의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans

이 절차의 전반적인 목표는 정량적 방식으로 유전자 기능을 분석하고 게놈 전체 규모에서 우아함을 확인하는 것입니다. 이것은 먼저 RNA 눈으로 각 유전자의 발현을 녹다운함으로써 이루어집니다. 96 웰 플레이트에서.

다음으로, 유전자 기능에 대한 관련 검사를 수행합니다. 이 예에서는 곰팡이 감염에 정상적으로 반응하는 바다의 우아함이 유도성 형광 리포터의 발현을 분석하여 평가됩니다. 그런 다음 Coss bio sortt를 사용하여 자동화된 정량 분석을 수행하며, 궁극적으로 특정 경로를 조절하고 발달, 행동 또는 생리학을 관장하는 데 필요한 유전자의 하위 집합을 보여주는 형광 리포터 유전자의 발현과 같은 정량화 가능한 형질을 분석합니다.

이 방법은 발달, 신경 생물학 및 숙주 병원체 상호 작용과 같이 우아하다고 생각되는 다양한 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 Oranger 실험실에서 최초의 대규모 RNA 눈 스크리닝을 발표했을 때 처음 떠올랐습니다. 필요한 도구를 개발하고 자동화를 완벽하게 하는 데 상당한 노력이 필요했습니다.

저는 Jonathan Eubanks 연구소의 직원 과학자이자 연구 조교인 Olivia ti와 함께 10에서 1296을 만들기 위해 절차를 시연할 것입니다. 웰 플레이트는 탈이온수에서 100ml의 선충 성장, 배지 또는 NGM을 준비하는 것으로 시작합니다. 지침은 서면 프로토콜을 참조하십시오.

매체가 여전히 따뜻할 때 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램, 테트라사이클린 4밀리몰 12.5마이크로그램의 IPTG를 추가하고 75웰 플랫 바닥 플레이트의 각 웰에 96마이크로리터를 빠르게 분배합니다. 우물에 존재하는 기포를 즉시 확인하고 제거하십시오. 플레이트는 섭씨 4도의 습한 챔버에 보관하십시오.

다음으로, 암피실린과 테트라사이클린을 함유한 LB 1.5ml를 추가하여 96개의 딥 웰 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 고유한 라벨 또는 바코드를 추가합니다. 각 플레이트를 덮고 미리 준비된 경우 섭씨 4도에서 보관하고 RNAI가 포함된 96웰 LB 스톡 플레이트를 교반합니다.

암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 글리세롤(glycerol)을 함유한 박테리아 클론을 생성하고, 각 박테리아 클론 3마이크로리터를 이전에 제조된 96 딥 웰 플레이트의 해당 웰에 분배합니다. 제어를 위해 빈 우물을 사용하여 96개의 깊은 우물 플레이트를 접착 필름으로 덮고 교반하여 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 사용한 96 웰 복제 플레이트를 야간 배양 다음 날 아침에 섭씨 영하 80도에 놓습니다.

96웰 NGM 플레이트를 섭씨 4도에서 멸균 층류 캐비닛으로 옮기고 5-15분 동안 예열 및 건조시킵니다. 그런 다음 각 플레이트에 적절한 라벨 또는 바코드를 추가합니다. 인큐베이터에서 96개의 깊은 우물 야간 배양 플레이트를 회수합니다.

성공적으로 성장하는 박테리아 배양 원심분리기를 관찰하십시오. 96의 깊은 우물은 4, 000 분당 회전수에 5 분 동안 판습니다. 플레이트를 급격히 거꾸로 뒤집어 상층액을 배출하고 빠르게 건조시킵니다.

종이 타월의 접시 가장자리는 와류에 의해 잔류 액체에 박테리아 펠릿을 재현탁시킵니다. 이상적으로는 각 플레이트가 정확히 동일한 처리를 받을 수 있도록 전용 교반기를 사용하는 것이 좋습니다. 8채널 또는 12채널 멀티 피펫을 사용하여 5마이크로리터의 Resus 부유 박테리아를 96웰 NGM 플레이트로 옮깁니다.

NGM을 만지지 마십시오. 멸균 층류 캐비닛에서 박테리아를 약 2시간 동안 건조시킵니다. NGM이 습한 챔버에서 하룻밤 동안 섭씨 37도의 96웰 R-N-A-I-N-G-M 플레이트인 두 개의 건식 배양이 되지 않도록 정기적으로 확인합니다.

실온에서 96웰 R-N-A-I-N-G-M 플레이트를 냉각한 후 동기화된 웜 개체군을 준비하기 위한 서면 프로토콜을 참조하십시오. M 9개씩 2마이크로리터에 약 100-200개의 웜을 추가합니다. 각 우물마다 벌레가 있는지 확인하십시오.

벌레는 수영해야 합니다. 멸균 층류 캐비닛에서 플레이트를 최대 1시간 동안 건조시킵니다. 플레이트를 정기적으로 확인하십시오.

