향상된 마이크로 및 Nanoparticle 조작에 대한 Plasmonic 및 광자 크리스탈 Nanostructures 활용

이 절차의 전반적인 목표는 플라스모닉 및 광결정 트위저를 사용하여 마이크론 크기의 생물학적 객체를 포획하는 것입니다. 이는 먼저 플라스모닉 기판 또는 광결정 기판을 제작함으로써 달성됩니다. 다음으로, 세포 용액에 BSA를 첨가하고 상단 커버 슬립 아래에 세포 용액을 위한 적절한 간격을 확보하여 생물학적 시료를 준비합니다.

그런 다음 레이저를 적절한 필터 체계가 장착된 현미경에 정렬합니다. 이제 현미경의 초점을 시료에 맞추고 트래핑을 수행합니다. 마지막으로, 플라스모닉 또는 광결정 나노 구조의 도움을 통해 입사 강도를 낮추어 마이크로 또는 나노 크기의 입자를 트래핑할 수 있습니다.

기존의 일반적인 광학 집게와 같은 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 플라스모닉 및 광결정 나노 구조를 통해 광장을 변환함으로써 세포와 같은 작은 입자를 포획하는 데 필요한 강도를 낮출 수 있으며, 빔을 강하게 집속시킬 필요가 없어 방사선 노출로 인한 세포의 광손상 위험을 줄일 수 있다는 점입니다. 이 방법은 세포 간 상호작용 및 생물학적 다양한 힘에 대한 연구와 같이 많은 생물학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 마이크로 및 나노 입자의 정밀한 조작을 가능하게 함으로써 마이크로 및 나노 기술의 제작 공정에 유용한 도구가 될 수 있습니다. e-빔 증착기를 사용하여 금 나노 입자 배열을 형성하려면, 크롬을 접착층으로 사용하여 유리 커버슬립 위에 금을 20 nanometers 두께로 증착하십시오.

표면의 유기 불순물을 제거하기 위해 산소 플라스마를 사용하여 약 1분 동안 샘플을 세척합니다. 폴리스티렌 단분자층의 자기 조립을 유도한 후, 액체를 샘플 위에 드롭 캐스팅하고 약 1시간 동안 배양한 다음, 다량의 물로 흡착되지 않은 구체들을 씻어내고 공기 중에서 건조시킵니다. 마지막으로 단분자층 위에 20 nanometer 두께의 금 층을 추가로 증착하여 라텍스 구체 단분자층을 무작위 금 나노입자 배열로 형성합니다.

이제 나노입자 어레이에 생물학적 시료를 처리할 준비가 되었습니다. 준비된 나노입자 슬라이드를 형광 현미경의 스테이지 위에 놓으십시오. 다음 단계는 광학 트래핑을 위해 마우스 세포핵을 준비하는 것입니다.

핵이 기판에 부착되는 것을 방지하기 위해 아님 오렌지(aine orange)로 표지된 마우스 세포핵으로 시작합니다. 세포핵을 소형 바이알에 넣고, 볼텍싱으로 혼합하여 1%에서 10% 농도의 PBS 내 BSA를 첨가합니다. 그런 다음, 준비된 슬라이드 위에 세포핵 BSA 용액 5 µL를 피펫으로 분주합니다.

핵과 커버슬립 사이에 간격을 두기 위해, 액적 주변에 스페이서 커버슬립 두 장을 쌓아 올린 후 그 위에 다른 커버슬립 한 장을 더 덮습니다. 포획 및 동시 이미징을 위해서는 바이패스된 여기 필터와 두 개의 맞춤형 다이크로익 빔 스플리터를 포함하여 특수하게 구성된 형광 현미경 설정을 사용합니다. 광학 집게는 GFP 17 필터 세트가 장착된 zeiss axio imager D one M 현미경을 통해 35 mW 헬륨 네온 레이저를 조사하여 구성하며, 633 nm 레이저 방사선이 샘플에 도달할 수 있도록 현미경을 수정하여 사용합니다.

현미경이 레이저 빔을 시료에 초점 맞추면, 빔은 플라스모닉 나노입자 기판 또는 회절 격자에 의해 회절됩니다. 직경이 약 5 µm인 세포핵을 이미징하려면 Neola 50 x 대물렌즈가 장착된 Zeiss LDEC epi plan을 사용하십시오. 먼저 시료를 대물렌즈 위에 놓고, 기판 표면에 위치한 세포핵이 가장 많이 보이는 평면에 초점을 맞추는 것으로 시작하십시오.

다음으로, 세포 표면의 세포층 위에 자유롭게 떠 있는 세포핵을 찾아 포획할 핵에 현미경 초점을 맞춥니다. 그런 다음 입자 위에 레이저 트랩 지점을 위치시킵니다. 이 시점에서 입자는 포획되어야 하며, 스테이지를 이동시키더라도 레이저 지점 내에서 위치를 유지해야 합니다.

