Name: 타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 안정 동위 원소 희석 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 이용한 세포 내 생리활성 지질 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 대사 경로 연구에 정확한 데이터를 제공합니다.

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생체 활성 지질 측정에 사용할 수 있는 대부분의 최신 생물 분석 방법은 키랄 순상 크로마토그래피 또는 SID를 포함하지 않기 때문에 광범위하지 않습니다. 키랄 순상 LC는 거울상 이성질체의 분리와 효소 또는 ROS 매개 대사를 구별할 수 있는 능력에 중요합니다. SID를 사용하면 추출 또는 분석 중에 발생하는 인적 오류나 합병증이 정량화 중에 고려됩니다. ECAPCI-MRM과 함께 이러한 추가 성분으로 인해 이 방법은 생체 활성 지질 분석에 사용할 수 있는 가장 민감하고 선택적인 방법입니다.

1. 표준 및 내부 표준 믹스
<ol>
	<li>지질 추출 전에 표준 혼합물(SM)과 내부 표준 혼합물(ISM)을 준비해야 합니다. SM의 경우, 보정된 주사기를 사용하여 아래 시약 표에 나열된 각 표준물질(총 25개)의 1μg과 동등한 부피를 10mL 부피 플라스크에 분취합니다. 표준물질을 질소로 건조시키고 10mL의 아세토니트릴(ACN)로 재용해합니다. 표준 혼합물의 최종 농도는 100pg/μL입니다. 1mL 부분 표본으로 나누고 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	<li>이 표준 혼합물에서 총 7개의 보정 표준(1pg/ μL, 2pg/ μL, 5pg/ μL, 10pg/ μL, 20pg/ μL, 50pg/ μL 및 100pg/ μL)에 대해 6개의 표준 희석을 만들 수 있습니다. 이러한 표준은 정량 분석에 사용되는 검량선을 개발하기 위해 준비된 각 샘플 배치와 함께 실행됩니다.</li>
	<li>ISM의 경우, 아래 시약 표에 나열된 각 IS(총 14개)의 1μg과 동등한 부피를 보정된 주사기를 사용하여 10mL 부피 플라스크에 분취하고 질소로 건조합니다. ACN 10mL에서 ISM을 재구성하고 1mL 부분 표본으로 나눕니다. ISM의 최종 농도는 100pg/μL이어야 합니다. 1000개의 샘플을 처리할 수 있는 충분한 ISM이 있습니다.</li>
	<li>SM 및 ISM은 -80°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>
2. 배지 및 세포 용해물 수집
<ol>
	<li>부착 세포 10cm 플레이트당 (~ 1 X 107)에 대해 10mL 유리 원심 분리 튜브에 3mL의 배지를 수집합니다. 다음으로, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 2회 세척합니다. PBS 1mL를 플레이트에 추가하고 플레이트에서 세포를 긁어낸 후 두 번째 10mL 유리 원심분리 튜브에 피펫을 넣습니다. 이 시점에서 절차가 계속되지 않을 경우 셀과 미디어가 저장될 수 있습니다. 장기 보관을 위해 -80°C에서 샘플을 보관하거나 일주일 미만 동안 -20°C에서 샘플을 보관하십시오.</li>
</ol>
3. 미디어에서 지질 추출
<ol>
	<li>유리 생체 활성 지질은 세포 배지에서 발견되며 이는 1단계 L-L 추출 절차로 쉽게 추출됩니다. 수집된 배지(2.1)에 10μL의 ISM을 추가합니다. 이때 8개의 추가 10mL 유리 원심분리 튜브에 검량 표준물질에 대해 #0-7로 표시해야 합니다. 각 튜브에 PBS 3mL를 추가한 다음 튜브 1-7(1.1에서 1-7)에 적절한 SM 10μL를 추가합니다.</li>
	<li>ISM이 각 보정 표준물질 및 샘플에서 10분 동안 평형을 이룰 때까지 기다린 다음 5mL의 디에틸 에테르를 추가합니다. 그런 다음 샘플과 보정 표준물질을 실온에서 30분 동안 저속으로 셰이커에 넣습니다.</li>
	<li>진탕 후 모든 보정 표준물질과 샘플을 1935 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 상상(유기)을 새로운 10mL 유리 원심분리 튜브로 옮기고 질소로 건조시킵니다.</li>
</ol>
4. 세포 용해물에서 지질 추출
<ol>
	<li>유리 원심분리기 튜브의 세포 샘플을 1935 X g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 폐기하십시오. 각 튜브에 PBS 2mL를 넣고 잠시 소용돌이칩니다. 단백질 정량화를 위해 25μL의 샘플을 제거합니다. 총 단백질은 세포 용해물 정상화에 사용됩니다.</li>
