Name: 의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 RNAi를 이용한 정량적 고속 처리량 게놈 전체 스크리닝 방법을 통해 항진균 선천성 면역 관련 유전자를 식별하는 기술을. 자동화된 분석으로 효율적인 유전자 기능 연구가 가능합니다.

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우리는 그들의 공헌에 대해 D. Braendle, CL Kurz와 F. Montañana-Sanchis 감사드립니다. 이 프로젝트 ANR과 Conseil 지역 PACA와 INSERM과 CNRS의 기관 자금 지원에서 교부금에 의해 지원되었다.

<ol><li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Rual, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+molting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans molting.</a> PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).</li>
<li>Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-genome+RNAi+Screen+for+C.+elegans+miRNA+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes.</a> Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+high-throughput+screens%3A+the+C+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model.</a> Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+JR+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).</li>
<li>Cardoso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNP-1%2FATR-X+acts+with+RB%2C+HP1+and+the+NuRD+complex+during+larval+development+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans.</a> Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).</li>
<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+RNAi+of+C.+elegans+Using+the+Hypersensitive+rrf-3+Strain+Reveals+Novel+Gene+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions.</a> PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).</li>
<li>Couillault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).</li>
<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

Ewbank 연구실 연합 Biometrica 및 Modul-바이오와 협력.

