망막 섹션 Morphometric 분석

안녕하세요, 저는 홍콩 대학교 해부학과의 신경퇴행성질환 연구실의 Regina입니다. 오늘은 망막 절편의 진행 분석 방법을 보여드리겠습니다. 시작하기에 앞서, 분석을 수행하기 전 망막 샘플 절편 4개를 준비하여 H&E 염색을 진행합니다.

그 후, 망막 세션은 상부 주변 영역, 상부 중심 영역, 하부 중심 영역, 하부 주변 영역의 네 가지 영역으로 나뉩니다. 영역을 정의한 후, decor의 명시야 현미경을 사용하여 10배 및 40배 배율에서 각 영역의 이미지를 획득합니다.

이제 망막 형태 정보를 분석할 준비가 되었습니다. 본 세션에서는 내핵층의 망막 두께를 측정하는 방법을 시연합니다. thorough investigator라는 소프트웨어를 실행하십시오.

40 types를 선택한 다음, 메인 툴바에서 이미지 열기를 선택하십시오. 파일 탭에서 분석하고자 하는 망막 영역의 이미지를 선택하십시오. 메인 툴바의 드롭다운 메뉴에서 등고선 종류를 선택하십시오.

자동 이동 기능이 켜져 있는지 확인하십시오. 확대 버튼을 클릭하여 이미지를 크게 볼 수 있습니다. 축소 버튼을 사용하여 이미지 표시 크기를 줄일 수 있습니다.

추적선과 시편은 이동 버튼을 클릭하여 네 가지 서로 다른 방향으로 이동시킬 수 있습니다. 추적 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 단순 균열 추적(simple crack tracing)을 선택하십시오. 내층의 안쪽 경계를 따라 연속선을 그리십시오.

실수가 발생한 경우, 트레이싱 창에서 중단하고 실행 취소 버튼을 눌러 마지막으로 그려진 점을 삭제하십시오. 선의 마지막 점까지 트레이싱을 계속합니다. 그리기가 완료되면 트레이싱 창에서 중단하고 열린 외곽선(open contour)을 선택한 후, 확대(zoom in)를 클릭하여 이미지를 실행하십시오.

추적 창에서 버튼을 왼쪽 클릭하십시오. 이미지를 확대하려면 마커 표시줄에서 마커를 선택하십시오. 접합 지점에서의 마커입니다.

모든 마커를 추가한 후, 마커 2 바 위치에서 마커 아이콘과 커서를 선택합니다. 마커 중 하나의 중심에서 트레이싱 창을 우클릭하여 탭 2 아래의 quick measure angles를 선택하고, continuous 옵션을 선택합니다. 선택한 마커와 인접한 마커의 중심을 먼저 클릭하여 각도를 측정하십시오.

선분의 끝점에 대해, 관심 영역의 가장 중심부로 이동하십시오. 마커와 균열을 확인하십시오. 다시 고무줄 라인을 inia 층의 외곽 경계까지 확장하고 각도가 90도가 될 때까지 조정하십시오.

원하는 위치의 왼쪽 균열에 커서를 둡니다. 클릭 직후 각도 측정값을 보여주는 대화 상자가 나타납니다. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 엔터 키를 누릅니다.

트레이싱 창을 클릭하여 선이 한쪽 끝에서 새로 선택한 끝점까지 그려지도록 합니다. 트레이싱 창에서 이를 분리하고 오픈 컨트롤을 선택하십시오. 각 영역에서 내핵층 핑거(inner nuclear layer fingers)의 측정값을 4회 측정해야 하며, 이에 따라 4개의 선을 그려야 합니다.

대조군 기저부 밤(night)에서 핵 외곽 경계까지 수직으로 선을 긋고, 경계가 명확히 보이도록 이미지를 확대합니다. 선의 끝점이 핵 외곽 층의 바깥쪽에 위치하지 않은 경우, 편집 모드에서 선을 연결하거나 길이를 줄일 수 있습니다. 편집 모드를 선택하고 해당 선을 지정하십시오.

트레이싱 창을 클릭한 후 전기 제어의 검색 지점을 선택하고, 점 편집 시 동일 선상에 있도록 외곽 경계에 점을 추가합니다. 기존의 점을 삭제하면 새로운 리프트와 정렬된 상태를 얻을 수 있습니다.

