자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

이 절차의 전반적인 목표는 응집된 세포와 세포 유래 매트릭스로부터 기능 분석에 사용할 수 있는 3D 조직 구조를 만드는 것입니다. 이것은 먼저 폴리카보네이트 주형을 밀링하여 바닥이 둥근 환형 우물을 만드는 방식으로 수행됩니다. 다음으로 폴리 디메틸 슬론 또는 PDMS를 폴리 카보네이트 몰드에 주조하여 템플릿을 만듭니다.

그런 다음 PDMS 템플릿을 사용하여 aros well을 형성합니다. 마지막 단계는 세포를 aros well에 파종하여 응집력 있는 조직 고리를 응집하고 형성할 수 있도록 하는 것입니다. 궁극적으로 이 방법은 다양한 세포 유형을 사용하여 세포 자체 조립 및 조직 공학을 달성하는 데 사용할 수 있으며 조직 구조 및 기능에 대한 세포 및 세포 유래 세포 외 기질의 기여도를 분석할 수 있습니다.

다른 조직 공학 접근 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은 이전에 보고된 것보다 더 빠르게 생성되는 세포와 세포외 기질로부터 완전히 조직 구조를 생성할 수 있으며, 기계적 분석에 도움이 되는 형식으로 반 인치 두께의 폴리카보네이트 조각을 밀링하여 시작하여 중앙 포스트 직경이 2mm인 15개의 둥근 바닥의 환형 웰을 만듭니다. 폴리카보네이트 금형을 청소하여 밀링 공정에서 생성된 플라스틱 파편을 제거하고 금형을 건조시킵니다. 다음으로, PDMS를 10:1 비율의 염기 경화제로 혼합하여 용액을 탈기하여 모든 기포를 제거한 다음 폴리카보네이트 금형에 붓습니다.

그런 다음 금형의 혼합물을 다시 가스를 제거하여 남아 있는 기포를 제거하고 PDMS가 경화되는 동안 섭씨 60도의 오븐에서 4시간 동안 PDMS를 경화합니다.DMEM의 2%AROS가 경화되면 폴리카보네이트에서 PDMS 템플릿을 천천히 벗겨내어 조심스럽게 제거한 다음 비누와 물로 PDMS를 세척하고 DMEM AROS 용액과 함께 오토클레이브합니다. 이제 오토클레이브 PDMS 템플릿을 평평한 표면에 놓고 먼저 각 중앙 포스트 금형에 아로를 피펫팅한 다음 주변 공간에 아로를 피펫팅하여 용융 아로로 채웁니다.

약 15분 동안 아로스가 굳어지도록 합니다. 그런 다음 금형을 뒤집어 PDMS에서 aros를 분리합니다. 각 우물 주변에서 여분의 아로를 잘라낸 다음 12웰 플레이트의 각 우물에 하나의 아로를 놓습니다. 지금.

웰 상단을 덮지 않고 aros 웰 외부 주위에 세포 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 넣어 세포가 준비되는 동안 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 90% 합류 트립신, 쥐 대동맥 평활근 세포 및 소생.

밀리리터당 6개의 세포에 대해 5 곱하기 10의 농도로 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 재현 탁유 세포 현탁액을 평형 된 aros well의 각각에 피펫팅합니다. 원을 그리는 동작을 사용하여 세포를 각 웰에 적용합니다.

플레이트를 인큐베이터에 넣어 24시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오. 우물 주변에서 매체를 흡인하고 aros 곰팡이가 완전히 잠길 때까지 각 우물을 다시 채워 이틀에 한 번씩 매체를 교환합니다. 그리고 문화가 끝나면 작은 페트리 접시에 PBS를 채웁니다.

중앙 기둥 상단 위로 밀어 aros 틀에서 각 링을 제거합니다. 디지털 이미징 시스템 아래의 링인 PBS 센터가 있는 페트리 접시에 링을 놓습니다. 가장자리 감지 소프트웨어를 사용하여 둘레를 중심으로 위쪽, 아래쪽, 왼쪽 및 오른쪽의 네 가지 위치에서 링의 두께를 측정합니다.