<p class="jove_content"&gt; 현재의 프로토콜은 대규모 RNAi 심사에 허용<em&gt; C. elegans</em&gt; 형광 리포터 유전자의 표현의 수준을 같이 읽고 아웃 이용한 고체 매체에. 그것은, 효율적인 신뢰성과 재현성 방식으로, 샘플 다수의 쉽고 빠른 처리를 허용하는 높은 처리량 assays를 촉진하기 위해 자동화된 도구에 최적화되었습니다. 다른 방법은 자동화된 액체 시료 처리에 너무 크게 의존하지 않는 것이 설명되었습니다<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 프로토콜에 대한 하나의 중요한 조직 양상은 회사 ModulBio와 협력 RNAi 화면 프로 시저로 상용 MBioLIMS 소프트웨어를 채택하여 샘플 추적의 강력한 방법의 개발되었습니다. 절차의 모든 단계에서, 접시는 이제 LIMS 내에 생성된 바코드에 의해 식별됩니다. LIMS는 또한 각각의 접시에 각각 우물에 클론의 신원을 기록으로 우물에서 putative 유전자에가는 것은 간단합니다. 그리고이 넘어, 커뮤니티 데이터베이스 WormBase에 LIMS 링크는 특정 유전자에 대한 분자 및 기능적 데이터에 직접 액세스할 수 있도록합니다. LIMS는 분석이 판 또는 염색체와 전체를 게놈 수준에서 실시하기 용이하게합니다. 이러한 분석은 데이터 등 COPAmulti와 같은 이전에 설명된 도구와 완전히 호환되는 방식으로 저장됩니다<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 메서드에 하나의 중요한 실험적 포인트는 벌레의 숫자에 상대적인 음식의 수량의 조정이다. 많은 assays 들어, 웜은 실험 끝에 굶어하지 않는 것이 중요하지만 그것은 시작에 너무 많은 음식을 필요하지 않는 것도 중요합니다. 우리는 음식의 높은 밀도는 P를 옮기는 ​​벌레를 사용하여 프로토콜에 형광 유도를 감소 것을 관찰했습니다<em&gt; nlp-29</em&gt; :: GFP 기자. 벌레가 (학사되지 않은 결과) 너무 많은 박테리아에서 배양해 때이 줄었 감염 효율이 반영됩니다. 이 dsRNA가 최적의 수준에서 생산 여부를 결정 이후 동시에 RNAi 박테리아의 문화 조건도 중요합니다. 대규모 RNAi에 대한 몇 가지 프로토콜은 액체 배양을 퍼뜨리고하기 전에 한천 플레이트에 RNAi 클론의 문화를 필요로<sup&gt; 8</sup&gt;. 우리는이 단계를 생략 강력한 유전자 입을를 취득. 우리는 동질적인 결과를 보장하기 위해 각 문화의 과잉 성장을위한하기로했다. 사실에서 설명한 프로토콜은 병렬로 2 개 또는 3 개의 화면을 수행할 수 있도록 충분한 자료를 제공합니다. 가장 강력한 결과를 얻기의 관심에서 우리의 스크린을 실시하지만, 선호 웜, RNAi 박테리아 및 곰팡이 포자의 독립적인 문화를 사용하여 중복.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 또 다른 중요한 단계는 너무 습해도 너무 건조하지도 매체를 사용하는 것에 관련이있다. 접시가 충분히 건조되지 않으면 RNAi 박테리아가 제대로 건조되지 않고 웜은 분석 중에 수영 것입니다. 이것은 문제가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 웜이 효과적으로 감염되지 않습니다<em&gt; 디 coniospora</em&gt; 액체의 (C. Couillault, 게시되지 않은 결과). 한편, 건조 접시에 배지 증가 osmolarity. 이것은 웜 생리 기능에 직접적인 영향을 가지고<sup&gt; 17</sup&gt;, 등 일부 항균 펩타이드 유전자의 유도를 포함<em&gt; nlp 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. 웜 및 포자를 분배하는 데 사용되는 볼륨은 효과적이고 신속한 건조를 허용하는 것이 중요합니다. 액체 중 10 개 이상 μL가 신선한 접시에 추가되면, 우물은 건조 많은 시간이 걸릴 수 있습니다. 이것은 접시에 벌레를 추가하는 로봇 방법을 사용하기 어렵다는 것을 의미합니다. 예를 들어, 각각의 벌레는 액체의 주위에 1 μL의 Biosort에 의해 적절합니다. 그것은 또한 우리가 침전에 대한 솔루션 웜의 경향을 극복할 수있는대로 저희는 현재 수동으로 벌레를 배포합니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리는 이전에 한 96 - 웰 플레이트가 36분에서 분석을 할 수 있도록 Biosort의 조정보고<sup&gt; 19</sup&gt;. 