2012년 1월 31일
E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 도파민 뉴런을 분석하기 위해 E 12.5 뉴런 배아 중뇌에서 유기형 슬라이스를 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 배아의 뇌를 해부함으로써 이루어진다. 그런 다음 뇌는 저융점 공기에 내장됩니다.
세 번째 단계는 바이브레이터를 사용하여 뇌 절편을 절단하는 것입니다. 마지막 단계는 배양 및 타임랩스 이미징을 위한 우뇌 절편을 선택하는 것입니다. 궁극적으로, 타임랩스 이미징과 면역형광 현미경 검사는 도파민 뉴런의 초기 단계, 이동 행동 및 분화를 보여주는 데 사용됩니다.
이 방법은 발달 중인 복부 뇌 동안 뉴런 및 이동 행동을 따라가는 것과 같은 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 해부 하루 전, 해부 약 2시간 전에 동봉된 원고에 따라 X 크렙스 완충액 1개와 배양 배지를 준비합니다. 아로스가 완전히 용해될 때까지 용액을 전자레인지에 돌려 크렙스 버퍼에 100ml의 4% 저용융 아로스를 준비합니다.
그런 다음 아로스를 섭씨 45도의 수조에 넣으십시오. 다음으로, Vibram 버퍼 트레이를 얼음처럼 차가운 Krebs 버퍼로 채웁니다. 냉각 요소를 켜고 섭씨 4도로 유지하십시오.
그런 다음 블레이드 캐리어에 면도날을 고정하십시오. 메스, 고운 붓, 작은 구멍이 뚫린 숟가락을 준비하여 나중에 절편화하기 위해 바이브레이터 영역의 조각을 집어 올립니다. 그런 다음 멸균 페트리 접시에 크렙스 버퍼를 추가하고 얼음 위에 보관하십시오.
해부 구역에서 해부를 위한 3개의 큰 멸균 페트리 접시와 한 쌍의 작은 가위, 두 쌍의 가는 집게, 작은 구멍이 뚫린 숟가락, 둥근 닫힌 끝으로 광택을 낸 유리 목초지 피펫, 얼음 위에 1리터의 크렙스 완충액을 넣기 위한 2개의 작은 멸균 페트리 접시를 준비합니다. 모든 해부 도구를 70% 에탄올로 닦습니다. 다음으로, 6개의 웰 플레이트의 웰에 배양 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.
다음으로, 페니실린 스트렙토마이신이 함유된 크렙스 완충액 1.5ml를 멸균 조건에서 다른 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 웰에 밀리 세포막 삽입물을 놓습니다. 6개의 웰 플레이트를 비브라토 옆에 놓아 뇌 절편이 필터 멤브레인으로 전달될 수 있도록 합니다.
절편 직후, E 12.5 단계에서 배아를 가진 임신한 암컷 쥐를 희생하고 한 쌍의 집게로 자궁을 들어 올려 자궁을 제거합니다. 그런 다음 다른 집게를 사용하여 자궁에서 근막을 떼어냅니다. 그 후, 현미경 아래의 얼음처럼 차가운 크렙스 완충액에 자궁을 놓습니다.
한 쌍의 가는 집게를 사용하여 자궁의 근육 벽, 라이커 막, 내장 난황 자루를 배아에서 분리합니다. 그런 다음 자궁에서 배아를 제거하고 배아를 멸균 크렙스 완충액이 있는 별도의 페트리 접시로 옮깁니다. 다음으로, 각 배아의 머리를 자른다.
한 쌍의 미세한 집게로 눈높이에서 머리를 뚫어 고정합니다. 다른 집게를 사용하여 피부와 두개골을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 뇌를 들어 올려 멸균 크렙스 완충액이 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
그 후, 4% 낮은 융점 아로스로 뇌를 세척하십시오. 한 번에 2-3개의 뇌를 4%의 신선하고 낮은 융점 렌즈에 내장합니다. 불로 광택 처리 된 둥근 팁이있는 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
그런 다음 가능한 한 얼음 위에 임베딩 접시를 놓습니다. 다음으로, 아로스의 바닥이 굳어질 때까지 뇌를 들어 올려 뇌가 고르게 정착하고 아로스 블록의 바닥과 평행이 될 수 있도록 합니다. 아로스가 완전히 굳어지면 뇌를 둘러싼 아로스를 다듬습니다.