축소 버튼을 클릭하여 이미지의 크기를 줄입니다. 편집 모드를 해제하고 마지막 선분을 그립니다. 순서선을 그린 후, 편집 모드를 선택합니다.

트레이싱 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 네 개의 선분을 각각 배치합니다. 이제 CONT 측정 버튼을 눌러 네 가지 측정값을 얻을 수 있습니다. 이 네 가지 측정값을 선택하고 복사 버튼을 클릭하여 전문가에게 전달합니다.

파일 탭 아래의 '다른 이름으로 저장'을 클릭하십시오. 추적 데이터는 데이터 파일로 저장할 수 있습니다. 이 섹션에서는 red tail gagan 세포의 수를 정량화하기 위해 '이미지 열기'를 선택하겠습니다.

파일 탭에서 분석하고자 하는 망막 영역의 이미지를 선택하십시오. 우선, 어떤 것이 살아있는 세포이고 어떤 것이 사멸한 세포인지 식별해야 합니다. 대략적으로 둥근 모양이며 핵이 뚜렷하게 관찰되는 세포를 살아있는 망막 신경절 세포로 간주합니다.

작고 응집된 세포들은 해당 세포로 간주합니다. 상단 툴바의 드롭다운 메뉴에서 컨투어 라인(contour line) 유형을 선택하십시오. 왼쪽 섬유층의 경계를 따라 라인을 그리고, 해당 옵션과 open contour를 사용하여 트레이싱하십시오.

각 끝부분에 마커를 추가하며, 하나는 선의 끝부분에, 다른 하나는 팀 근처의 위치에 추가합니다. 마커 2 바에서 마커 아이콘을 선택하십시오. 커서를 마커의 중앙에 위치시킵니다.

팁에서는 탭 아래의 quick measure angles를 선택하십시오. 트레이싱 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 continuous 옵션을 선택한 다음, rubber band 라인을 사용하여 19 degree의 각도를 측정합니다. 달러 박스가 잡힌 직후 Enter 키를 누르십시오.

하지만 동시에 마우스가 여전히 남아 있다는 점을 기억하십시오. 팁에서 새로운 선이 특별히 연장될 수 있도록 트레이싱 창을 끊어주십시오. 트레이싱 창을 끊고 오픈 컨트롤을 선택하십시오.

다른 쪽 끝과 정확히 동일한 방식으로 새로운 선을 하나 더 그립니다. 이렇게 하면 retinal ganglion cells의 수를 측정할 두 개의 경계선이 생성됩니다. 한 종류의 마커를 선택하여 세포 5개당 하나씩 부착합니다.

세포가 닿지 않는 경계선을 제외선으로 선택하십시오. 사멸 세포를 위해 다른 유형의 마커를 선택하십시오. 각 마커 유형의 개수가 마커 아이콘 옆에 표시됩니다.

마커 2 바에서 편집 모드를 선택하고 컨투어 베이스라인을 집어 올립니다. 트레이싱 창에서 이를 끊고 라인을 다시 끝맺습니다. 컨투어 측정 버튼을 누르면 컨투어 베이스라인의 이름을 얻을 수 있습니다.

그 후 세포 수는 mm당 개수로 표현할 수 있습니다. 이제 '파일' 탭 아래에 저장하겠습니다. 트레이싱 및 마커 데이터는 데이터 파일로 저장할 수 있습니다.

이 섹션에서는 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell)의 세포 측면을 측정하는 방법을 시연합니다. 'File' 탭에서 분석하고자 하는 원하는 망막 영역의 이미지를 선택하십시오. 이전 섹션에서 설명한 기준에 따라 살아있는 신경절 세포를 선택하십시오.

그런 다음 life cell에서 메인 툴바의 드롭다운 메뉴를 통해 등고선 종류를 선택하십시오. 트레이싱 창의 오른쪽 끝부분에서 세포의 둘레를 따라 등고선을 그린 후 'end close contour'를 선택하십시오. 세포의 면적은 제어 측정 대화 상자의 'area' 항목 아래에 표시됩니다.

본 영상에서는 망막을 객관적으로 분석할 수 있는 세 가지 간단한 방법을 시연하였습니다. 본 영상이 도움이 되었기를 바랍니다.