분리 LacZ를 표현 유동세포계측법를 사용하여 마우스 내이 (内耳) 조직의 세포를

다음 실험의 전반적인 목표는 유세포 분석을 사용하여 신생아 마우스 달팽이관에서 느슨한 Z 양성 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 비교적 짧은 시간 내에 많은 수의 마우스 달팽이관을 분리하여 세포가 생존할 수 있도록 하고 적절한 시작 조직을 갖도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, LAX Z 양성 세포를 해리한 다음 분류를 위해 조직을 준비하기 위해 표지합니다.

그런 다음 세포를 유세포 분석법으로 분류합니다. 그 결과 생성된 LAX Z 높은 모집단과 낮은 LAX 모집단은 추가 실험에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 귀 연구 분야의 주요 질문, 예를 들어 내이 내의 유전자 프로필이나 특정 세포 집단이 무엇인지와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Taha Gen A 의대생입니다. 먼저 35mm 페트리 접시에 HBSS를 채우고 얼음 블록에 놓습니다. 그런 다음 홍채 가위를 사용하여 12-15 마리, 산후 0-3 일 된 축삭돌기, 2 마리의 느슨한 기자 및 야생형 쥐를 안락사시킨 후.

얼음 블록의 60mm 페트리 접시에 머리를 놓습니다. 다음으로, 5번 듀몽 집게와 홍채 가위를 사용하여 머리에서 하악골과 혀를 절제한 다음 팔레트 높이에서 두개골 바닥을 자릅니다. 이제 종아리의 위에 있는 피부를 제거하고 구개 중앙의 구멍(foramen magnum)의 아래쪽 부분에 가위를 삽입하여 두개골 기저부를 절제합니다.

가위로 입천장의 절단된 가장자리부터 양쪽 종아리의 상부까지 다시 절개합니다. 이낭이 손상되지 않도록 주의합니다. 그런 다음 골격의 상부 측면에서 시작하여 매그넘이 경구의 관상 절개까지 확장되는 2개의 45도 각도 절개를 만들어 측두골의 분리를 완료합니다.

그런 다음 분리된 측두골을 얼음 블록의 HBSS가 포함된 35mm 페트리 접시에 넣고 얼음 블록을 멸균 해부 후드로 옮깁니다. 다음으로, 이번에는 PBS로 또 다른 35mm 페트리 접시를 채우고 얼음 덩어리 위에 놓습니다. 숫자 55 겸자 2 개를 사용합니다.

이낭 위에 있는 측두골에서 피질, 뇌간 및 소뇌를 부드럽게 제거하여 현저해부를 시작합니다. 그런 다음 이낭을 제거하지 않고 전정 달팽이관 신경 입구에서 시작하여 이낭으로 이어지는 달팽이관 캡슐의 일부를 깎아냅니다. 달팽이관 기저부가 노출된 후 피질 기관과 주변 조직을 부드럽게 빼냅니다.

그런 다음 기저부에서 시작하여 남아 있는 나선형 신경절과 선조체를 제거하고 달팽이관을 PBS 첫 번째 피펫으로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.50마이크로리터의 멸균 PBS를 코팅되지 않은 6웰 배양 접시의 1-2개 웰 중앙에 넣습니다. 그런 다음 20개 이하의 액신, 2개의 느슨한 달팽이관을 PBS의 각 방울로 옮깁니다.

다음으로 0.125%트립신의 50마이크로리터 분취액을 섭씨 37도의 수조에서 약 2분 동안 예열합니다. 그런 다음 트립신을 달팽이관에 추가합니다. 접시를 흔들지 않도록 주의하세요.

달팽이관을 섭씨 37도에서 8분 동안 배양합니다. 각 액적에 50마이크로리터의 대두 트립신 억제제를 첨가하여 트립신 생성을 종료한 다음 P 200 피펫 맨을 125마이크로리터로 설정한 후 50마이크로리터의 전체 배지를 추가로 추가합니다. 300마이크로리터의 뭉툭한 피펫 팁을 사용하여 기포가 생성되지 않도록 주의하면서 세포를 80회 부드럽게 코팅합니다.

그런 다음 각 액적을 분쇄한 후 각각에 200마이크로리터의 전체 매체를 추가로 추가합니다. 이제 40 미크론 세포 여과기를 통해 세포를 새 우물로 통과시킵니다. 동일한 6개의 웰 플레이트 내에서 각 웰의 세포를 개별 표준 팩스 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 3개의 튜브 각각에 100마이크로리터의 야생형 세포를 추가한 다음 CUG 전용으로 300마이크로리터의 전체 배지로 희석합니다. 10마이크로리터의 축삭돌기, 2개의 LAX Z 세포를 390마이크로리터의 전체 배지에 희석하여 제어합니다. 나머지 축삭돌기 2개의 느슨한 Z 세포를 400마이크로리터 OT의 팩스 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 튜브를 10분 동안 배양한 후 각 적절한 팩스 튜브에 200마이크로리터의 희석된 CUG를 추가합니다. 다음으로, 모든 튜브를 빛으로부터 보호하고 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 25분 동안 세포를 배양합니다. 세포가 배양하는 동안 염색을 위해 15ml 튜브에 갓 준비한 10ml의 힙과 FBS를 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 빛 노출을 최소화하기 위해 불을 끈 상태에서 멸균 후드 아래의 각 팩스 튜브에 1.8ml의 얼음처럼 차가운 더미 용액을 추가합니다. 다음으로, 실온에서 5분 동안 1200RPM으로 셀을 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 펠릿을 300마이크로리터의 가득 찬 배지에 다시 현탁시킵니다.

