Name: 자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 평활근 세포를 이용한 자기 조립 조직 링 제작 방법을 통해 세포 외 기질의 역할을 분석하고 기계적 특성을 평가하는 조직 공학 기술을. 이 방법은 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.

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저자는 기꺼이 CNC 가공과 그의 도움 닐 Whitehouse (WPI, 히긴스의 기계 공장)을 인정합니다. 또한, 우리는 Camtasia와 도움을 MATLAB 프로그래밍뿐만 아니라, 케이트 음료와 요셉 Cotnoir (WPI 학술 기술 센터)와 그녀의 도움 아드리 아나 헤라를 (WPI 컴퓨팅 및 커뮤니케이션 센터) 감사드립니다. 소피 벅 및 Jacleen 베커 (WPI 학술 기술 센터)는 보충 영상을 제공했습니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (R15 HL097332), UMass 의과 대학 - WPI 파일럿 연구 이니셔티브, 미국 심장 협회 (JZH에 학부 연구 활동) 및 우스터 폴리 테크닉 대학 (JZH 및 기관에 여름 대학의 연구 활동에 의해 투자되었다 ) MWR에 자금 업을 시작합니다.

1. 세포 시딩 금형 제조 2mm의 중심지 포스트 직경 15, 둥근 바닥, 환상 우물을 만드는 폴리 카보 네이트의 1 / 2 "두께 부분을 밀링하여 시작합니다. 가공된 채널은 6 깊은 mm 넓은 3.75 mm입니다. 클린 및 폴리 카보 네이트 몰드를 건조 밀링 과정에서 모든 플라스틱 파편을 제거합니다. 모든 공기 방울을 제거하고 폴리 카보 네이트 몰드에 부어으로 치료 대리인, 가스를 제거하다하는 기지의 10시 1분 비율 (W / W)에 혼합 polydimethylsiloxane (PDMS). 가스를 제거하다 다시 남아있는 거품을 제거하고 4 시간 동안 60 ° C에서 오븐에 치료. 일단 치료, 조심스럽게 천천히 폴리 카보 네이트에서 물러나고하여 PDMS 템플릿을 제거 비누와 물로 씻어, 그리고 압력솥. 또한 2퍼센트 아가로 오스 (W / V) Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 용해의 솔루션을 압력솥. 수준의 표면에 PDMS 템플릿을 놓고 용융 아가와 함께 기입 중앙 게시물 금형의 각에 첫번째 pipetting 아가로 오스 상승하고 주변 공간에 pipetting. 아가로 오스가 (약 15 분) 응고하도록 허용 후 PDMS에서 아가로 오스를 공개 금형을 반전. 우물의 각 주위에서 초과 아가로 오스 잘라, 그리고 12 - 잘 접시에 아가로 오스 우물을 넣으십시오. 2. 세포 배양 및 링 시딩 금형의 상단을 포함하지 않고, 아가로 오스 금형의 외부 주위 세포 문화 미디어 (10 % FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM) 추가합니다. 인큐베이터에있는 접시를 놓습니다하고 세포를 준비하는 동안 그들이 약 15 분 동안 평형 수 있습니다. 90 % 합류에서 쥐의 대동맥 평활근 세포 (rSMCs)을 trypsinize 및 5x10 6 세포 / ML의 농도에 resuspend. 각 잘하는 세포를 적용하는 원운동을 사용하여 고리 모양의 아가로 오스 우물의 각으로 세포 현탁액의 피펫 100 μL. 컨텐츠 "&gt; 있는지 인큐베이터 선반이 수준 아르 확인 후 인큐베이터에서 접시를 배치하고 24 시간 동안 그대로 앉아하실 수 있습니다. 교류 매체는 이틀 이후 잘 주위에서 미디어를 aspirating하여 다시 작성 각 잘 때까지 아가로 오스는 잘 완전 침수입니다. 3. 조직 링 수확 및 두께 측정 문화의 결론에서, 중앙 게시물의 맨 위에 그것을 슬라이딩하여 아가로 오스 금형에서 반지를 제거합니다. 인산염과 작은 배양 접시에있는 반지를 놓고는 식염수 (PBS), 센터에게 샘플을 버퍼 및 디지털 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득. 에지 검출을위한 이미지 분석 프로그램을 사용하고 둘레 약 4 위치 (상단, 하단, 왼쪽 및 오른쪽)에있는 고리의 두께를 측정합니다. 각 반지에 대한 의미 두께 값 (t)를 계산하고, 단면적을 계산하려면이 값을 사용(2π (T / 2) 2). 4. 반지의 기계적 시험 수평 위치에 인장 시험기를 (Instron EPS 1000)를 설정합니다. 1N ± 1mN로드 셀 및 사용자 지정 얇은 와이어를 그립 (스테인레스 스틸 와이어를 절곡하여 만든) 연결합니다. 두 얇은 와이어 그립에있는 반지 샘플을 탑재합니다. 5 MN 살갈퀴로드가 샘플에 적용 때까지 그립를 확장합니다. 단면적을 (두께 측정으로부터 계산)를 입력하고 게이지 길이를 기록합니다. 사전 사이클 8 배 10mm / 분 속도로 살갈퀴 하중 50 kPa 응력 사이의 반지. 미리주기 여덟째 후, 10mm / 분 실패로 당기십시오. 실패 한 측정에서 다음 40 % 강제의 감소로 기록됩니다. 각 반지 샘플은 궁극적인 인장 응력 (UTS)와 파괴 변형도를 측정하고 취득한 데이터의 최대 접선 계수 (MTM)를 계산합니다. 5. 조직 링으로sembly 조직 튜브를 조작하는 사용자 정의 튜브 소유자는 직사각형 단편 (2cm × 3 ㎝)과 원형 5cm 폴리 카보 네이트 디스크에서 가공됩니다. 