의 정량 및 자동화된 고속 처리량 게놈 전체의 RNAi 화면 C. elegans

본 절차의 전반적인 목표는 유전자 기능을 정량적인 방식으로 분석하고 게놈 전반의 규모에서 그 정교함을 확인하는 것입니다. 이는 먼저 96-웰 플레이트에서 RNAi를 통해 각 유전자의 발현을 넉다운함으로써 달성됩니다.

다음으로, 유전자 기능에 관한 관련 테스트를 수행합니다. 본 예시에서는 유도성 형광 리포터의 발현을 분석하여 진균 감염에 대해 정상적으로 반응하는 sea elegance의 능력을 평가합니다. 그 후 Coss bio sortt를 사용하여 자동 정량 분석을 수행하며, 최종적으로 형광 리포터 유전자의 발현과 같은 정량 가능한 형질의 분석을 통해 특정 경로를 조절하거나 발달, 행동 또는 생리를 지배하는 데 필요한 유전자 하위 집합을 확인합니다.

이 방법은 발생학, 신경생물학뿐만 아니라 숙주-병원체 상호작용과 같이 정교함이 돋보이는 다양한 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 저희는 Oranger 연구실에서 최초의 대규모 RNAi 스크리닝 결과가 발표되었을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 필요한 도구들을 개발하고 자동화 과정을 완성하기까지 상당한 노력이 필요했습니다.

저는 Jonathan Eubanks 연구실의 스태프 사이언티스트이자 연구 보조원인 Olivia ti와 함께 절차를 시연하겠습니다. 10~12개의 96-well 플레이트를 제작하려면, 먼저 탈이온수로 nematode growth medium(NGM) 100 milliliters를 준비하십시오. 자세한 지침은 서면 프로토콜을 참조하시기 바랍니다.

배지가 아직 따뜻할 때, 100 µg/mL의 ampicillin, 12.5 µg/mL의 tetracycline, 4 mM의 IPTG를 첨가하고 96-well flat bottom plate의 각 well에 75 µL씩 빠르게 분주합니다. well 내에 기포가 있는지 확인하고 즉시 제거합니다. 플레이트는 4 °C의 습윤 챔버에 보관합니다.

다음으로, ampicillin과 tetracycline이 포함된 LB 1.5 milliliters를 첨가하여 96 딥웰 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 고유한 라벨이나 바코드를 부착합니다. 미리 준비한 경우 각 플레이트를 덮어 4 °C에서 보관하며, RNAI가 포함된 96 웰 LB 스톡 플레이트를 교반합니다.

암피실린, 테트라사이클린 및 글리세롤을 포함하여 박테리아 클론을 작성하고, 각 박테리아 클론 3 µL를 미리 준비한 96 딥웰 플레이트의 해당 웰에 분주합니다. 대조군으로는 빈 웰을 사용하며, 96 딥웰 플레이트를 접착 필름으로 덮은 후 37 °C에서 진탕 배양하며 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양한 다음 날 아침에 사용한 96 웰 복제 플레이트를 -80 °C에 보관합니다.

4 °C에 보관했던 96웰 NGM 플레이트를 멸균 라미나 플로우 캐비닛으로 옮겨 5~15분 동안 온도를 높이고 건조시킵니다. 그 후 각 플레이트에 적절한 라벨이나 바코드를 부착합니다. 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한 96 딥웰 배양 플레이트를 꺼냅니다.

성공적으로 배양된 박테리아 배양액의 원심분리를 관찰하십시오. 96-딥웰 플레이트를 4,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 빠르게 뒤집어 상층액을 제거하고 신속하게 건조시킵니다.

종이 타월 위에 플레이트 가장자리를 대고 볼텍싱하여 잔류 액체에 박테리아 펠릿을 재부유시킵니다. 각 플레이트가 정확히 동일한 처리를 받을 수 있도록 전용 교반기를 사용하는 것이 이상적입니다. 8채널 또는 12채널 멀티 피펫을 사용하여 재부유된 박테리아 5 µL를 96웰 NGM 플레이트로 옮깁니다.

NGM을 만지지 않도록 주의하십시오. 멸균 라미나 플로우 캐비닛 내에서 박테리아를 약 2시간 동안 건조시킵니다. NGM이 너무 건조해지지 않도록 주기적으로 확인하며, 96-well RNAi NGM 플레이트를 습윤 챔버에서 37 °C로 하룻밤 동안 배양하십시오.

실온에서 96-well R-N-A-I-N-G-M 플레이트를 냉각시킨 후, 동기화된 벌레 집단을 준비하기 위해 서면 프로토콜을 참조하십시오. 각 웰에 2 µL의 M9 배지에 담긴 벌레 약 100~200마리를 추가합니다. 각 웰에 벌레가 들어 있는지 확인하십시오.

벌레들이 헤엄치고 있어야 합니다. 플레이트를 멸균 라미나 플로우 캐비닛 내에서 최대 1시간 동안 건조시키십시오. 플레이트 상태를 정기적으로 확인하십시오.

벌레들이 수영하는 것이 아니라 기어다니는 상태여야 합니다. 플레이트를 25 °C의 습윤 챔버에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오. 감염력이 높은 Judge Miria spora 배치를 선별한 후입니다.