	<li>다음으로, 용해물/PBS 혼합물의 절반을 별도의 10mL 유리 원심분리 튜브로 옮깁니다. 각 샘플에 10μL의 ISM과 함께 2mL의 PBS를 추가합니다. 3.2 및 3.3의 미디어에 대해 설명된 l-l 추출 프로세스를 따릅니다. 이 분취액은 세포 내 유리 지질을 측정하고 프로스타글란딘과 같은 지질의 알칼리성 분해를 방지하는 데 사용됩니다. 이 부분 표본은 아래에 설명된 4.3 및 4.4 단계를 거치지 않습니다.</li>
	<li>에스테르화된 지질 l-l 추출 공정의 첫 번째 단계에서는 각 샘플에 5mL의 CHCl3/MeOH(2:1)를 추가해야 합니다. 샘플은 셰이커에서 저속으로 30분 동안 설정됩니다. 진탕 후 샘플을 1935 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 파스퇴르 피펫을 사용하여 l-l 추출의 바닥(유기) 층을 새로운 10mL 유리 원심분리 튜브로 옮기고 샘플을 질소로 건조시킵니다.</li>
	<li>에스테르화된 지질은 정량화 전에 비누화해야 합니다. 샘플이 건조되면 각 튜브에 80% MeOH에 0.4N KOH 0.5mL를 추가합니다. 그런 다음 샘플을 60°C에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 PBS 2mL를 첨가합니다. 농축된 HCl산(~30μL)으로 pH를 6으로 조정합니다. 각 샘플에 10μL의 ISM을 추가합니다. 나머지 절차는 배지에서 지질을 추출하는 것과 동일하며 3.2 및 3.3에서 따를 수 있습니다.</li>
	<li>이러한 추출이 매체 샘플과 동시에 실행되는 경우 동일한 보정 표준을 사용하여 보정 곡선을 개발할 수 있습니다. 그러나 이러한 샘플이 다른 시간에 실행되는 경우 보정 표준도 3.1-3.3에 설명된 대로 처리해야 합니다.</li>
</ol>
5. 펜타플루오릴벤질브로마이드(PFB) 유도체화
<ol>
	<li>건조된 샘플 및 보정 표준물질에 100μL의 무수 디클로로메탄(CH2Cl2)을 추가한 다음 무수 CH2Cl2 에 100 μL의 20% (v/v) N,N-디이소프로필에틸아민 100 μL를 추가하고, 마지막으로 무수 CH2Cl2 에 20% (v/v) PFB 100 μL를 추가합니다.</li>
	<li>유도체화 시약을 첨가한 후 샘플을 볼텍스화하고 60°C에서 1시간 동안 배양하고 질소로 건조합니다. 샘플 및 보정 표준물질은 즉시 분석하지 않는 경우 -80°C에서 보관하거나 최대 1주일 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>
6. 안정 동위원소 희석 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기압, 화학 이온화, 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MS) 분석
<ol>
	<li>건조된 샘플과 보정 표준물질은 100μL의 헥산/에탄올(97:3)로 재구성됩니다. 그런 다음 전체 샘플을 인서트와 함께 HPLC 바이알로 옮길 수 있습니다. 샘플을 냉각된 자동시료주입기(4°C)에 넣고 분석을 위한 시료 목록을 만듭니다.</li>
	<li>다음으로, 하기 표 1 및 표 2에 설명된 파라미터를 사용하여 HPLC 및 MS 방법을 설정합니다. 표 3에는 각 지질에 대한 MRM 전이 및 충돌 에너지(CE)와 Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra 분석의 예상 머무름 시간을 포함한 특정 화합물 정보가 포함되어 있습니다. CE는 분석법 개발 중에 각 개별 지질을 조정하여 결정됩니다.</li>
	<li>순상 분리에는 30°C로 가열된 Chiralpak AD-H 컬럼(4.6 X 250mm, 5 μ)이 사용됩니다. 시작 이동상은 98% 헥산 및 2% 메탄올/이소프로판올(1:1)입니다. HPLC 분리 후 메탄올을 컬럼 후(0.75mL/분)에 첨가하여 민감도 감소를 유발할 수 있는 코로나 바늘의 침착을 방지합니다. MS는 APCI 소스를 사용하여 음이온 모드로 설정됩니다. 소스를 ESI에서 APCI로 변경해야 하는 경우 코로나 바늘을 삽입해야 합니다.</li>
	<li>실행해야 하는 첫 번째 샘플은 항상 헥산 블랭크입니다. 이렇게 하면 컬럼이 평형을 이루고 컬럼에 보정 표준 및 샘플 분석을 방해할 수 있는 오염이 있는지 여부도 알 수 있습니다.</li>
	<li>다음 샘플 실행은 0-7(SM 농도 증가) 순서의 보정 표준 샘플이어야 합니다. 이러한 표준은 y축의 표준 영역/IS 영역과 x축의 표준 농도 또는 질량의 비율을 포함하는 보정 곡선을 만드는 데 사용됩니다. 이 플롯에서 파생된 y = mx + b 방정식에서 샘플 면적/IS 면적(y)의 비율을 사용하여 샘플(알 수 없음)의 양 또는 농도(x)를 결정할 수 있습니다.</li>