이 홀더가 함께 끝장 수 있도록이 디스크를 통해 스레드 구멍을 드릴. 사용자 정의 튜브 홀더를 압력솥 다음 biosafety 캐비닛과 빈 배양 접시에있는 곳으로 전송할 수 있습니다. beveled 가장자리를 만들 수있는 각도로 1.9 mm 직경의 실리콘 튜브의 끝부분을 잘라 다음 실리콘 튜브를 압력솥에 외과 가위를 사용합니다. 튜브가 autoclaved되고있는 동안, 미디어 페트리 접시를 입력하십시오. 아가로 오스 우물에서 반지를 제거하고 미디어와 페트리 접시에 놓으십시오. 장소 사용하기 전에 그들을 엿먹일 수 같은 배양 접시에있는 실리콘 튜브를 autoclaved. 고리의 중심에 실리콘 튜브의 끝부분을 beveled 장소 부드럽게 실리콘 튜브에 반지를 슬라이드 집게를 사용하십시오. RI의 원하는 번호와 반복ngs. 부드럽게 튜브를 따라 양쪽 방향으로 연속 그들을 밀어 서로 접촉으로 반지를 슬라이드. 이 방법은 문화의 한 다음날 수확 고리 사용할 수 있습니다. 일단 고리는 폴리 카보 네이트 홀더 내에 실리콘 튜브를 정렬하고 함께 홀더의 두 부분을 나사, 탑재하고 있습니다. 100mm 배양 접시에있는 홀더를 놓고 55 ML 미디어를 추가합니다. 문화의 기간 동안 교환 언론 매 3 일. 조직 튜브를 제거하려면, 폴리 카보 네이트 홀더에서 실리콘 튜브를 출시하고 실리콘 튜브를 끄고 PBS 가득한 페트리 접시에 조직 튜브 슬라이드 집게를 사용합니다. 6. 대표 결과 : 프로토콜이 올바르게 수행되면, 세포는 24 시간 이내에 대응하는 금형 게시물의 직경과 동일 내부 직경 조직 반지를 형성 집계. 링 가장자리는 보통 외모에 부드럽고 (있다면 cultur수준의 표면에 에드), 전체 원주 주위의 두께를 균일하고 있습니다. 조직 반지는 취급하기 쉽고 후속 기계 및 histological 분석을 위해 자신의 우물 (Gwyther 외에 참조하십시오. 2011 년 8)에서 제거할 수 있습니다. 조직 링 형태, 매트릭스 구성과 기계적 성질이 씨앗 세포의 수와 유형에 따라 다릅니다. , 세포 유형을 다양한 조건을 퍼뜨리고, 문화의 길이로 만들어진 조직 링의 대표 결과는 표 1에 표시됩니다. 5x10 5 rSMCs에서 만든 두 mm ID의 고리는 우리 이전에 출판 2mm 고리 (6.6x10 5 rSMCs로 만든)에서 만든 반지보다 높은 UTS를 전시. 쥐의 세포, 인간의 평활근 세포 (hSMC)와 마찬가지로 8 즉시 조직을 형성하는 총체적 문화의 겨우 14 일 (데이터가 표시되지 않음) 후 콜라겐의 큰 금액을 포함 반지. 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)도 집계와 응집 고리를 형성하지만, LAuniaxial 인장 시험의 초기 precycling의 단계에서 cked 기계적 강도와 부러 졌어요. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> N </td><td> 핸드폰 번호 </td><td> 두께 (mm) </td><td> 문화의 길이 (일) </td><td> UTS (kPa) </td><td> MTM (kPa) </td><td> 파괴 변형 (㎜ / ㎜) </td></tr><tr><td> rSMC 반지 </td><td> 6 </td><td> 660,000 </td><td> 0.94 ± 0.12 </td><td> 14 </td><td> 97 ± 30 </td><td> 497 ± 91 </td><td> 0.50 ± 0.08 </td></tr><tr><td> rSMC 반지 </td><td> 4 </td><td> 500,000 </td><td> 0.53 ± 0.02 </td><td> 7 </td><td> 113 ± 8 </td><td> 189 ± 15 </td><td> 0.88 ± 0.05 </td></tr><tr><td> hSMC 반지 </td><td> 3 </td><td> 750,000 </td><td> 0.51 ± 0.05 </td><td> 14 </td><td> 160 ± 30 </td><td> 270 ± 20 </td><td> 0.92 ± 0.08 </td></tr><tr><td> hMSC 반지 </td><td> 3 </td><td> 750,000 </td><td> 0.40 ± 0.07 </td><td> 14 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> 표 1. 문화 매개 변수와 다른 세포 유형, 시딩 농도, 그리고 문화에서 발생 기간이 2mm 반지의 기계적 성질을 보여주는 표. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 조직 링 생성 과정 (A) 도식. 가공된 환상 웰스와 (B) 정의 폴리 카보 네이트 몰드. 중앙 포스트 지름은 2mm입니다. 그것은 폴리 카보 네이트 몰드 멀리 벗겨 이후 (C) PDMS 템플릿. (D) 집계 조직 반지는 2mm 포스트와 아가로 오스의 금형에 교양. PBS에서 (E) 2 mm 직경 조직 반지. 스케일 바 = 6mm (B, C)와 2mm (D, E). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 응력 - 변형 곡선 produ 대표 플롯uniaxial 인장 시험에서 뭐하는거야.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