기계 제조 업체 유비는 이제 더 이상 분석 시간을 줄일 수있는 Biosort의 수정을 제공합니다. &quot;FastReFlex&quot;로 샘플을 직접 버블 트랩 필터를 거치지 않고 분석을위한 흐름 전지를 통해 라우트됩니다. 데이터 수집을위한 시간을 크게 감소의이 결과는, 전체 플레이트가 하루에 치료할 수 있도록 20 접시 주위에있게 22 분 안에 분석할 수 있습니다. 접시는 냉동하지 않은 경우 단, 처음이자 마지막 사람 사이의 8 시간 간격이있을 것입니다. 단지 18 시간 지속되는 감염 실험의 비교적 짧은 기간을 감안할 때, 이것은 번호판에 걸쳐 허용되지 않는 변수를 소개합니다. 냉동 번호판은이 문제를 해결 분석을 이전하지,하지만, 2 사람이 쉽게 50 접시 주일까지 처리할 수있는 현재의 프로토콜 및 표준 액체 처리 로봇과로 그것은 또한 높은 처리량 분석의 맥락에서 중요하다뿐만 아니라. 현재 우리가 일상적으로 화면을 30 접시 주 전체를 게놈 스크린에게 있습니다이하보다 2 개월 만에 한 번 실시합니다.</p&gt;<p class="jove_content"이 프로토콜의&gt; 하나 재미있는 기능은 액체 문화에서 수행할 수없는 assays 수 있도록, 고체 한천을 사용한다는 사실입니다. 웜 생리학은 문화 조건에 따라 다릅니다로서<sup&gt; 20,21</sup&gt;, 고체 배지에 assays는 또한 일반적인 액체 기반의 화면을 보완 수행할 수있는. 특정 phenotypes (예 : 운동) 내용 분석 96 - 웰 고체 배지 플레이트와 직접 진행하실 수 있습니다. 현재 화면의 경우 그러나, Biosort으로 고체 배지 플레이트에서 맛볼 수없는, 웜 먼저 동결되기 전에 액체로 전송됩니다. 한편, COPAS Biosort는 여러 phenotypes의 측정과 호환 multiparametric 정량 분석​​이 이루어질 수 있습니다. 그것은 특정 화면에 대한 모든 측정 매개 변수가 기본 읽기있을 가능성이 높습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 측정치는 여러 가지 이유로 유용할 수 있습니다. 그들은 하나가 검정이 올바르게 실행 여부를 확인할 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 각 우물에 벌레의 숫자와 크기를 확인하실 수 있습니다. RNAi의 클론 성장 또는 복제를 차단해야만이 곳 예상 값의 편차가 있어야합니다. 20 명 미만 웜 또는 / 30 % 더 작은 동물 (TOF)와 웰스 스탄에 비해dard 성장에 취지만 제어 (<em&gt; 예 GFP (RNAi</em&gt;))는 이후 분석에서 제외시킬 수 있습니다. 그들의 개발은 물론 고급 후 이러한 클론 기능은 웜은 RNAi 세균에 노출되는 어떤 점에서 다른 프로토콜을 사용하여 해결할 수<sup&gt; 15</sup&gt;. 다른 매개 변수는 오직 녹색 형광지만 빨간색이 아니라 영향을 미치는 사람을 히트곡을 제한, 예를 들어 후보 유전자 (조회수)을 선택, 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 안타를 선택 선택한 정확한 방법은 화면의 종류와 정확한 읽기 아웃에 따라 달라집니다. 양적 게놈 - 와이드 스크린에서 생성된 데이터의 복잡성을 감안할 때, 통계와의 협력이 필요할 수 있습니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 우리가 설명하는 프로토콜은 쉽게 assays 다른 유형의 적응하실 수 있습니다. 예를 들어, 감염 단계에서<em&gt; 디 coniospora</em&gt; 고체 미디어에 감염될 수있는 다른 병원균에 의해 대체될 수 있습니다. 우리가 액체 문화 Serratia marcescens 감염에 중요한 독성 요소의 많은 고체 매체 (E. Pradel, 개인 통신)에 감염하는 동안 역할을하지 않는 것으로 나타났습니다로서 이것은 잠재적으로 유용합니다. 프로토콜은 또한 화학 화합물의 시험과 완벽하게 호환<sup&gt; 22-24</sup&gt; 또는 박테리아의 다른 라이브러리를 사용 bioactivity와 화합물을 식별하는 방법<sup&gt; 25</sup&gt; 그래서의 일반 유틸리티를 발견해야<em&gt; C. elegans</em&gt; 연구 커뮤니티입니다.