	<li>배지에서 발견되는 생체 활성 지질의 양은 배지의 총 부피로 정규화될 수 있으며 세포 용해물에서 발견되는 지질의 양은 총 세포/플레이트 수 또는 총 단백질/플레이트의 양으로 정규화될 수 있습니다. 프로토콜의 4.1 동안 세포가 계수되거나 단백질이 정량화되도록 조치를 취해야 합니다.</li>
</ol>
7. 대표 결과:
그림 1의 크로마토그램은 표적 지질체학 프로파일을 나타냅니다. 첫 번째 패널(그림 1A)은 리놀레산에서 파생된 해당 13 및 9-oxoODE와 함께 13-HODE 및 9-HODE를 보여줍니다. 또한, 15-HETE의 산화된 대사산물인 15-oxoETE도 두 번째 패널에 나타나 있습니다. 아래쪽 두 패널에는 20-HETE 및 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE가 표시됩니다. 그림 1B는 AA의 효소 산화 또는 ROS에 의한 HETE 입체이성질체에 대해 결정된 분리 및 고유한 전이를 보여줍니다. 그림 1C는 PG, isoPs 및 LTB4를 나타낸 것입니다. 일부 표준에는 상업적으로 이용 가능한 중수소 IS가 없습니다. 따라서 머무름 시간이 유사한 IS가 정량화에 사용됩니다. 예를 들어, [2H8]-12(S)-HETE는 12(R)-HETE 및 12(S)-HETE 외에 11-HETE 및 8-HETE 종을 정량화하는 데 사용됩니다.
대표적인 크로마토그램을 통해 라벨링되지 않은 표준물질과 비교하여 중수소화된 IS의 머무름에 약간의 변화가 있음이 분명합니다. 이러한 더 늦은 머무름 시간으로의 전환은 순상 컬럼과의 중수소 상호 작용의 결과입니다. 중수소는 수소보다 극성이 더 큽니다. 따라서 컬럼의 정상 위상과 더 강한 상호 작용이 있습니다. 이러한 분리가 역상 컬럼을 사용하여 이루어지는 경우, 극성이 더 높은 부분이 역상과의 상호 작용이 더 약하기 때문에 더 빠른 머무름 시간으로 전환됩니다.
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="그림 1"> 
그림 1. 이 수치는 표적 지질체학 분석의 대표적인 예입니다. 그림 1A는 첫 번째 패널의 13-oxoODE 및 9-oxoODE, 두 번째 패널의 15-oxoETE, 13-HODE 및 9-HODE(패널 3 및 5) 및 20-HETE(패널 7)를 포함한 여러 LA 및 AA 산화 대사산물에 대한 총 이온 크로마토그램(TIC)을 보여줍니다. HODE 및 20-HETE는 아래 패널(4, 6 및 8)에 해당 중수소 IS가 있습니다. 그림 2B의 TIC는 AA에서 파생된 HETE 입체이성체의 분리 및 고유한 전이를 보여줍니다. 그림 2C는 PG, isoP 및 LT를 나타낸 것입니다. 충돌 에너지(CE), MRM 전이 및 머무름 시간(RT, min)은 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra에 결합된 Waters 2695 LC를 사용하여 최적화되었으며 각 화합물에 대해 표 3에 나열되어 있습니다.
&lt;테이블 테두리="1"&gt;
	<tbody>
		<tr>
			<td>시간(분)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% 비</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>의
			<td>2</td> 개
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>98</td>의
			<td>2</td> 개
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>세
			<td>96.4</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>분
			<td>92</td>분
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>분
			<td>92</td>분
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>분
			<td>50</td>의
			<td>50</td>의
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>분
			<td>50</td>의
			<td>50</td>의
		</tr>
		<tr>
			<td>39</td>분
			<td>98</td>의
			<td>2</td> 개
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>의
			<td>98</td>의
			<td>2</td> 개
		</tr>
	</tbody>