최근 셀 기반 또는 &quot;비계 - 이하&quot;조직 공학 방법 발판 기반 조직 공학 접근의 한계 중 일부를 주소에 관심이 증가되었습니다. 셀 - 파생 조직이 세포에서 생성되고 그들이 생산 매트릭스가, 그들은 본질적으로,보다 높은 세포 밀도를 포함하는 더 외인성 물질을 포함하지 않으며, 인간의 세포와 단백질에서 완전히 만들 수있는 것으로 감안할 때. 인간의 세포로 만든 혈관 이식은 외인성 공사장 공중 발판의 부재 (예 : 버스트 압력 인간 saphenous 정맥을위한 1600 mmHg에 비해 3400 mmHg) 12 상당한 기계적 강도를 얻을 수 있습니다. 셀 기반의 혈관 조직이 개선 세포 밀도와 기계적 강도, 최신 제조 방법 (예 : &quot;시트 기반 엔지니어링&quot;3,4,12 또는 &quot;bioprinting&quot;5,13 등) 전시 있지만 광범위한 문화 기간 (&gt; 3 개월) 필요하거나 3D 조직 건설을위한 전문 장비. 셀 - 파생 조직 링 메스OD 시간이 짧은 기간 내에 그리고 전문 장비를 사용하지 않고 강력한 3D 조직 구조를 형성 급속한 세포 자기 조립을 가능하게 여기 설명했다. 이 프로토콜은 자세한 내용은 우리가 2mm 내경 쥐 평활근 세포 - 파생 조직 반지를 작성하기 위해 개발된 프로 시저를. 현재 예제에서는, 조직 링은 7 일 (다음 링 융합 및 튜브 형성을위한 추가 7 일 동안 교양)에 대한 교양되었습니다. 그러나, 세포 시딩 후 하루가 일찍 2mm의 쥐 (인간) 평활근 세포 고리가 우물에서 제거 (실리콘 튜브에 예를 들어, 전송)을 처리하기에 충분한 응집 아르 수 있습니다. 또한, 내부 지름 (2, 4 및 6mm)을 변화와 함께 강력한 조직 고리는 단순히 원래의 폴리 카보 네이트 몰드의 게시물 직경을 변경하여이 방법으로 만들 수 있습니다. 여덟 우리는 또한 최근에 오 2를 사용하는 폴리 카보 네이트 금형 설계를 수정 하나의 멀티 - 글쎄 아가로 오스 챔버에서 주조 수 mm의 시딩의 우물, 어떤PDMS와 아가로 오스 이하를 사용하고, 6 자 플레이트 (데이터가 표시되지 않음) 중 하나에 잘 맞는 데요. 포스트 직경의 변화는 잘 시딩의 너비가 둥근 하단의 곡률 반경은 시딩의 우물, 또는 시딩의 우물의 깊이의 숫자는 모두 CNC를위한 CAD 파일의 규격을 변경하여 간단하게 수정할 수 있습니다 폴리 카보 네이트 금형의 가공. 마지막으로, 하나의 폴리 카보 네이트 몰드는 PDMS 템플릿 무제한를 조작하는 데 사용할 수 있으며 각 PDMS 템플릿 청소 수 autoclaved와 수십 번 재사용. 기본 쥐 SMCs (셀 응용 프로그램, R354 - 05), 기본 인간의 관상 동맥 SMCs (Lonza, CC - 2583), 기본 인간 : 조직 반지의 크기를 변경하는 것 외에도, 우리는 다음을 포함한 여러 세포 유형에서 반지를 만들었습니다 피부 섬유아 세포 11 조 (박사 조지 핀의 관대한 선물, 의생명 공학의 WPI 공학과), 쥐의 폐 섬유아 세포 (RFL - 6, ATCC CCL - 192) 및 mesenchymal 줄기 세포 (Lonza, 태평양 표준시-2501). 이러한 셀 형식 집계 및 조직 고리를 형성하는 중심 포스트 주위에 계약의 각, 세포 조직, ECM 구성 및 구조의 기계적 물성은 각 세포 유형에 따라 다를 있지만. 각 세포 유형에 대한 시딩 매개 변수는 경험적으로 세포의 크기와 능력 총계에 기초하여 결정되어야합니다. 셀 - 파생 조직 반지를 만드는이 시스템은 매우 다양한 반면 따라서, 프로토콜은 서로 다른 세포 유형과 최적의 조직 형성에 대한 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 설명한대로 조직 링 기하학은 uniaxial 인장 시험에 의해 조직 재료 특성을 쉽게 로딩 및 평가를 용이하게합니다. 혈관 수축과 생리 기능을 측정하기 위해 혈관 링 세그먼트를 사용하기위한 실질적인 전례도있다. 예비 연구는 세포 - 파생 조직 반지는 약리 반응의 측정을위한 와이어 myograph 장치에 설치할 수 있습니다함을수축성 힘 세대 (데이터가 표시되지 않음). 모두, 빠르게, histological 기계적, 생리적 및 생화 학적 분석을 위해 자기 조립 셀 반지를 조작하는 능력은 건강과 질병에 혈관 조직 구조와 기능을 모델링하는 데 유용할 수 있습니다 강력한 새로운 도구를 제안합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 # </th></tr><tr><td> Polydimethylsiloxane (PDMS) </td><td> 다우 코닝 </td><td> Sylgard 184 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> Lonza </td><td> 50,000 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 15-017 - 이력서 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> PAA </td><td> A05 - 201 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Mediatech </td><td> 30-002 - CI </td></tr><tr><td> 디지털 이미징 시스템 </td><td> DVT 주식 회사 </td><td> 모델 630 </td></tr><tr><td> Uniaxial 시험기 </td><td> Instron </td><td> E1000 ElectroPuls </td></tr><tr><td> 가장자리 감지 소프트웨어 </td><td> DVT 주식 회사 </td><td> 프레임 워크 2.4.6 </td></tr></tbody></table>