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> BactoAgar </td><td> BD 진단 시스템 </td><td> 214,010 </td><td></td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> BactoPeptone </td><td> BD 진단 시스템 </td><td> 211,677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal 접착 필름 </td><td> Dutscher </td><td> 760,214 </td><td></td></tr><tr><td> 이소 프로필 β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG) </td><td> 써모 과학 </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96 깊은 우물을 판 </td><td> 써모 과학 </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96 잘 플랫 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 353,072 </td><td></td></tr><tr><td> 96도 회전 플레이트 </td><td> 매 </td><td> 353,077 </td><td></td></tr><tr><td> 테트라 싸이클린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 </td><td> 모든 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN 로봇 </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> 비가 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> 연합 Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul - 바이오 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 rnai 화면 c. elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA 간섭은 전체를 게놈 규모와 양적 맥락에서 실시한 특히 유전자 기능을 이해하는 강력한 방법입니다. C로 elegans은 유전자 기능은 특정 유전자 하나에 해당하는 dsRNA을 표현 세균과 벌레를 먹이로 간단하고 효율적으로 무너뜨렸다 수 있습니다. RNAi의 클론의 라이브러리의 생성 C.의 대부분을 커버하면서 elegans 게놈 2,3 진정한 기능적 게놈 연구 (예 : 4-7에 대한 참조)를 위해 길을 열었습니다, 대부분의 설립 방법 힘드는 있습니다. Moy와 동료들은 게놈 - 와이드 스크린에게 8을 용이하게 세미 자동화된 프로토콜을 개발했습니다. 접근 방식은 미세한 이미징 및 이미지 분석에 의존합니다. 여기서 우리는 대안 세균성 RNAi 클론, COPAS Biosort (연합 Biometrica (유비)을)를 사용하여 정량 분석​​의 로봇 핸들링을 바탕으로 높은 처리량 게놈 - 와이드 스크린을위한 프로토콜, 그리고을 설명통합 소프트웨어 : MBioLIMS (Modul-바이오의 실험실 정보 관리 시스템) 데이터 관리 및 샘플 추적을위한 향상된 처리량을 제공하는 기술입니다. 방법은 화면이 고체 배지 플레이트에 실시 할 수 있습니다. 이것은 C.에 해당 주소 호스트 병원체 상호 작용과 같은 몇 가지 연구를 위해 특히 중요 elegans, 특정 미생물을 효율적 액체 문화 웜 감염되지 않습니다 때문입니다. 우리는 메서드가 C.의 안티 - 에게선 타고난 면역에 유전자의 중요성을 계량하는 데 사용할 수있는 방법을 보여 elegans. 이 경우, 접근 방식에 constitutively 표현된다 항균 펩타이드 유전자 nlp 29 발기인과 빨간색 형광 기자의 통제하에 GFP으로 표피 감염-inducible 형광 리포터 유전자를 나르는 유전자 변형 변형의 사용에 의존 표피. 후자는 표피의 기능 무결성을위한 내부 통제를 제공그리고 특이 현상 transgene은 9 입을. 제어 웜은 균류에 감염되면 그들은 녹색 형광. RNAi 감염 후 감소된 형광의 nlp 29 표현 결과에 필요한 유전자에 의해 아래로 들렸습니다. 현재이 프로토콜은 3,000 명이 넘는 RNAi의 클론이 덜보다 2 개월 만에 전체 게놈을 분석해의 가능성을 열어, 주당 테스트 및 분석 수 있습니다.