표 1. 키랄 정상상 지질체학 분리를 위한 HPLC 그래디언트 조건. 용매 A는 100% 헥산이고 용매 B는 메탄올/이소프로판올(1:1)입니다.
&lt;테이블 테두리="1"&gt;
	<tbody>
		<tr>
			<td>질량 분석기 파라미터</td>
			<td>설정</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>근원</td>
			<td>APCI (태평양</td> 표준시)
		</tr>
		<tr>
			<td>모드</td>
			<td>음이온</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>방법 길이</td>
			<td>40</td>분
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM 스캔 폭</td>
			<td>0.002m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM 스캔 시간</td>
			<td>0.15 초</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM 피크 폭</td>
			<td>0.70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>튜브 렌즈</td>
			<td>164 볼트</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>출처: CID</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q2 충돌 가스</td>
			<td>1.5 유닛</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>기화기 온도</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>모세관 온도</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>방전 전류</td>
			<td>0 μA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>칼집 가스 압력</td>
			<td>25대</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>이온 스윕 압력</td>
			<td>3 유닛</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>보조 가스 압력</td>
			<td>5</td>대
		</tr>
	</tbody>

표 2. 위에는 생체 활성 지질 측정을 위해 최적화된 질량 분석 파라미터가 나열되어 있습니다. 이러한 매개변수는 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra에서 가져온 것입니다.
&lt;테이블 테두리="1"&gt;
	<tbody>
		<tr>
			<td>화합물</td>
			<td>전이</td>
			<td>세륨 (eV)</td>
			<td>RT (분)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-옥소드</td>
			<td>293.03 → 113.10</td>
			<td>21</td>분
			<td>9.9</td> 조
		</tr>
		<tr>
			<td>9-옥소드</td>
			<td>293.03 → 113.10</td>
			<td>21</td>분
			<td>17.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-옥소ETE</td>
			<td>317.05 → 113.18</td>
			<td>18</td>분
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(R)-호드</td>
			<td>295.03 → 195.12</td>
			<td>18</td>분
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(S)-호드</td>
			<td>295.03 → 195.12</td>
			<td>18</td>분
			<td>14.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4] -13 (S) -HODE</td>
			<td>299.03 → 198.12</td>
			<td>18</td>분
			<td>14.9</td>월
		</tr>
		<tr>
			<td>9(R)-호드</td>
			<td>295.03 → 171.10</td>
			<td>18</td>분
			<td>13.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(S)-호드</td>
			<td>295.03 → 171.10</td>
			<td>18</td>분
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4] -9 (S) -HODE</td>
			<td>299.03 → 172.12</td>
			<td>18</td>분
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-헤테</td>
			<td>319.03 → 289.10</td>
			<td>18</td>분
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6] - 20 - 헤테</td>
			<td>325.03 → 295.10</td>
			<td>18</td>분
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>세
			<td>15.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>세
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8] -5 (S) -HETE</td>
			<td>327.04 → 116.04</td>
			<td>16</td>세
			<td>16.4</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-헤테</td>
			<td>319.04 → 179.11</td>
			<td>14</td>분
			<td>11.7</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-헤테</td>
			<td>319.04 → 179.11</td>
			<td>14</td>분
			<td>12.3</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8] -12 (S) -HETE</td>
			<td>327.13 → 184.11</td>
			<td>14</td>분
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 219.12</td>
			<td>13</td>세
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-헤테</td>
			<td>319.04 → 219.12</td>
			<td>13</td>세
			<td>15.9</td> 호
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8] -15 (S) -HETE</td>
			<td>327.03 → 226.12</td>
			<td>13</td>세
			<td>16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-헤테</td>
			<td>319.04 → 167.11</td>
			<td>16</td>세
			<td>11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-헤테</td>
			<td>319.04 → 167.11</td>
			<td>16</td>세
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>세
			<td>11.7</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-헤테</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>세
			<td>12.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTB4</td>
			<td>335.03 → 195.10</td>
			<td>18</td>분
			<td>32.0</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>[2시간4]-LTB4</td>
			<td>339.03 → 197.10</td>
			<td>18</td>분
			<td>32.0</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>페이지2</td>
			<td>351.03 → 271.15</td>
			<td>18</td>분
			<td>31.2</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGE2</td>
			<td>355.03 → 275.15</td>
			<td>18</td>분
			<td>31.2</td>년
		</tr>
		<tr>
			<td>PGD2 (중부</td>)
			<td>351.03 → 271.15</td>
			<td>25</td>분
			<td>32.5</td> 조
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGD2</td>
			<td>355.03 → 275.15</td>
			<td>25</td>분
			<td>32.5</td> 조
		</tr>
		<tr>
			<td>재질 보기 8-iso-PGE 2</td>
			<td>351.03 → 271.15</td>
			<td>18</td>분
			<td>37.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>재질 보기 11β-PGF2</td>
			<td>353.03 → 193.11</td>
			<td>25</td>분
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4] -11β-PGF2</td>
			<td>357.03 → 197.11</td>
			<td>25</td>분
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353.03 → 193.11</td>
			<td>25</td>분
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4] -PGF2α</td>
			<td>357.03 → 197.11</td>
			<td>25</td>분
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGF2α</td>
			<td>353.03 → 193.11</td>
			<td>25</td>분
			<td>34.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4] -8- iso-PGF 2α</td>
			<td>357.03 → 197.11</td>
			<td>25</td>분
			<td>34.4</td>
		</tr>
	</tbody>

표 3. 이 표에는 그림 1A-C의 총 이온 크로마토그램에서 검출된 화합물이 나열되어 있습니다. 두 번째 열은 MRM/MS에 사용되는 전이를 제공하고, 세 번째 열에는 충돌 에너지(CE, eV)가 나열되며, 마지막 열에는 머무름 시간(RT, min)이 나열됩니다. 매개변수는 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra에 결합된 Waters 2695 분리 모듈을 사용하여 최적화되었습니다.