자기 조립 셀룰러이 biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

매년 환자의 수천 수백 미국의 관상 동맥 바이패스 수술을 받고있다. 이들 환자 중 1 약 1 세 번째 질병의 진행 또는 이전 수확에 의한 적합한 autologous 기증자 선박이 없습니다. 혈관 조직 공학의 목적은 이러한 바이패스 이식에 적합한 대체 소스를 개발하는 것입니다. 또한, 설계된 혈관 조직이 심장 질환을 공부 혈관 모델을 생활로 귀중한 증명할 수 있습니다. 엔지니어링 혈관에 여러 약속 접근이 많은 최근의 연구는 셀 기반 방법의 개발과 분석에 초점을 함께 살펴왔다. 2-5 계약은, 우리는에서 사용할 수있는 3 차원 조직 반지에 신속하게 자기 조립 전지하는 방법을 제시 체외은 혈관 조직을 모델로. 이렇게하려면, 평활근 세포의 정지는 둥근 바닥 환상 아가로 오스 우물에 씨앗을 품고있다. 아가로 오스의 비 접착 특성은 일 수전자 세포가 응집 조직 고리를 형성하기 위해 우물의 중심에 게시 주위, 집계 및 계약을 해결합니다. 6,7이 반지는 이전 기계, 생리, 생화학, 또는 histological 분석을 위해 수확 몇 일 동안 교양 수 있습니다. 우리는이 세포 - 파생 조직 반지 비슷한 기간이 (&lt;30 kPa)에 대한 교양 다른 조직 공학 혈관 구조에 대해 보고된 값을 초과 100-500 kPa 최고의 인장 강도 8시 항복하는 것으로 나타났습니다. 9,10 우리의 결과는 강력한 세포를 입증 - 파생 혈관 조직 고리 생성은 짧은 기간 내에 달성하고, 세포 및 혈관 조직 구조와 기능 세포 파생 매트릭스 (CDM)의 기여의 직접적이고 양적 평가에 대한 기회를 제공하실 수 있습니다.

이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

미국에서는 매년 수십만 명의 환자가 관상동맥 우회술을 받습니다.1 이들 환자의 약 3분의 1은...