지렁이는 수영하는 것보다 기어 다녀야 합니다. 접시를 섭씨 25도의 습한 챔버에 밤새 놓습니다. 전염성이 높은 Miria spora의 배치를 선택한 후.

M nine Buffer를 사용하여 9cm 플레이트에서 포자를 수집합니다. 각 웰에 4마이크로리터의 포자를 분배하고 각 웰에 포자가 있는지 확인합니다. 벌레는 수영해야 합니다.

약 1시간 동안 멸균 층류 캐비닛 아래에서 플레이트를 건조시키십시오. 벌레가 기어 다니기 시작할 때까지 접시를 정기적으로 확인하십시오. 그런 다음 감염된 플레이트를 섭씨 25도의 습한 챔버에 밤새 놓습니다.

형광 현미경으로 웜을 빠르게 관찰하여 분석 전에 웜을 검사하여 negative control에서 우수한 GFP 유도 및 positive control well에서 GFP 형광 감소로 성공적인 개발을 확인하십시오. 유도가 양호한 경우 8채널 또는 12채널 멀티 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 50밀리몰 NACL 및 0.05% 트리톤이 있는 웜을 새 라벨 또는 바코드로 옮깁니다. 96 웰 라운드 바닥 플레이트.

분석 당일 분석이 실온에서 동결된 플레이트를 해동할 때까지 플레이트를 섭씨 영하 80도에서 동결합니다. 플레이트가 해동되면. COPA BIOS를 사용하여 자동 분석을 진행합니다.

Sortt: 기계는 플레이트를 잘 처리하고 형광과 같은 각 웜의 매개변수를 분석합니다. COPA bios sortt에서 얻은 정보를 Excel 파일로 기록하여 데이터 품질을 검증합니다. 그런 다음 광학 밀도, 축 방향 길이 및 형광 방출을 포함한 원시 데이터를 사지 패키지에 저장하여 이후의 상세한 정량 분석을 수행합니다.

이 실험에서 형질전환 웜은 P call 12 ds red reporter 및 유도성 PNLP 29 GFP를 구성적으로 발현했습니다. 리포터 웜은 대조군 또는 A-G-F-P-R-N-A 눈 클론에 48시간 동안 노출되었습니다. 왼쪽의 패널은 감염되지 않은 벌레이고 오른쪽의 패널은 D 스포라에 감염된 지 18시간이 지난 벌레입니다.

관심 표현형이 A GFP 리포터의 발현인 경우, GFP RNAi 클론을 가진 gene Wells는 강력한 제어를 제공합니다. COPA bios SORTT는 분석된 각 웜에 대한 수치 데이터를 생성합니다. 이 그래프는 형질전환 벌레의 각 웰에 대한 평균 및 표준 편차를 보여줍니다.

RNAI 및 디아스포라 감염 후 p call 12 DS red reporter 및 inducible PNLP 29 GFP reporter를 구성적으로 표현합니다. 분류기는 벌레의 크기, 적색 형광, 녹색 형광과 TOF의 비율에 해당하는 비행 시간(TOF)을 분석합니다. 특정 클론은 성장 결함을 유발하거나 P12 DS red의 발현에 영향을 미친다.

다른 것들은 특히 FP 발현에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 이 특정 클론은 이전에 NLP 29의 조절에 중요한 것으로 밝혀진 유전자 NS Y를 표적으로 합니다. 녹색 및 적색 형광과 TOF는 임의적이지만 일정한 단위로 측정됩니다.

이 프로토콜의 혁신 중 하나는 분석을 연기하기 위해 동결판을 사용하는 것입니다. 냉동을 통해 여기에 표시된 것처럼 결과를 크게 변경하지 않고 최대 2주 동안 플레이트를 보관할 수 있습니다. 측정된 형광의 절대값은 변경될 수 있지만 상대적 비율은 비슷하게 유지됩니다.

PNLP 29 GFP 및 P call 12 ds red 전이유전자를 운반하는 L 4개의 웜은 디아스포라에 감염되었거나 감염되지 않았습니다. 18시간 후, 각 플레이트를 대략 2개로 나누어 절반은 즉시 분석하고 절반은 영하 80도에서 24시간 동안 동결한 후 해동했습니다. 각 샘플에 대해 평균 크기, 불투명도, 녹색 및 적색 형광에 대한 분석 값을 계산했습니다.

이 그래프는 여기에 표시된 냉동 샘플과 살아있는 샘플에 대한 감염되지 않은 샘플로 나눈 감염자의 평균 비율을 보여줍니다. 대표 플레이트의 중복 분석에는 각 웰에 대한 정규화된 형광 비율이 있으며, 이는 웰의 형광 평균을 플레이트의 절삭 평균으로 나눈 값입니다. 일단 숙달되면, 이 프로토콜은 2-3명으로 구성된 그룹이 2-3개월 내에 게놈 와이드 스크리닝을 수행할 수 있도록 할 수 있습니다.

이 프로토콜을 성공적으로 실행하려면 많은 좋은 팀워크가 필요합니다. 우리 그룹의 구성원들은 효율적이고 비교적 수행하기 쉬운 프로토콜을 만들기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다.