<ol><li>Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arachidonic+acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Arachidonic acid metabolism.</a> Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).</li>
<li>Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereochemical+nature+of+the+products+of+linoleic+acid+oxidation+catalyzed+by+lipoxygenases+from+potato+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).</li>
<li>Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450-derived+eicosanoids%3A+the+neglected+pathway+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Metastasis.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer.</a> Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).</li>
<li>Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+eicosanoids%3A+role+of+prostaglandin+F%282alpha%29+and+F-isoprostanes+in+inflammation+and+oxidative+stress+related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology.</a> Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).</li>
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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이 프로토콜에 사용된 표준 및 내부 표준은 표적 지질체학 방법을 나타냅니다. A: LC-MS 분석에는 Waters 2695 분리 모듈과 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra가 사용되었으며 최적의 파라미터 설정은 표 1 및 2에서 확인할 수 있습니다. 또한 이 추출 프로토콜은 부착 세포용으로 설계되었지만 소변, 혈액 및 조직을 포함한 다른 생물학적 매트릭스뿐만 아니라 다른 세포 유형에 대해 수정될 수 있습니다. 많은 지질 표준이 상업적으로 이용 가능하며 이 분석에 통합될 수 있습니다. 유도체화 절차의 경우 무수 용매와 최고 순도 N,N-디이소프로필에틸아민을 사용하는 것이 중요합니다. LC-MS 분석의 경우 최고 순도의 용매를 사용하는 것도 중요합니다. 이러한 용매는 시약 목록에 나열되어 있습니다. 메탄올의 사후 컬럼 첨가는 코로나 바늘에 증착이 축적되는 것을 방지하는 데에도 중요하므로 분석법의 감도를 크게 감소시킵니다.
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<table><tbody><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7 산</td><td>케이맨 화학</td><td>334250</td><td>[2H7]-5-ox&#8211;TE 내부 표준</td></tr><tr><td>5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산</td><td>케이맨 화학</td><td>334230</td><td>[2H8]-5(S)-HETE 내부 표준</td></tr><tr><td>12S-하이드록시-5Z,8Z,10E,14Z-에이코사테트라렌산-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산</td><td>케이맨 화학</td><td>334570</td> <td>[2H8]-12(S)-HETE 내부 표준</td></tr><tr><td>15S-하이드록시-5Z,8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 산</td><td>케이맨 화학</td><td>334720</td><td>[2H8]-15(S)-HETE 내부 표준</td></tr><tr><td>20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,18,18-d6 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td><td>[2H6]-20-HETE 내부 표준</td></tr><tr><td>9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td><td>[2H4]-9(S)-HODE 내부 표준</td></tr><tr><td>13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 산</td><td>케이맨 화학</td><td>338610</td><td>[2H4]-13(S)-HODE 내부 표준</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 산</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[2H4]-PGF2&alpha; 내부 표준</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 산</td><td>케이맨 화학</td><td>316350</td><td>[2H4]-8-iso-PGF2a 내부 표준</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&#946;.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 산</td><td>케이맨 화학</td><td>10008989</td><td>[2H4]-11&#946;-PGF2 내부 표준</td></tr><tr><td>9&alpha;, 15S-디하이드록시-11-옥소-프로스타-5Z,13E-디엔-1-오익-17,17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 산</td><td>케이맨 화학</td><td>312010</td> <td>[2H4]-PGD2 내부 표준</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 산</td><td>케이맨 화학</td><td>314010</td><td>[2H4]-PGE2 내부 표준</td></tr><tr><td>5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[2H4]-LTB4 내부 표준</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[2H4]-TxB2 내부 표준</td></tr><tr><td>5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-ox&#8211;TE Standard</td></tr><tr><td>15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산</td><td>케이맨 화학</td><td>34730</td><td>15-ox&#8211;TE 표준</td></tr><tr><td>5R-하이드록시-6E,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산</td><td>케이맨 화학</td><td>34225</td><td>5(R)-HETE 표준</td></tr><tr><td>5S-하이드록시-6E,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산</td><td>케이맨 화학</td><td>34230</td><td>5(S)-HETE 표준</td></tr><tr><td>8R-하이드록시-5Z,9E,11Z, 14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8(R)-HETE 표준</td></tr><tr><td>8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8(S)-HETE 표준</td></tr><tr><td>11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11(R)-HETE 표준</td></tr><tr><td>11S-hydroxy-5Z,8Z,12E, 14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11(S)-HETE 표준</td></tr><tr><td>12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34560</td><td>12(R)-HETE 표준</td></tr><tr><td>12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>34570</td><td>12(S)-HETE 표준</td></tr><tr><td>15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, 13E-에이코사테트라엔산</td><td>케이맨 화학</td><td>34710</td><td>15(R)-HETE 표준</td></tr><tr><td>15S-하이드록시-5Z,8Z,11Z,13E-에이코사테트라엔산</td><td>케이맨 화학</td><td>34720</td><td>15(S)-HETE 표준</td></tr><tr><td>20-하이드록시-5Z,8Z,11Z,14Z-에이코사테트라엔산</td><td>케이맨 화학</td><td>90030</td><td>20-HETE 표준</td></tr><tr><td>9R-하이드록시-10E,12Z-옥타데카디에노산</td><td>케이맨 화학</td><td>38405</td><td>9 (< > R) -HODE 표준</td></tr><tr><td>9S-hydroxy-10E, 12Z-octadecadienoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>38410</td><td>9 ( S) -HODE 표준</td></tr><tr><td>13R-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>38605</td><td>13 ( R) -HODE Standard</td></tr><tr><td>13S-hydroxy-9Z, 11E-octadecadienoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>38610</td><td>13 ( S ) -HODE 표준</td></tr><tr><td>9 &alpha; , 11 &alpha; , 15S - 트리 하이드 록시 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산</td><td>케이맨 화학</td><td>16010</td><td>PGF < 서브 > 2 &alpha; 기준</td></tr><tr><td>9&alpha;,11&alpha;,15S-trihydroxy-(8&#946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>16350</td><td>8-iso-PGF2&alpha; 표준</td></tr><tr><td>9 &alpha; , 11 &# 946; , 15S- 트리 하이드 록시 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산</td><td>케이맨 화학</td><td>16520</td><td>11 &# 946; -PGF < 서브 > 2 < / 서브 > 표준</td></tr><tr><td>9 &alpha; , 15S- 디 하이드 록시 -11- 옥소 - 프로스타 -5Z, 13E- 디엔 -1- 오익 산</td><td>케이맨 화학</td><td>12010</td><td>PGD < 서브 > 2< / 서브 > 표준</td></tr><tr><td>9- 옥소 -11 &알파, 15S- 디 하이드 록시 - (8 &# 946;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>14350</td><td>8-iso-PGE2 Standard</td></tr><tr><td>9-oxo-11&alpha;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>14010</td><td>PGE2 Standard</td></tr><tr><td>5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>20110</td><td>LTB4 Standard</td></tr><tr><td>9&alpha;,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oic acid</td><td>Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB2 Standard</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>GIBCO, by Life</td> Technologies <td>14190</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>시그마-알드리치</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>아크로스 유기물</td><td>61030-1000</td><td>무수</td></tr><tr><td>N,N-디이소프로필에틸 아민</td><td>시그마-알드리치</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>펜타플루오릴벤질 브로마이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>시그마-알드리치</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼</td>륨 <td>플루카</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Fisher Scientific</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 유리 원심분리기 튜브</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>스크류 캡</td></tr><tr><td>페놀 스크류 캡</td><td>Kimble Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Chiralcel ADH 컬럼</td><td>Chiral Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 바이알</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 인서트</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

