타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

이 방법은 안정 동위원소 희석, cnor 상, 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기압, 화학 이온화 및 질량 분석법의 조합을 통해 세포 생체 활성 지질 대사 산물을 정확하게 정량화하는 것을 목표로 합니다. 배지와 세포 샘플을 모두 채취하여 시작하고 internal standard mix라고 표시된 무거운 동위원소를 추가합니다. 유기 용매로 생체 활성 지질을 추출한 다음 전자 포획 시약으로 생체 활성 지질을 유도하고 액체 크로마토그래피로 생체 활성 지질을 정밀하게 정량화합니다.

세포 용해물과 배지 결과의 LCMS 분석을 통한 질량 분석법은 표적 생체 활성 지질의 농도와 개별 Anant ER의 수준을 정확하게 측정합니다. 역상 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 기타 LCMS 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 자동차 순상 크로마토그래피 및 안정화된 동위원소 희석을 사용하여 개별 및 앤터를 정확하게 정량화한다는 것입니다. 결과 데이터는 세포에서 기능하는 효소 경로에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

부착물의 10cm 플레이트당 세포는 10ml 유리 원심분리 튜브에서 3ml의 배지를 수집합니다. 다음으로, PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS 1ml를 첨가하고 플레이트에서 세포를 긁어낸 다음 샘플을 두 번째에서 10ml 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

검량 곡선을 위해 3mL의 PBS가 포함된 8개의 추가 튜브를 준비합니다. 그런 다음 각 튜브에 10마이크로리터의 적절한 보정 표준물질을 추가합니다. 유리 생체 활성 지질 추출을 위해 3밀리리터 채취된 세포 배양 배지의 각 테스트 샘플을 정렬합니다.

각 보정 표준물질에 10마이크로리터의 내부 표준물질 혼합물을 추가하고 실온에서 10분 동안 샘플을 평형화하여 5ml의 다틸 에테르에서 샘플을 처리하고 셰이커에 30분 동안 놓습니다. 샘플을 원심분리하고 상부 유기상을 10ml 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 질소로 샘플을 계속 건조시키십시오.먼저, 원심분리로 수확된 세포 샘플을 수집하고 세포 용해물 정규화를 위해 각 샘플의 25마이크로리터를 Vortex가 2밀리리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다.

이제 각 용해물을 10ml 유리 원심분리기 튜브로 균등하게 나눕니다. 유리 세포 지질을 측정하고 프로스타글란딘과 같은 지질의 알칼리성 분해를 방지하기 위해 각 샘플에 2ml의 PBS와 10마이크로리터의 ISM을 추가로 추가하고, 앞서 표시된 것처럼 각 샘플 복제 중 하나를 사용하여 다틸 에테르 추출을 수행합니다. 에스테르화된 지질을 추출하려면 나머지 샘플 각각에 5ml의 클로로포름 메탄올 혼합물을 추가합니다.

셰이커에 저속으로 30분 동안 놓고 10분 동안 원심분리합니다. 이제 바닥 유기층을 수집하고 샘플을 질소로 건조시켜 에스테르화된 지질을 분해합니다. 각 튜브에 80% 메탄올에 0.5ml의 0.4 일반 수산화칼륨을 추가합니다.

섭씨 60도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 PBS 2 밀리리터를 넣고 진한 염산으로 pH를 2 6으로 조정합니다. 마지막으로, 각 샘플에 10마이크로리터의 ISM을 추가하고 건조된 샘플 및 보정 표준물질에 대한 다틸 에테르 추출을 진행합니다.

유도체화 시약을 지정된 순서로 추가합니다. 그런 다음 샘플을 와류로 만들고 섭씨 60도에서 1시간 동안 배양합니다. 이제 보관 및 분석 전에 샘플을 질소로 건조하십시오.

이 방법은 안정 동위원소 희석, chii, 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기압, 화학 이온화 및 질량 분석 분석의 조합을 사용합니다. 100마이크로리터의 헥산 에탄올로 샘플과 보정 표준물질을 재구성하고 전체 샘플을 HPLC 바이알로 옮기고 샘플을 칠드 오토 샘플러에 넣습니다. 분석을 위한 샘플 목록을 만듭니다.

다음으로, 순상 분리를 위해 함께 제공되는 서면 프로토콜의 표 1 및 표 2에 설명된 매개변수를 사용하여 HPLC 및 MS 분석법을 설정합니다. 카이랄 팩, 섭씨 30도의 DH 컬럼으로 샘플을 주입하고 실행을 시작합니다. 이제 A PCI 소스를 사용하여 MS를 음이온 모드로 설정합니다.

열을 평형화하기 위해 hexane blank로 시작합니다. 다음으로, SM 농도가 증가하는 순서로 검량 표준 샘플을 실행합니다. HBLC 분리 후 배양 배지의 테스트 샘플을 계속 처리합니다.

코로나 바늘에 증착되지 않도록 메탄올 포스트 컬럼을 추가하십시오. 표준에서 생성된 데이터를 사용합니다. Y축에 샘플 면적을 표시하는 검량선을 생성하고, X축에 표준 농도를 표시하여 Y가 MX에 B를 더한 방정식을 도출합니다.

마지막으로, 세포에 대한 생체 활성 지질의 테스트 샘플 농도를 측정합니다. 리사트. 결정된 생체 활성 지질 농도를 플레이트당 세포 수 또는 이전 단계에서 정규화된 총 단백질로 나누어 이러한 값을 정규화합니다. 다중 반응 모니터링의 데이터는 여러 리놀레산과 아라키돈산을 나타냅니다.

산화 된 대사 산물. 13 및 9, 해당 13 및 9 Oxo ode와 함께 유지는 리놀레산에서 파생됩니다. 또한, 아라키돈산(arachidonic acid) 열 대사 산물 및 이들의 산화된 산물도 예상대로 존재합니다.

라벨이 지정되지 않은 표준물질과 비교하여 경감된 내부 표준물질의 보존 시간에 약간의 변화가 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 열과 꽃뇽을 분리하고 아라키돈산의 효소 산화 또는 활성 산소 종과의 반응으로 인해 발생할 수 있는 입체 이성질체에 대한 고유한 전이를 결정한다는 것입니다. 예를 들어, 이 크로마토그램은 5의 r과 s 스테레오 이성질체 사이의 분리를 보여줍니다.

열 지질체 분석은 수많은 지질 종을 분석하기 위한 강력한 기법입니다. 예를 들어, 이 실험은 프로스타글란딘, isop senes 및 leukotriene B 4를 평가하고 정량화합니다. Oxo가 먹는 열과 오메가 하이드록실화 대사 산물 외에도 이 방법은 혈장, 소변 및 조직과 같은 다른 생물학적 매트릭스에서 생체 활성 지질을 추출하는 데 최적화될 수 있습니다.

일부 사례에서는 생체 활성 지질이 산화 스트레스의 반응 바이오마커로 사용되었습니다.