분류 샘플에 대한 모든 부분 표본을 풀링한 다음 프로피듐 요오드화물을 각 적절한 튜브에 최종 농도가 밀리리터당 1마이크로그램이 되도록 추가합니다. 마지막으로 세포를 덮은 후 다시 한 번 얼음 위에 놓습니다. 먼저 염색되지 않은 야생형 세포의 이벤트 1,000개를 수집하여 정방향 산점도와 측면 산점도에서 세포 분포를 결정하여 분류 게이트를 설정합니다.

필요에 따라 전방 및 측면 산란 매개변수를 조정합니다. 그런 다음 염색되지 않은 야생형, PI 염색된 야생형 및 CUG 염색된 축삭돌기로 보상합니다. LAX Z 셀 2개.

두 개의 팩스 튜브를 500마이크로리터의 전체 미디어로 채웁니다. 그런 다음 야생형 PI 염색 및 축삭 2개 Lae CUG 염색 세포 게이트로 분석을 시작하여 전방 대 측면 산란 플롯을 기반으로 파편을 제외합니다. forward scatter height versus forward scatter area plot을 사용하여 doublets와 clumps를 제외합니다.

그런 다음 전방 산란 영역과 PE sci 5 영역 플롯을 기반으로 PI 양성 사체 세포를 제외합니다. 각 보행 배치에 대해 전방 산란 영역 대 캐스케이드 또는 태평양 블루 영역의 플롯을 설정합니다. 야생형 세포의 플롯을 사용하여 야생형 세포로 설정된 모든 게이트를 사용하여 축삭돌기 2개의 느슨한 PI 및 CUG 염색 세포를 포함하는 정렬 샘플 튜브에서 10, 000개의 이벤트를 분석합니다.

총 이벤트 수의 1% 미만인 캐스케이드 블루 상위 셀에 대한 게이트를 생성합니다. 캐스케이드 Blue High Gate는 이제 Axon two laxy 샘플에 있는 세포의 약 15-20%를 포함해야 합니다. Axon two laxy cell analysis plot을 사용하여 이러한 axon two high cells를 만들면 이제 앞서 언급한 게이팅 전략을 사용하여 독감이 가장 적은 15-20%의 세포에 대한 게이트가 생성됩니다.

세포를 가득 찬 매체가 들어 있는 팩스 튜브로 분류하고, 분류하는 동안 수집 튜브를 챔버에 보관하여 섭씨 4도로 냉각합니다. 이 두 그림에 각 개체군에 대해 유세포 분석기로 계수된 세포 수를 기록하십시오. 왼쪽은 해리된 야생형의 측면 산란 영역과 전방 산란 영역, 오른쪽은 축삭돌기 2 LA Z입니다.

달팽이관 세포가 표시됩니다. 파편 음의 개체군으로 지정된 Y축에 더 가까운 이벤트보다 훨씬 더 큰 크기의 고유한 이벤트 그룹의 게이팅에 유의하십시오. 일반적으로 40-45%의 파편이 없는 세포는 이 두 패널의 야생형 및 액신 2개의 LAX Z 달팽이관에서 회수됩니다.

전방 산란 높이 대 전방 산란 영역은 이전에 게이트된 파편에서 이중선을 제외하는 데 사용됩니다. 플롯의 예상 선형 특성에서 벗어나는 음의 모집단 이벤트는 제외됩니다. 이 준비는 일반적으로 지정된 게이트 내에서 71.1%의 이벤트를 생성합니다. 여기.

PE SCI 5 채널에 의해 검출된 Propidium iodide는 이러한 산점도에서 관찰된 죽은 세포를 제외하는 데 사용됩니다. 분류된 세포의 약 95%가 생존 가능했으며 이 패널에서 PI PI를 채택하지 않았습니다. 캐스케이드 블루 채널은 오른쪽 그림과 같이 형광 기판 CUG를 감지하는 데 사용되었습니다.

평균적으로, 상위 약 20%CUG 양성 세포는 약 15, 000 축삭돌기, 10-12 동물당 2개의 높은 세포와 상관관계가 있는 높은 세포입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 튜링 실험과 유전자 프로파일링과 같은 실험 모두에서 내이 조직에서 유세포 분석법을 사용하여 느슨한 높은 세포를 준비하고 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.