아라키돈산(AA) 및 리놀레산(LA)과 같은 지방산의 대사는 수많은 입체이성체를 포함하여 산화된 생체 활성 지질의 형성을 초래합니다1,2. 이러한 대사 산물은 유리 또는 에스테르화 지방산으로 형성될 수 있습니다. 이러한 산화된 대사 산물의 대부분은 생물학적 활성을 가지고 있으며 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 천식 및 암을 포함한 다양한 질병과 관련이 있습니다3-7. 산화된 생체 활성 지질은 효소 또는 활성산소종(ROS)에 의해 형성될 수 있습니다. 지방산을 대사하는 효소에는 사이클로옥시게나제(COX), 리폭시게나제(LO) 및 시토크롬 P450(CYPs)1,8이 있습니다. 효소 대사는 거울상 선택적 형성을 초래하는 반면 ROS 산화는 제품의 라세미 형성을 초래합니다.
이 프로토콜은 주로 AA 및 일부 LA 유래 생체 활성 대사 산물의 분석에 중점을 둡니다. 다른 지방산의 대사 산물에 쉽게 적용될 수 있습니다. 생체 활성 지질은 액체-액체(L-L) 추출을 사용하여 세포 용해물 또는 배지에서 추출됩니다. l-l 추출 공정 초기에는 시료 전처리 중 오류를 설명하기 위해 안정 동위원소 내부 표준물질이 추가됩니다. 안정 동위원소 희석(SID)은 또한 질량분석법(MS) 분석9 중에 대사 산물이 경험할 수 있는 이온 억제와 같은 차이를 설명합니다. 추출 후 전자 포획(EC) 시약인 펜타플루오릴벤질 브로마이드(PFB)를 사용하여 검출 감도를 높입니다10,11. 다중 반응 모니터링(MRM)은 MS 분석의 선택성을 높이는 데 사용됩니다. MS 분석 전에 키랄 순상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 지질을 분리합니다. HPLC 조건은 모니터링된 지질12의 거울상 이성질체와 다양한 입체이성체를 분리하도록 최적화되어 있습니다. 이 특정 LC-MS 방법은 프로스타글란딘(PG), 이소프로스탄(isoP), 히드록시에이코사테트라엔산(HETE), 하이드록시옥타데카디에노산(HODE), 옥소에이코사테트라엔산(oxoETE) 및 옥소옥타데카디에노산(oxoODE)을 모니터링합니다. 그러나 HPLC 및 MS 매개변수는 모든 지방산 대사 산물을 포함하도록 최적화할 수 있습니다13.
현재 사용 가능한 대부분의 생물 분석 방법은 거울상 이성질체의 별도 정량화를 고려하지 않습니다. 이것은 대사 산물이 효소로 형성되었는지 아니면 ROS에 의해 형성되었는지 여부를 추론하려고 할 때 매우 중요합니다. 또한, 거울상 이성질체의 비율은 특정 효소 형성 경로에 대한 증거를 제공할 수 있습니다. SID를 사용하면 대사 산물을 정확하게 정량화할 수 있으며 전처리 중 샘플 손실과 이온화 중에 발생하는 차이를 설명할 수 있습니다. PFB 전자 포획 시약을 사용하면 기존 APCI 방법보다 검출 감도가 두 자릿수 증가합니다. 전반적으로 이 방법인 SID-LC-EC-대기압 화학 이온화 APCI-MRM/MS는 생체 활성 지질에 대한 가장 민감하고 선택적이며 정확한 정량 방법 중 하나입니다.