우리가 사용하는 프로토콜을 설명<em&gt; C. elegans</em이러한 형광, 크기와 인구에서 개별 웜의 투명도 등 여러 매개 변수의 자동 측정을 허용&gt;과 RNAi 먹이 라이브러리. 우리의 안티 - 에게선 타고난 면역에 관여 유전자를 식별하는 화면 중 하나를 예를 들면요<em&gt; C. elegans</em&gt;.

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans</em

RNA 간섭(RNA interference)은 특히 전장 유전체 규모로 정량적 맥락에서 수행될 때 유전자 기능을 이해하는 강력한 방법입니다. C. ...

본 절차의 전반적인 목표는 유전자 기능을 정량적인 방식으로 분석하고 게놈 전반의 규모에서 그 정교함을 확인하는 것입니다. 이는 먼저 96-웰 플레이트에서 RNAi를 통해 각 유전자의 발현을 넉다운함으로써 달성됩니다.다음으로, 유전자 기능에 관한 관련 테스트를 수행합니다. 본 예시에서는 유도성 형광 리포터의 발현을 분석하여 진균 감염에 대해 정상적으로 반응하는 sea elegance의 능력을 평가합니다. 그 후 Coss bio sortt를 사용하여 자동 정량 분석을 수행하며, 최종적으로 형광 리포터 유전자의 발현과 같은 정량 가능한 형질의 분석을 통해 특정 경로를 조절하거나 발달, 행동 또는 생리를 지배하는 데 필요한 유전자 하위 집합을 확인합니다.이 방법은 발생학, 신경생물학뿐만 아니라 숙주-병원체 상호작용과 같이 정교함이 돋보이는 다양한 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 저희는 Oranger 연구실에서 최초의 대규모 RNAi 스크리닝 결과가 발표되었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 필요한 도구들을 개발하고 자동화 과정을 완성하기까지 상당한 노력이 필요했습니다.저는 Jonathan Eubanks 연구실의 스태프 사이언티스트이자 연구 보조원인 Olivia ti와 함께 절차를 시연하겠습니다. 10~12개의 96-well 플레이트를 제작하려면, 먼저 탈이온수로 nematode growth medium(NGM) 100 milliliters를 준비하십시오. 자세한 지침은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.배지가 아직 따뜻할 때, 100 µg/mL의 ampicillin, 12.5 µg/mL의 tetracycline, 4 mM의 IPTG를 첨가하고 96-well flat bottom plate의 각 well에 75 µL씩 빠르게 분주합니다. well 내에 기포가 있는지 확인하고 즉시 제거합니다. 플레이트는 4 °C의 습윤 챔버에 보관합니다.다음으로, ampicillin과 tetracycline이 포함된 LB 1.5 milliliters를 첨가하여 96 딥웰 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 고유한 라벨이나 바코드를 부착합니다. 미리 준비한 경우 각 플레이트를 덮어 4 °C에서 보관하며, RNAI가 포함된 96 웰 LB 스톡 플레이트를 교반합니다.암피실린, 테트라사이클린 및 글리세롤을 포함하여 박테리아 클론을 작성하고, 각 박테리아 클론 3 µL를 미리 준비한 96 딥웰 플레이트의 해당 웰에 분주합니다. 대조군으로는 빈 웰을 사용하며, 96 딥웰 플레이트를 접착 필름으로 덮은 후 37 °C에서 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 다음 날 아침에 사용한 96 웰 복제 플레이트를 -80 °C에 보관합니다.4 °C에 보관했던 96웰 NGM 플레이트를 멸균 라미나 플로우 캐비닛으로 옮겨 5~15분 동안 온도를 높이고 건조시킵니다. 그 후 각 플레이트에 적절한 라벨이나 바코드를 부착합니다. 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한 96 딥웰 배양 플레이트를 꺼냅니다.성공적으로 배양된 박테리아 배양액의 원심분리를 관찰하십시오. 96-딥웰 플레이트를 4,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 빠르게 뒤집어 상층액을 제거하고 신속하게 건조시킵니다.종이 타월 위에 플레이트 가장자리를 대고 볼텍싱하여 잔류 액체에 박테리아 펠릿을 재부유시킵니다. 각 플레이트가 정확히 동일한 처리를 받을 수 있도록 전용 교반기를 사용하는 것이 이상적입니다. 8채널 또는 12채널 멀티 피펫을 사용하여 재부유된 박테리아 5 µL를 96웰 NGM 플레이트로 옮깁니다.NGM을 만지지 않도록 주의하십시오. 멸균 라미나 플로우 캐비닛 내에서 박테리아를 약 2시간 동안 건조시킵니다. NGM이 너무 건조해지지 않도록 주기적으로 확인하며, 96-well RNAi NGM 플레이트를 습윤 챔버에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양하십시오.실온에서 96-well R-N-A-I-N-G-M 플레이트를 냉각시킨 후, 동기화된 벌레 집단을 준비하기 위해 서면 프로토콜을 참조하십시오. 