본 절차의 전반적인 목표는 기능 분석에 사용할 수 있도록 응집된 세포와 세포 유래 매트릭스로부터 3D 조직 구조체를 제작하는 것입니다. 이는 먼저 폴리카보네이트 몰드를 밀링하여 바닥이 둥근 환형 웰을 제작함으로써 수행됩니다. 그다음, 폴리디메틸실록산(PDMS)을 폴리카보네이트 몰드 위에 캐스팅하여 템플릿을 제작합니다.그런 다음 PDMS 템플릿을 사용하여 aros 웰을 형성합니다. 마지막 단계는 aros 웰에 세포를 파종하여 세포들이 응집되고 응집력 있는 조직 링을 형성하도록 하는 것입니다. 궁극적으로 이 방법은 다양한 세포 유형을 사용하여 세포 자가 조립 및 조직 공학을 달성하는 데 활용될 수 있으며, 세포와 세포 유래 세포외 기질이 조직의 구조와 기능에 기여하는 바를 분석할 수 있게 해줍니다.이 기술이 다른 조직 공학 접근 방식보다 갖는 주요 장점은, 이전 보고보다 더 빠르게 세포와 세포가 생성하는 세포외 기질만으로 조직 구조물을 생성할 수 있으며, 기계적 분석에 유리한 형태로 제작 가능하다는 점입니다. 먼저, 0.5인치 두께의 폴리카보네이트 조각을 밀링하여 중심 기둥 직경이 2mm인 15개의 원형 바닥 환형 웰을 제작합니다. 밀링 과정에서 발생한 플라스틱 파편을 제거하기 위해 폴리카보네이트 몰드를 세척하고 건조시킵니다. 다음으로, PDMS를 베이스와 경화제 비율 10:1로 혼합합니다. 용액 내의 모든 기포를 제거하기 위해 탈기 과정을 거친 후, 이를 폴리카보네이트 몰드에 붓습니다.그 후, 몰드 위의 혼합물을 다시 탈기하여 남아 있는 기포를 제거하고, 60 °C의 오븐에서 4시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. PDMS가 경화되는 동안 DMEM에 2% AROS를 용해합니다. 경화가 완료되면 폴리카보네이트에서 천천히 떼어내어 PDMS 템플릿을 조심스럽게 제거한 다음, 비눗물로 PDMS를 세척하고 DMEM AROS 용액과 함께 오토클레이브합니다. 이제 오토클레이브한 PDMS 템플릿을 평평한 표면에 놓고, 먼저 각 중앙 포스트 몰드에 AROS를 피펫팅한 다음 그 주변 공간에 AROS를 피펫팅하여 용융된 AROS로 채웁니다.aros가 약 15분 동안 굳을 때까지 기다립니다. 그다음 몰드를 뒤집어 PDMS에서 aros를 분리합니다. 각 웰 주변의 과잉 aros를 잘라내고, 12-웰 플레이트의 각 웰에 aros 웰을 하나씩 배치합니다.웰의 상단을 덮지 않도록 주의하며 aros 웰 바깥쪽에 세포 배양 배지를 추가합니다. 그 후, 세포를 준비하는 동안 평형 상태에 도달할 수 있도록 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 90% confluence에 도달하면 쥐 대동맥 평활근 세포를 trypsin 처리하고 재현탁합니다.세포를 5 × 10⁶ cells/mL 농도로 부유시킵니다. 그런 다음 평형화된 aros 웰 각각에 재부유된 세포 현탁액 100 µL를 피펫으로 분주합니다. 이때 원을 그리듯 움직여 세포를 각 웰에 도포합니다.플레이트를 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 그대로 둡니다. 2일에 한 번씩 웰 주변의 배지를 흡입하여 제거한 후, aros 몰드가 완전히 잠길 때까지 각 웰을 다시 채워 배지를 교체합니다. 배양 종료 시, 작은 페트리 접시에 PBS를 채웁니다.각 링을 중앙 포스트 상단으로 밀어 올려 aros 몰드에서 제거합니다. 링을 PBS가 담긴 페트리 접시에 넣고, 디지털 이미징 시스템 아래에 링을 배치합니다. 에지 검출 소프트웨어를 사용하여 링 둘레의 상단, 하단, 좌측, 우측 등 네 군데 지점에서 링의 두께를 측정합니다.