이 프로토콜은 세포에서 유리 및 에스테르화된 생체 활성 지방산의 추출 및 분석을 보여줍니다. 지방산은 안정 동위원소 희석, 키랄 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기 화학 이온화, 다중 반응 모니터링 질량 분석법(SID-LC-ECAPCI-MRM/MS)을 사용하여 정확하게 정량화됩니다.

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

이 방법은 안정 동위원소 희석, cnor 상, 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기압, 화학 이온화 및 질량 분석법의 조합을 통해 세포 생체 활성 지질 대사 산물을 정확하게 정량화하는 것을 목표로 합니다. 배지와 세포 샘플을 모두 채취하여 시작하고 internal standard mix라고 표시된 무거운 동위원소를 추가합니다. 유기 용매로 생체 활성 지질을 추출한 다음 전자 포획 시약으로 생체 활성 지질을 유도하고 액체 크로마토그래피로 생체 활성 지질을 정밀하게 정량화합니다.세포 용해물과 배지 결과의 LCMS 분석을 통한 질량 분석법은 표적 생체 활성 지질의 농도와 개별 Anant ER의 수준을 정확하게 측정합니다. 역상 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 기타 LCMS 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 자동차 순상 크로마토그래피 및 안정화된 동위원소 희석을 사용하여 개별 및 앤터를 정확하게 정량화한다는 것입니다. 결과 데이터는 세포에서 기능하는 효소 경로에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.부착물의 10cm 플레이트당 세포는 10ml 유리 원심분리 튜브에서 3ml의 배지를 수집합니다. 다음으로, PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS 1ml를 첨가하고 플레이트에서 세포를 긁어낸 다음 샘플을 두 번째에서 10ml 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다.검량 곡선을 위해 3mL의 PBS가 포함된 8개의 추가 튜브를 준비합니다. 그런 다음 각 튜브에 10마이크로리터의 적절한 보정 표준물질을 추가합니다. 유리 생체 활성 지질 추출을 위해 3밀리리터 채취된 세포 배양 배지의 각 테스트 샘플을 정렬합니다.각 보정 표준물질에 10마이크로리터의 내부 표준물질 혼합물을 추가하고 실온에서 10분 동안 샘플을 평형화하여 5ml의 다틸 에테르에서 샘플을 처리하고 셰이커에 30분 동안 놓습니다. 샘플을 원심분리하고 상부 유기상을 10ml 유리 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 질소로 샘플을 계속 건조시키십시오.먼저, 원심분리로 수확된 세포 샘플을 수집하고 세포 용해물 정규화를 위해 각 샘플의 25마이크로리터를 Vortex가 2밀리리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다.이제 각 용해물을 10ml 유리 원심분리기 튜브로 균등하게 나눕니다. 유리 세포 지질을 측정하고 프로스타글란딘과 같은 지질의 알칼리성 분해를 방지하기 위해 각 샘플에 2ml의 PBS와 10마이크로리터의 ISM을 추가로 추가하고, 앞서 표시된 것처럼 각 샘플 복제 중 하나를 사용하여 다틸 에테르 추출을 수행합니다. 에스테르화된 지질을 추출하려면 나머지 샘플 각각에 5ml의 클로로포름 메탄올 혼합물을 추가합니다.셰이커에 저속으로 30분 동안 놓고 10분 동안 원심분리합니다. 이제 바닥 유기층을 수집하고 샘플을 질소로 건조시켜 에스테르화된 지질을 분해합니다. 각 튜브에 80% 메탄올에 0.5ml의 0.4 일반 수산화칼륨을 추가합니다.섭씨 60도에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 PBS 2 밀리리터를 넣고 진한 염산으로 pH를 2 6으로 조정합니다. 마지막으로, 각 샘플에 10마이크로리터의 ISM을 추가하고 건조된 샘플 및 보정 표준물질에 대한 다틸 에테르 추출을 진행합니다.유도체화 시약을 지정된 순서로 추가합니다. 그런 다음 샘플을 와류로 만들고 섭씨 60도에서 1시간 동안 배양합니다. 이제 보관 및 분석 전에 샘플을 질소로 건조하십시오.이 방법은 안정 동위원소 희석, chii, 액체 크로마토그래피, 전자 포획, 대기압, 화학 이온화 및 질량 분석 분석의 조합을 사용합니다. 100마이크로리터의 헥산 에탄올로 샘플과 보정 표준물질을 재구성하고 전체 샘플을 HPLC 바이알로 옮기고 샘플을 칠드 오토 샘플러에 넣습니다. 분석을 위한 샘플 목록을 만듭니다.다음으로, 순상 분리를 위해 함께 제공되는 서면 프로토콜의 표 1 및 표 2에 설명된 매개변수를 사용하여 HPLC 및 MS 분석법을 설정합니다. 카이랄 팩, 섭씨 30도의 DH 컬럼으로 샘플을 주입하고 실행을 시작합니다. 이제 A PCI 소스를 사용하여 MS를 음이온 모드로 설정합니다.열을 평형화하기 위해 hexane blank로 시작합니다. 다음으로, SM 농도가 증가하는 순서로 검량 표준 샘플을 실행합니다. HBLC 분리 후 배양 배지의 테스트 샘플을 계속 처리합니다.코로나 바늘에 증착되지 않도록 메탄올 포스트 컬럼을 추가하십시오. 표준에서 생성된 데이터를 사용합니다. Y축에 샘플 면적을 표시하는 검량선을 생성하고, X축에 표준 농도를 표시하여 Y가 MX에 B를 더한 방정식을 도출합니다.마지막으로, 세포에 대한 생체 활성 지질의 테스트 샘플 농도를 측정합니다. 리사트. 결정된 생체 활성 지질 농도를 플레이트당 세포 수 또는 이전 단계에서 정규화된 총 단백질로 나누어 이러한 값을 정규화합니다. 다중 반응 모니터링의 데이터는 여러 리놀레산과 아라키돈산을 나타냅니다.산화 된 대사 산물. 13 및 9, 해당 13 및 9 Oxo ode와 함께 유지는 리놀레산에서 파생됩니다. 또한, 아라키돈산(arachidonic acid) 열 대사 산물 및 이들의 산화된 산물도 예상대로 존재합니다.라벨이 지정되지 않은 표준물질과 비교하여 경감된 내부 표준물질의 보존 시간에 약간의 변화가 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 열과 꽃뇽을 분리하고 아라키돈산의 효소 산화 또는 활성 산소 종과의 반응으로 인해 발생할 수 있는 입체 이성질체에 대한 고유한 전이를 결정한다는 것입니다. 예를 들어, 이 크로마토그램은 5의 r과 s 스테레오 이성질체 사이의 분리를 보여줍니다.열 지질체 분석은 수많은 지질 종을 분석하기 위한 강력한 기법입니다. 예를 들어, 이 실험은 프로스타글란딘, isop senes 및 leukotriene B 4를 평가하고 정량화합니다. Oxo가 먹는 열과 오메가 하이드록실화 대사 산물 외에도 이 방법은 혈장, 소변 및 조직과 같은 다른 생물학적 매트릭스에서 생체 활성 지질을 추출하는 데 최적화될 수 있습니다.일부 사례에서는 생체 활성 지질이 산화 스트레스의 반응 바이오마커로 사용되었습니다.