현미경의 초점 평면에 있는 마우스 핵은 시료 가열 및 증발로 인해 발생하는 미세한 유체 흐름에 따라 표류할 가능성이 높지만, 트랩 내의 핵은 한 위치에 유지됩니다. 이 그림은 각각의 직경이 약 450 nanometers인 자기 조립 금 나노입자의 주사 전자 현미경 사진을 보여줍니다. 여기는 나노입자 분포가 희소한 플라즈모닉 기판의 근접장 주사 광학 현미경 이미지이며, 근접장 복사를 보여줍니다.

들뜸 레이저의 파장은 633 nanometers이며, 624 nanometers에서 피크를 보이는 플라스모닉 기판의 산란 효율 스펙트럼이 여기에 제시되어 있습니다. 플라스모닉 기판의 흡수 효율 스펙트럼은 668 nanometers에서 피크를 나타냅니다. 금 나노구체들이 1x1 정사각형의 2D 도메인에 무작위로 분포되어 있습니다.

마이크로미터가 여기에 표시되어 있습니다. 각 파란색 원은 나노구의 중심을 나타냅니다. 이 패널들은 무작위 나노구 배열과 평행한 관찰 평면상의 산란장 분포를 보여줍니다.

이 그래프들은 주변 유체의 유량에 따른 트랩을 유지하기 위한 최소 레이저 강도를 보여줍니다. 플라스모닉 트래핑을 활용하여, 모든 광강도는 현미경 대물렌즈 아래의 시료 평면에서 측정되었습니다. 각 패널은 서로 다른 직경을 가진 단일 폴리스티렌 비드의 측정 결과를 나타냅니다.

삽입도는 입자의 해당 현미경 이미지를 보여줍니다. 모든 이미지의 스케일 바는 5 µm의 길이를 나타냅니다. 여기에는 이전 그래프에서 원점을 지나는 피팅 라인의 기울기를 입자 크기에 따라 도식화하여 나타냈습니다.

플라스모닉 트래핑에 대한 결과입니다. 오차 막대는 선형 회귀 분석의 표준 편차를 나타냅니다. 결과에 따르면, 입자의 크기가 클수록 적절한 트래핑 안정성을 유지하기 위해 더 높은 레이저 강도가 필요함을 알 수 있습니다.

이 모식도는 1D 주기적 나노구조를 이용한 강화된 광학 포획을 보여줍니다. 입사 빔은 원거리 장에서 주기적 나노구조에 의해 회절됩니다. 여기에는 알루미늄 그레이딩 표면에서 두 가지 직교 편광을 가진 빛의 강도 분포가 나타나 있습니다.

유한 차분 시간 영역(finite difference time domain) 시뮬레이션을 통해 얻은 417 nanometer 주기를 바탕으로, 분포를 평평한 알루미늄 표면의 강도에 대해 정규화하였습니다. 이 그림들은 입자가 경사 표면 바로 위에 있을 때의 입자 위치에 따른 포획 전위를 보여줍니다. CA 350 nanometer 폴리스티렌 비드와 DA 1 µm 폴리스티렌 비드에 대해, 흰색 원은 입자의 크기를 나타냅니다.

삽입도는 평평한 알루미늄 표면 위의 트래핑 포텐셜을 보여줍니다. 비교를 위해 동일한 입자 크기로 설정하였으며, 값은 각 입자 크기별로 정규화되었습니다.

모든 FDTD 시뮬레이션 그림에서 시야 범위는 10 x 8 µm²입니다. 여기서는 빔 편광이 그레이딩 라인과 수직일 때, 다양한 크기의 폴리스티렌 비즈에 대해 측정된 트랩 효율과 최소 트래핑 강도를 나타냈습니다. 삽입도는 3.87 µm 폴리스티렌 비즈를 그레이딩 룰과 수직 및 평행하게 이동시킬 때의 트랩 효율 비대칭성을 보여줍니다.

입자의 이동 각도에 대한 도식적 표현입니다. 이 삽입도는 다양한 편광 및 입자 크기에 따른 이동 방향 대비 향상도를 보여줍니다. 실선으로 표시된 큰 비대칭성은 입사광이 기울기에 수직으로 편광되었을 때 얻어지며, 파선으로 표시된 경우와 대조됩니다.

구배와 평행하게 편광된 입사광을 사용하여 작은 비대칭성을 얻었습니다. 이 패널들은 형광 590 nanometer 폴리스티렌 비드의 트래핑 시연을 나타냅니다. 레이저 광이 처음에는 너무 희미하여 보이지 않았으므로, 빨간색 원은 레이저 스폿의 위치를 표시합니다.

높은 출력에서는 입자가 스폿 내에 포획됩니다. 출력이 낮아지면 입자의 브라운 운동이 포획력을 이겨내어 입자가 탈출하게 됩니다. 여기서는 형광 표지된 난소암 세포 핵을 포획하였으며, 20 x 대물렌즈를 사용하여 포획을 시작하는 데 필요한 최소 강도는 16 micro watts per micrometer squared로 측정되었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 플라스모닉 및 포토닉 결정 나노 구조 기판을 사용하여 마이크로 및 나노 크기의 생물학적 시료를 비침습적으로 조작하기 위한 저강도 광학 트랩을 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.