에서 다른 6-웰 플레이트의 각 웰에 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 Krebs 완충액 1.5 milliliters를 넣습니다. 웰에 밀리 세포막 인서트를 배치합니다. 뇌 절편을 필터 막으로 옮길 수 있도록 6-웰 플레이트를 바이브라톰 옆에 둡니다.절단 직후, 배아 단계가 E 12.5인 임신한 암컷 생쥐를 희생시키고 핀셋으로 자궁을 들어 올려 적출합니다. 그런 다음 다른 핀셋을 사용하여 자궁에서 자궁근층을 떼어냅니다. 이후 자궁을 현미경 하의 차가운 Krebs 완충액에 넣습니다.미세 핀셋을 사용하여 배아로부터 자궁의 근육벽, 리커 막(riker's membrane) 및 내장 난황낭을 분리합니다. 그런 다음 배아를 자궁에서 꺼내어 멸균된 Krebs 완충액이 담긴 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 이어서 각 배아의 머리 부분을 절단합니다.미세 핀셋을 사용하여 안구 높이에서 머리를 관통시켜 고정합니다. 다른 핀셋을 사용하여 피부와 두개골을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 뇌를 조심스럽게 들어 올려 멸균된 Krebs 버퍼가 담긴 페트리 접시에 옮깁니다.그 후, 4% 저융점 agarose로 뇌를 세척합니다. 4% 신선한 저융점 agarose에 뇌를 한 번에 2~3개씩 넣습니다. 이때 끝을 불로 가공하여 둥글게 만든 파스퇴르 피펫을 사용하십시오.그 다음, 임베딩 디쉬를 얼음 위에 최대한 평평하게 배치합니다. 이어서, aros 바닥면이 응고될 때까지 뇌를 들어 올려 뇌가 균일하게 안착되어 aros 블록의 바닥과 평행이 되도록 합니다. aros가 완전히 응고되면 뇌 주변의 aros를 다듬어 줍니다.그 후, 블록을 진동 절편기의 시료대에 고정합니다. 블록을 고정할 때 뇌의 복측면이 플랫폼과 평행하도록 하십시오. 주파수 50 hertz, 칼날 진폭 1.1 millimeters, 속도 25 millimeters per second의 조건으로 300 micron 두께의 수평 절편을 제작합니다.세밀한 붓을 사용하여 뇌 절편을 미세 천공 스푼으로 밀어 수집합니다. 그다음 현미경 하에서 멸균된 얼음 냉각 Krebs 완충액이 담긴 배양 접시로 절편을 옮깁니다. 복측 중뇌 조직이 포함된 절편을 선택합니다.이 단계에서는 미세 타공 스푼과 세밀한 붓을 사용하여 뇌 절편을 미리 준비한 Krebs 버퍼가 담긴 6-웰 플레이트의 밀리셀 멤브레인 인서트로 옮깁니다. 다음으로, 절편이 놓인 멤브레인을 배양이 담긴 다른 6-웰 플레이트로 옮기며, 뇌 절편이 아래에서는 배지를 공급받고 위에서는 공기에 노출될 수 있도록 멤브레인 상단은 건조한 상태로 유지합니다.절편을 37°C, 5% 이산화탄소 조건의 배양기에 넣습니다. 해부의 첫 단계 후 2시간 이내에 절편을 배양기에 넣는 것이 매우 중요합니다. 이 절편들은 in vitro에서 3~4일 동안 유지될 수 있습니다.4~5시간 동안 회복시킨 후, 이미징 직전에 슬라이스를 타임랩스 이미징에 사용할 수 있습니다. 광독성으로부터 슬라이스를 보호하기 위해 1.5 µL의 200 mM 아스코르브산(ascorbic acid)을 디쉬에 첨가하십시오.타임랩스 이미징(time-lapse imaging)을 수행하는 동안 슬라이스를 37°C, 5% 이산화탄소 농도의 환경 챔버에서 배양하십시오. 여기는 전뇌로 향하는 투사(projection)가 아직 발달하지 않은, 복측 중뇌의 도파민성 뉴런의 일반적인 위치를 보여주는 급성 슬라이스입니다. 배양 하루 후, 노란색 화살표로 표시된 것과 같이 전뇌로 향하는 투사가 형성되기 시작합니다.흰색 화살표는 삽입도의 고배율 이미지에서 보여지는 세포체의 위치를 나타냅니다. 여기에는 YFP로 표지된 뉴런의 이동 경로가 나와 있습니다. 급성 수평 절편에서 세포의 초기 위치는 빨간색 화살표로 표시되었습니다.본 영상을 시청한 후, 생존 가능한 온전한 절편을 얻기 위해 E 12.5 해양 배아 중뇌에서 유전자형 절편을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 배아 뇌의 박리를 주의 깊게 수행하는 것과, 배양 및 타임랩스(TimeLapse) 이미징을 위해 진동 절편기(vibratome) 섹셔닝 후 적절한 뇌 절편을 선택하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E18 랫 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화

기본 dissociated midbrain의 도파민 세포 문화는 도파민 뉴런의 presynaptic 특성의 연구 수 있습니다. 그들은 실시간 도파민 릴리스 속도론 및 단백질 / mRNA 도파민 exocytosis의 규제 수준을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 당신이 쥐 neonates에서 이러한 문화를 생성하는 방법을 보여줍니다.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

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Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

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1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런의 분리 및 배양

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여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

파킨슨병 동안 중뇌 도파민성 뉴런의 퇴화 원인은 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 배양 시스템은 이러한 뉴런의 신경 생리학적 특성을 연구하는 데 필수적인 도구를 제공합니다. 여기에서는 신경퇴행의 체외 모델링에 활용할 수 있는 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

배아 쥐의 뇌에서 차 중뇌 도파민 신경 세포의 분리, 문화 및 장기 유지 보수

ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 IslMN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.

배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

배우세요 E12.5 마우스 배아 중뇌에서 오가노타이픽 슬라이스 배양법을 통해 도파민성 뉴런의 발달과 이동 행동을 연구하는 방법입니다. 타임랩스 이미징과 면역형광 현미경을 활용하여 신경발달 역학을 분석할 수 있습니다.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서

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