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.

고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

하나의 샘플을 사용하여 생물학적 조직에서 지질, 대사 산물 및 단백질을 포괄적으로 추출하기위한 프로토콜이 제시됩니다.

단일 시료의 대사 산물, 지질 및 단백질의 종합 분석을위한 간단한 분취 추출 방법

여기, 우리가 현재 계량 하 여 여러 반응 모니터링을 사용 하 여 각 sphingomyelin 종 자격 프로토콜 및 MS/MS/MS 모드, 각각.

LC-MS Isotopically 두 안정을 사용 하 여 Sphingomyelin에 대 한 양적 및 질적 방법 Sphingomyelin 종 분류

이 기사에서는 지질학 및 전사학, 그리고 지질의 근본적인 염증 및 신경 활동, 막 지질, 다운스트림 메신저 및 mRNA 인코딩 효소/수용체를 대상으로 하는 신경 질환 마우스 모델의 혈장 지질학에 대한 모듈식 프로토콜을 제시합니다. 샘플링, 샘플 처리, 추출 및 정량화 절차가 설명되어 있습니다.

신경 질환의 리피도혈 및 전사학

이 방법은 복잡한 숙주 공급원에서 세균막, 특히 황색포도상구균에외인성 지방산의 통합을 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 이를 달성하기 위해, 닭 계란 노른자및 질량 분석법을 활용하는 세균성 인지질의 후속 지방산 프로파일링에서 지단백질 입자의 농축을위한 프로토콜이 설명된다.

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

여기에는 머무름 시간, 이동성 및 단편화를 사용하여 안정 동위원소 라벨링을 통해 지질 구조를 스크리닝하는 방법이 제시되어 있습니다.

안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적

우리는 원형질막의 지질과 외인성 지질 사이의 교환을 매개하기 위해 시클로덱스트린을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 지질 뗏목과 같은 환경에서 뗏목과 같은 환경이 아닌 뗏목과 같은 환경에서 다르게 행동하는 막관통 단백질을 연구하는 실험과 쌍을 이룰 수 있습니다.

살아있는 세포의 지질 교환 분석

배우세요 안정 동위 원소 희석 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 이용한 세포 내 생리활성 지질 정량 분석 방법입니다. 이 기술은 세포 대사 경로 연구에 정확한 데이터를 제공합니다.

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

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