단축 인장 시험을 수행합니다. 두 개의 얇은 와이어 그립에 링 샘플을 장착합니다. 링에 5밀리 뉴턴 인열 하중이 가해질 때까지 그립을 확장합니다.

그런 다음 두께 측정에서 계산된 단면적을 입력하고 게이지 길이를 기록합니다. 인열 하중과 50킬로 파스칼 사이에 링을 8번 사전 순환합니다. 여덟 번째 프리 사이클 이후 분당 10mm의 속도로 응력이 가해졌고, 분당 10mm의 속도로 실패했다.

각 링에 대해 극한 인장 응력과 파괴 변형률을 측정하고 수집된 데이터에서 최대 탄젠트 계수를 계산합니다. 기능적 체외 연구 외에도 이러한 살아있는 세포링은 융합하여 조직 튜브를 형성할 수도 있습니다. 수술용 가위를 사용하여 실리콘 튜브의 끝을 비스듬히 절단하여 비스듬한 가장자리를 만든 다음 튜브가 오토클레이브되는 동안 실리콘 튜브를 오토클레이브합니다.

페트리 접시에 매체를 채우고, 멸균된 맞춤형 실리콘 튜브 홀더를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 빈 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, aros wells에서 고리를 제거하고 미디어로 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 사용하기 전에 실리콘 튜브를 동일한 페트리 접시에 넣어 적십니다.

집게를 사용하여 실리콘 튜브의 끝을 링 중앙에 놓고 링을 실리콘 튜브에 부드럽게 밀어 넣습니다. 튜브를 따라 양방향으로 연속적으로 부드럽게 밀어 링을 서로 접촉하도록 밀어 넣습니다. 링이 장착되면 폴리카보네이트 홀더 내에 실리콘 튜브를 정렬하고 홀더의 두 부분을 함께 나사로 조입니다.

페트리 접시에 55ml의 미디어를 추가합니다. 조직 튜브를 제거하기 위해 배양 기간 동안 3일마다 배지를 교체하십시오. 먼저 페트리 접시에 PBS를 채웁니다.

그런 다음 폴리카보네이트 홀더에서 실리콘 튜브를 분리하고 집게를 사용하여 조직 튜브를 실리콘 튜브에서 접시로 밀어 넣습니다. 올바르게 수행되면 세포는 aros wells의 바닥에 침전하고 안착 후 24시간 이내에 수축하여 Agarro s well의 중앙 기둥 주위에 조직 고리를 생성하는데, 이는 쥐 평활근 세포에서 생성된 2mm 조직 고리의 단축 인장 시험에서 얻은 응력 변형률 곡선의 대표적인 플롯입니다. 그런 다음 극한 인장 강도, 최대 인장 계수 및 파괴 변형률 값을 사용하여 서로 다른 배양 매개변수에서 성장한 조직 고리 샘플의 기계적 특성을 비교합니다.

조직 고리의 기계적 특성은 세포 좌석 수, 배양 길이, 배양 배지 및 사용된 세포 유형을 포함한 배양 매개변수를 변경하여 제어할 수 있습니다. 쥐 평활근 세포 외에도. 인간의 일차 평활근 세포는 유사한 인장 강도를 가진 조직 고리를 형성합니다.

인간 중간엽 줄기세포도 응결하여 고리를 형성하지만 기계적 테스트를 할 만큼 강하지 않았습니다. 당사의 시스템은 당사의 맞춤형 aros well에 세포를 파종하는 것만으로 세포로부터 완전히 엔지니어링된 조직 구조를 제작할 수 있습니다. 초기 폴리카보네이트 주형이 가공되면 PDMS 템플릿을 무제한으로 만들 수 있으며, 이를 사용하여 주형을 제작할 수 있으므로 추가 장비가 필요하지 않습니다.

이 시스템은 조직 고리를 만들기 위해 시스템에서 다양한 세포 유형을 사용했기 때문에 이 시스템은 조직 공학 응용 분야뿐만 아니라 조직 구조 및 기능에 대한 세포 및 세포 외 기질의 기여도에 대한 체외 연구에도 잠재적으로 사용될 수 있습니다.