M9 버퍼를 사용하여 9 cm 플레이트에서 포자를 수집하십시오. 각 웰에 포자 4 µL를 분주하고 각 웰에 포자가 있는지 확인하십시오. 벌레들이 헤엄치고 있어야 합니다.

플레이트를 멸균 라미나 플로우 캐비닛(laminar flow cabinet) 내에서 약 1시간 동안 건조시킵니다. 벌레들이 기어 다니기 시작할 때까지 플레이트를 주기적으로 확인하십시오. 그 다음, 감염된 플레이트를 습윤 챔버에 넣고 25 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

분석 전, 형광 현미경으로 벌레를 빠르게 관찰하여 정상적으로 발달했는지, 음성 대조군에서는 GFP 유도가 잘 되었는지, 그리고 양성 대조군 웰에서는 GFP 형광이 감소했는지 확인합니다. 유도 상태가 양호하다면, 8채널 또는 12채널 멀티 피펫을 사용하여 100 µL의 50 mM NaCl 및 0.05% Triton으로 벌레를 라벨 또는 바코드가 부착된 새로운 96웰 라운드 바텀 플레이트로 옮깁니다.

분석 전까지 플레이트를 -80 °C에서 냉동 보관하고, 분석 당일에 실온에서 해동하십시오. 플레이트가 완전히 해동되면 COPA bios를 사용하여 자동 분석을 진행하십시오.

Sortt 장비는 플레이트를 웰 단위로 처리하며 형광과 같은 각 벌레의 파라미터를 분석합니다. 데이터 품질 검증을 위해 COPA bios sortt에서 얻은 정보를 Excel 파일로 기록하십시오. 그런 다음 광학 밀도, 축 길이 및 형광 방출을 포함한 원시 데이터를 limbs 패키지에 저장하여 추후 상세한 정량 분석에 활용하십시오.

본 실험에서 형질전환 웜은 P call 12 ds red 리포터와 유도성 PNLP 29 GFP를 지속적으로 발현하였습니다. 리포터 웜을 대조군 또는 A-G-F-P-R-N-A eye 클론에 48시간 동안 노출시켰습니다. 왼쪽 패널은 감염되지 않은 웜이며, 오른쪽 패널은 D spora 감염 18시간 후의 웜입니다.

관심 표현형이 GFP 리포터의 발현인 경우, GFP RNAi 클론이 포함된 유전자 웰(well)이 강력한 대조군 역할을 합니다. COPA 바이오소트(bios SORTT)는 분석된 각 웜에 대한 수치 데이터를 생성합니다. 이 그래프들은 형질전환 웜의 각 웰에 대한 평균값과 표준편차를 보여줍니다.

RNAi 처리 및 diaspora 감염 후, constitutively 발현되는 p call 12 DS red 리포터와 inducible PNLP 29 GFP 리포터를 분석합니다. 소터는 벌레의 크기에 해당하는 비행 시간(time of flight, TOF), 적색 형광, 그리고 TOF 대비 녹색 형광의 비율을 분석합니다. 특정 클론은 성장 결함을 유발하거나 P 12 DS red의 발현에 영향을 줍니다.

다른 것들은 특히 FP 발현에 영향을 줍니다. 예를 들어, 이 특정 클론은 이전에 NLP 29의 조절에 중요한 것으로 밝혀진 NS Y 유전자를 표적으로 합니다. 녹색 및 적색 형광과 TOF는 임의의 일정 단위로 측정됩니다.

이 프로토콜의 혁신 중 하나는 분석 시점을 늦추기 위해 플레이트를 냉동하는 것입니다. 여기서 보여주듯이, 냉동 보관을 통해 결과에 실질적인 변화 없이 플레이트를 최대 2주까지 보관할 수 있습니다. 측정된 형광의 절대값은 변할 수 있으나, 상대적인 비율은 유사하게 유지됩니다.

PNLP 29 GFP 및 P call 12 ds red 트랜스진을 보유한 L4 단계의 벌레들을 diaspora에 감염시키거나 감염시키지 않았습니다. 18시간 후, 각 플레이트를 대략 두 부분으로 나누어 절반은 즉시 분석하였고, 나머지 절반은 -80 °C에서 24시간 동안 냉동시킨 후 해동하였습니다. 각 시료에 대해 평균 크기, 불투명도, 녹색 및 적색 형광에 대한 분석 값을 산출하였습니다.

그래프는 여기에 제시된 동결 샘플과 생존 샘플에 대해 비감염 샘플 대비 감염 샘플의 평균 비율을 보여줍니다. 대표 플레이트의 중복 분석을 통해 각 웰의 정규화된 형광 비율을 산출하였으며, 이는 웰의 형광 평균값을 플레이트의 절사 평균값으로 나눈 값입니다. 이 프로토콜을 숙달하면 2~3명의 인원이 2~3개월 내에 전장 유전체 스크리닝을 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜을 성공적으로 수행하려면 원활한 팀워크가 매우 중요합니다. 저희 연구 그룹 구성원들은 효율적이고 비교적 수행하기 쉬운 프로토콜을 만들기 위해 엄청난 노력을 기울였습니다.