단축 인장 시험을 수행합니다. 링 샘플을 두 개의 가는 와이어 그립에 장착합니다. 링에 5 mN의 인열 하중이 가해질 때까지 그립을 늘립니다.그 다음, 두께 측정값으로부터 계산된 단면적을 입력하고 표점 거리를 기록합니다. 링을 파단 하중과 50 kilo pascal 사이에서 8회 사전 사이클링합니다. 8번째 사전 사이클링 후, 10 millimeters per minute의 속도로 응력을 가해 10 millimeters per minute의 속도로 파단될 때까지 당깁니다.각 링에 대해 극한 인장 응력과 파단 변형률을 측정하고, 획득한 데이터로부터 최대 접선 계수를 계산합니다. 기능적 in vitro 연구 외에도, 이러한 살아있는 세포 링들은 융합하여 조직 튜브를 형성할 수 있습니다. 수술용 가위로 실리콘 튜브의 끝부분을 비스듬히 잘라 베벨 엣지를 만든 다음, 실리콘 튜브를 오토클레이브하여 멸균합니다.페트리 접시에 배지를 채웁니다. 멸균된 맞춤형 실리콘 튜브 홀더를 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮겨 빈 페트리 접시에 놓습니다. 다음으로, aros 웰에서 링을 제거하여 배지가 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 사용 전 실리콘 튜브를 적시기 위해 동일한 페트리 접시에 함께 넣습니다.포셉을 사용하여 실리콘 튜브의 끝부분을 링의 중앙에 배치하고, 링을 실리콘 튜브 위로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 튜브를 따라 양방향으로 링을 순차적으로 가볍게 밀어 링들이 서로 접촉하도록 합니다. 링 장착이 완료되면, 폴리카보네이트 홀더 내에 실리콘 튜브를 정렬하고 홀더의 두 부분을 나사로 조여 결합합니다.페트리 접시에 배지 55 milliliters를 넣습니다. 조직 튜브를 제거하기 위해 배양 기간 동안 3일마다 배지를 교체합니다. 먼저, 페트리 접시를 PBS로 채웁니다.그다음 폴리카보네이트 홀더에서 실리콘 튜브를 분리하고, 핀셋을 사용하여 조직 튜브를 실리콘 튜브에서 밀어내어 디쉬로 옮깁니다. 정확하게 수행되면, 세포가 aros 웰 바닥에 가라앉고 안착 후 24시간 이내에 수축하여 Agarro s 웰의 중앙 포스트 주변에 조직 링을 형성합니다. 이것은 쥐 평활근 세포로 생성된 2 mm 조직 링의 단축 인장 시험에서 얻은 응력-변형률 곡선의 대표적인 그래프입니다. 이후 극한 인장 강도, 최대 인장 탄성률 및 파단 변형률 값을 사용하여 서로 다른 배양 파라미터 하에서 성장한 조직 링 샘플의 기계적 특성을 비교합니다.조직 링의 기계적 특성은 세포 정착 수, 배양 기간, 배양 배지 및 사용된 세포 유형을 포함한 배양 파라미터를 변경하여 조절할 수 있습니다. 쥐 평활근 세포 외에도, 인간 일차 평활근 세포는 유사한 인장 강도를 가진 조직 링을 형성합니다.인간 중간엽 줄기세포 또한 응집되어 링 형태를 형성하지만, 기계적 테스트를 수행하기에는 강도가 충분하지 않았습니다. 본 시스템은 맞춤형 aros 웰에 세포를 시딩하는 것만으로 세포만을 이용해 공학적 조직 구조물을 제작할 수 있게 합니다. 초기 폴리카보네이트 몰드가 가공되고 나면, 이를 이용해 PDMS 템플릿을 무제한으로 제작하여 몰드를 만들 수 있으므로 추가 장비가 필요하지 않습니다.이 시스템은 조직 링을 제작하기 위해 다양한 세포 유형을 적용해 왔을 만큼 다재다능하므로, 조직 공학 응용 분야뿐만 아니라 조직의 구조와 기능에 있어 세포 및 세포외 기질의 기여도를 분석하는 인비트로(in vitro) 연구 모두에 잠재적으로 활용될 수 있습니다.