각 웰에 2 µL의 M9 배지에 담긴 벌레 약 100~200마리를 추가합니다. 각 웰에 벌레가 들어 있는지 확인하십시오.벌레들이 헤엄치고 있어야 합니다. 플레이트를 멸균 라미나 플로우 캐비닛 내에서 최대 1시간 동안 건조시키십시오. 플레이트 상태를 정기적으로 확인하십시오.벌레들이 수영하는 것이 아니라 기어다니는 상태여야 합니다. 플레이트를 25 °C의 습윤 챔버에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오. 감염력이 높은 Judge Miria spora 배치를 선별한 후입니다.M9 버퍼를 사용하여 9 cm 플레이트에서 포자를 수집하십시오. 각 웰에 포자 4 µL를 분주하고 각 웰에 포자가 있는지 확인하십시오. 벌레들이 헤엄치고 있어야 합니다.플레이트를 멸균 라미나 플로우 캐비닛(laminar flow cabinet) 내에서 약 1시간 동안 건조시킵니다. 벌레들이 기어 다니기 시작할 때까지 플레이트를 주기적으로 확인하십시오. 그 다음, 감염된 플레이트를 습윤 챔버에 넣고 25 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.분석 전, 형광 현미경으로 벌레를 빠르게 관찰하여 정상적으로 발달했는지, 음성 대조군에서는 GFP 유도가 잘 되었는지, 그리고 양성 대조군 웰에서는 GFP 형광이 감소했는지 확인합니다. 유도 상태가 양호하다면, 8채널 또는 12채널 멀티 피펫을 사용하여 100 µL의 50 mM NaCl 및 0.05% Triton으로 벌레를 라벨 또는 바코드가 부착된 새로운 96웰 라운드 바텀 플레이트로 옮깁니다.분석 전까지 플레이트를 -80 °C에서 냉동 보관하고, 분석 당일에 실온에서 해동하십시오. 플레이트가 완전히 해동되면 COPA bios를 사용하여 자동 분석을 진행하십시오.Sortt 장비는 플레이트를 웰 단위로 처리하며 형광과 같은 각 벌레의 파라미터를 분석합니다. 데이터 품질 검증을 위해 COPA bios sortt에서 얻은 정보를 Excel 파일로 기록하십시오. 그런 다음 광학 밀도, 축 길이 및 형광 방출을 포함한 원시 데이터를 limbs 패키지에 저장하여 추후 상세한 정량 분석에 활용하십시오.본 실험에서 형질전환 웜은 P call 12 ds red 리포터와 유도성 PNLP 29 GFP를 지속적으로 발현하였습니다. 리포터 웜을 대조군 또는 A-G-F-P-R-N-A eye 클론에 48시간 동안 노출시켰습니다. 왼쪽 패널은 감염되지 않은 웜이며, 오른쪽 패널은 D spora 감염 18시간 후의 웜입니다.관심 표현형이 GFP 리포터의 발현인 경우, GFP RNAi 클론이 포함된 유전자 웰(well)이 강력한 대조군 역할을 합니다. COPA 바이오소트(bios SORTT)는 분석된 각 웜에 대한 수치 데이터를 생성합니다. 이 그래프들은 형질전환 웜의 각 웰에 대한 평균값과 표준편차를 보여줍니다.RNAi 처리 및 diaspora 감염 후, constitutively 발현되는 p call 12 DS red 리포터와 inducible PNLP 29 GFP 리포터를 분석합니다. 소터는 벌레의 크기에 해당하는 비행 시간(time of flight, TOF), 적색 형광, 그리고 TOF 대비 녹색 형광의 비율을 분석합니다. 특정 클론은 성장 결함을 유발하거나 P 12 DS red의 발현에 영향을 줍니다.다른 것들은 특히 FP 발현에 영향을 줍니다. 예를 들어, 이 특정 클론은 이전에 NLP 29의 조절에 중요한 것으로 밝혀진 NS Y 유전자를 표적으로 합니다. 녹색 및 적색 형광과 TOF는 임의의 일정 단위로 측정됩니다.이 프로토콜의 혁신 중 하나는 분석 시점을 늦추기 위해 플레이트를 냉동하는 것입니다. 여기서 보여주듯이, 냉동 보관을 통해 결과에 실질적인 변화 없이 플레이트를 최대 2주까지 보관할 수 있습니다. 측정된 형광의 절대값은 변할 수 있으나, 상대적인 비율은 유사하게 유지됩니다.PNLP 29 GFP 및 P call 12 ds red 트랜스진을 보유한 L4 단계의 벌레들을 diaspora에 감염시키거나 감염시키지 않았습니다. 18시간 후, 각 플레이트를 대략 두 부분으로 나누어 절반은 즉시 분석하였고, 나머지 절반은 -80 °C에서 24시간 동안 냉동시킨 후 해동하였습니다. 각 시료에 대해 평균 크기, 불투명도, 녹색 및 적색 형광에 대한 분석 값을 산출하였습니다.그래프는 여기에 제시된 동결 샘플과 생존 샘플에 대해 비감염 샘플 대비 감염 샘플의 평균 비율을 보여줍니다. 대표 플레이트의 중복 분석을 통해 각 웰의 정규화된 형광 비율을 산출하였으며, 이는 웰의 형광 평균값을 플레이트의 절사 평균값으로 나눈 값입니다. 이 프로토콜을 숙달하면 2~3명의 인원이 2~3개월 내에 전장 유전체 스크리닝을 수행할 수 있습니다.이 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 원활한 팀워크가 매우 중요합니다. 저희 연구 그룹 구성원들은 효율적이고 비교적 수행하기 쉬운 프로토콜을 만들기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을...