그 접착제 후, aros는 바이브레이터의 표본 스테이지에 블록됩니다. 블록을 붙일 때 뇌의 복부 쪽이 플랫폼과 평행한지 확인하십시오. 단면 300 미크론 두께의 수평 슬라이스는 50 헤르츠의 주파수, 1.1 밀리미터의 블레이드 진폭, 초당 25 밀리미터의 속도
에서 슬라이스합니다.고운 붓을 사용하여 조각을, 작은 구멍이 뚫린 숟가락으로 밀어 넣어 뇌 조각을 모으세요. 그런 다음 현미경으로 멸균된 얼음처럼 차가운 크렙스 완충액이 있는 접시에 옮깁니다. 복부 중뇌 조직이 포함된 슬라이스를 선택합니다.
이 단계에서는 구멍이 뚫린 미니 숟가락과 미세한 붓을 사용하여 뇌 조각을 이전에 준비된 크렙스 완충액이 있는 6웰 플레이트의 밀리 세포막 삽입물로 옮깁니다. 다음으로, 조각이있는 막을 다른 6 개로 옮깁니다. 웰 플레이트를 배양 배지로 만들고 멤브레인의 상단을 건조하게 유지하여 뇌 조각이 아래에서 배지를 받고 위에서 공기를 받도록 합니다.
슬라이스를 섭씨 5도에서 이산화탄소가 37%인 인큐베이터에 넣습니다. 절개 초기 단계 후 2시간 이내에 조각을 인큐베이터에 넣는 것이 매우 중요합니다. 이 슬라이스는 3-4일 동안 체외에서 유지할 수 있습니다.
4-5시간의 회복 후. 슬라이스는 이미징 직전에 타임 랩스 이미징에 사용할 수 있습니다. 접시에 1.5마이크로리터, 200밀리몰의 아스코르브산을 첨가하여 광독성으로부터 슬라이스를 보호합니다.
타임랩스 이미징 동안 섭씨 37도의 환경 챔버에서 5%의 이산화탄소로 슬라이스를 배양합니다. 다음은 전뇌에 대한 돌기가 아직 발달하지 않은 복부 중뇌에서 도파민 뉴런의 정상적인 위치를 보여주는 급성 슬라이스입니다. 배양에서 하루를 보낸 후, 전뇌에 대한 돌기가 노란색 화살표로 표시된 것처럼 형성되기 시작합니다.
흰색 화살표는 삽입에서 더 높은 배율로 표시되는 세포체의 위치를 나타냅니다. 다음은 YFP 표지 뉴런의 철새 뿌리입니다. 급성 수평 슬라이스에서 셀의 초기 위치는 빨간색 화살표로 표시됩니다.
이 비디오를 시청한 후에는 E 12.5 해양 배아 중뇌에서 유전형 절편을 준비하여 실행 가능하고 온전한 절편을 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 배아 뇌 해부를 주의 깊게 수행하고 비브라토 절편 후 배양 및 타임랩스 이미징을 위한 올바른 뇌 절편을 선택하는 것이 중요합니다.
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이 기사는 E12.5 생쥐 배아 중뇌에서 기관 유형 슬라이스를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양물은 도파민성 뉴런 및 기타 배측 중뇌 뉴런의 행동을 관찰하는 데 유용합니다.
Organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain enable direct observation of dopaminergic neuronal development, supporting mechanistic de-risking and target validation in neurodevelopmental research. This system provides predictive confidence for early-stage discovery by allowing manipulation and real-time imaging of neuronal subpopulations relevant to disease. The approach bridges a critical gap between genetic models and functional phenotyping, informing portfolio decisions in CNS drug discovery.
This organotypic slice culture method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical phenotyping, particularly for CNS and neurodevelopmental programs.