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다.  이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

이 연구에서는 콜라겐, 평활근 세포 및 내피 세포를 직접 배양하여 살아있는 혈관 조직을 신속하게 만드는 기술을 제시합니다. 또한 엔지니어링된 혈관 조직의 기계적 특성화를 위한 새로운 프로토콜이 설명됩니다.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

이 프로토콜은 에칭된 지형 안내 신호와 하이드로겔 바이오잉크를 함유한 셀의 정밀 증착을 통합하는 자동화된 로봇 증착 시스템을 사용하는 바이오프린팅 방법론을 설명합니다. 프린트된 셀은 에칭된 피처에 직접 전달되어 이를 감지하고 방향을 지정할 수 있습니다.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

확장 가능한 설계 혈관 임상 적용 가능성을 향상시킬 것입니다. 쉽게 상당한 3D 인쇄 가이드 사용, 혈관 평활근의 고리가 생성되었고, 혈관 이식을 형성, 튜브형 형태로 쌓여있다. 이식 단순히 3D 인쇄 된 안내서의 크기를 변화시킴으로써 인간 동맥 치수의 범위를 만족하는 크기로 할 수있다.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

여기 우리는 복잡 한 형상의 설계 조직 히드로-기반 생산에 사용할 수 있는 사용자 지정입니다 금형 날조를 위한 신속 하 고, 손쉬운, 고 저가 방법 제시. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 생산 조작된 심장 조직에서 실시 하는 기계 및 조직학 평가 결과 설명 합니다.

사용자 지정 레이저 에칭 마스터스에서 조직 문화 금형 설계

단일 셀 기반 3 차원 (3D) 어셈블리를 인공 비 계 없이 건설에 대 한 새로운 방법을 설명 합니다.

인공 비 계 없이 안정적인 3D 셀룰러 어셈블리를 생성 하는 살아있는 세포를 조작

여기에 제시된 프로토콜은 기계학 연구, 질병 모델링 및 스크리닝 애플리케이션에 적합한 이중 극이 있는 다중 우물 판에서 48개의 조직의 병렬 배양에 대한 엔지니어링 된 결합 조직을 생성하는 프로토콜입니다. 프로토콜은 다른 장기와 종에서 섬유 아세포와 호환되며 인간의 기본 심장 섬유 아세포와 함께 여기에 예시됩니다.

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.

Human Dermal Fibroblast를 이용한 Self-Assembled Cell Sheet Culture 및 3D Tendon/Ligament-like Organoid의 수동 생성 시연

배우세요 평활근 세포를 이용한 자기 조립 조직 링 제작 방법을 통해 세포 외 기질의 역할을 분석하고 기계적 특성을 평가하는 조직 공학 기술을. 이 방법은 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

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