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

우리는에서 대상 유전자와 점수 몸 크기 표현형을 노크 RNAi 먹이 기술을 사용하는 방법을...

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

RNAi는 예쁜꼬마선충 연구자들이 사용할 수 있는 강력한 유전 도구입니다. 이 동영상은 액체 배양 조건을 활용하여 플레이트 공급보다 RNAi로 더 많은 기생충을 처리하는 방법을 소개합니다.

액체 배양에서 RNAi 공급: 예쁜꼬마선충에서 유전자 발현을 knockdown하는 고처리량 방법

출처: Anderson, Q. L. et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 숙주-병원체 상호 작용 중 유전자 녹다운을 연구하기 위해 Caenorhabditis elegans 를 사용하는 고처리량 스크리닝 방법을 보여줍니다. 녹다운 웜을 준비하고 이를 분석 플레이트로 옮겨 병원체 유발 웜 사멸의 효과를 평가하는 절차를 간략하게 설명합니다.

C. elegans 녹다운 스크리닝을 위한 멀티웰 액체 기반 분석

dsRNA에는 C.에 공급하면서 엘레 대규모 공급 화면 현재 프로토콜이 변수 최저 효율 결과 유전자 기능을 평가하는 강력한 도구입니다. 우리는 유전자 발현의 높은 효능 및 재현성 넉다운 결과 대규모의 RNAi 수유 화면을 수행하기위한 개선 된 프로토콜을 설명한다.

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

갤럭시 다윗은 생물 정보학 교육을받지 않은 상태에서 연구자들은 분석하고 RNA-SEQ 데이터를 해석 할 수 있도록 인기있는 도구로 등장했다. C. elegans의 연구원들은 RNA-SEQ 실험, 액세스를 수행 갤럭시를 사용하여 데이터 집합을 처리하고 DAVID를 사용하여 유전자 목록에서 의미있는 생물학적 정보를 얻을 수 있도록 우리는 프로토콜을 설명합니다.

의 Transcriptomic 분석<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; 간스</em갤럭시 프로젝트에 턱시도 제품군을 통해&gt; RNA 시퀀싱 데이터

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

배우세요 C. elegans에서 RNAi를 이용한 정량적 고속 처리량 게놈 전체 스크리닝 방법을 통해 항진균 선천성 면역 관련 유전자를 식별하는 기술을. 자동화된 분석으로 효율적인 유전자 기능 연구가 가능합니다.

의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans

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