Name: Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 학습하세요 신경퇴행성 질병의 세포 경로를 고내용 이미징과 자동 세포 배양으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 질병 관련 유전자 기능과 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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우리는 기술 지원에 대한 지속적인 지원과 에바 Blaas에 대한 해밀턴 프로그래머와 전문가를 주셔서 감사합니다. T5 - 207 : SJ는 티 - 제약에 의해 지원되며이 작품은 두 NWO 투자 보조금 (911-07-031 및 40-00506-98-10011), Prinses이 Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 신경 과학 캠퍼스 암스테르담에 의해 지원되었다.

1. 자동 자기편 세포 배양 과정 (그림 1) 20 <ol><li> 세포 배양 접시의 입력을위한 자동 세포 배양 시스템을 준비합니다. 로드 소모품 (예 : 피펫 팁, 세포 배양 접시, 검정 접시) 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 사용하여 시스템에. 충분한 세포 배양 매체가 있는지 확인, 인산은 로봇 시스템에 식염수 (PBS)와 트립신을 버퍼. </li><li> SH - SY5Y neuroblastoma 세포주의 접시 당 2 × 10 6 세포와 수동으로 씨앗이 omnitray 번호판입니다. 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 Opti - 가상의 세포를 유지합니다. GUI를 사용하여 세포 배양 로봇에 접시를 넣어. 세포는 37 ° C와 5% CO 2에서 incubated 것입니다. </li><li> 문화 프로토콜 20을 시작되어야하는 세포를 선택하십시오. 하나는 자기편 세포 배양 과정 22, culturing 마우스 피더 세포 23 또는 정지 cel의 culturing에 배아 줄기 (ES) 세포의 확장에서 선택할 수 있습니다혹시 22. </li><li> 자기편 세포 배양 프로토콜 (그림 1)을 선택하고 자기편 세포주 특정 매개 변수 파일이 합류 임계값 (세포를 포함하는 omnitray 판의 지역) 70 %로 설정되도록 조정됩니다 보장합니다. 이분에 총 trypsinization 시간을 설정합니다. </li><li> 접시 당 2 × 10 6 세포의 시딩 셀 번호와, 새로운 omnitray 번호판을 준비하는 로봇을 지시한다. </li><li> 자동 자기편 세포 배양 프로토콜 (그림 1)를 사용하여 세포 배양 시스템에 입력 omnitray 플레이트. 이 프로토콜은 다음과 같은 단계를 포함 : 접시는 incubated들이 미리 정의된 합류 임계값에 도달할 때까지 몇 군데 있습니다. 세포는 5 판독 값 이내에 합류 임계값에 도달하지 않는 경우, 접시는 시스템에서 제거됩니다. 사용자 정의 합류 임계값에 도달되면, 세포는 씻어 trypsinized 및 계산됩니다. 세포의 미리 정의된 번호는 새로운 omnitray 접시에 추가하고있어 세포의 충분한 숫자, 지정된 마비가있는 경우검정 접시의 응급실은 데크로 이송하고 세포의 정의된 숫자가 각 우물에 적절하고 있습니다. 검정 접시 직접 추가 처리를 위해 시스템에서 통합 현미경 또는 출력을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. </li><li> 물론 5,000 세포의 총과 함께 omnitray 플레이트 당 사 분석 접시를 준비 시스템을 지시한다. </li></ol> 2. 검정 접시에 shRNA 바이러스 제작 및 도금 (소요 시간 : 6 일) <ol><li> ampicilin 100 μg / ML (시그마 - 올드 리치)이있는 Luria - Bertani 매체 미디어의 2ml에서 하룻밤 shRNA 벡터 (열기 Biosystems, TRC1)이있는 세균의 글리세롤의 주식을 성장. </li><li> 제조 업체의 프로토콜 (Promega 마법사 MagneSil Tfx) 다음과 같은 plasmids의 압축을 풉니다. </li><li> RNAi 컨소시엄 하이 처리량 Lentiviral 제작 (96 자 판) 프로토콜 24을 사용하여 바이러스를 생산하고 있습니다. 전달에 사용되는 바이러스 입자 복제 - 결함이며, 분할 때문에 lentivirus 작업하는 것은 상대적으로 안전합니다유전자 패키징 전략은 자신의 생산에 사용됩니다. 그러나, lentivirus 작업을 할 때, 추가 biosafety 절차는 자신과 다른 25 위험을 최소화하기 위해 필요합니다. 모든 실험은 MLII 또는 BSL2 안전 수준의 연구실에서 수행되어야합니다. lentivirus 입자와 접촉하고 모든 플라스틱은 (pipettes, 플라스틱 접시, 미디어) 처리하기 전에 24 시간 동안 표백제와 incubated해야합니다. </li><li> 플라스미드 pLKO.1 GFP를 (시그마 - 올드 리치)를 사용하여 GFP 양성 세포의 비율을 결정하여 lentivirus의 감염의 다중성을 (방어)을 계산. </li><li> 입니다만 3와 분석 접시에 접시 lentivirus. </li></ol> 3. Lentiviral 전달 및 SH - SY5Y 세포 (소요 시간 : 6 일)의 분화의 연결 <ol><li> 세포 (1.7 단계 참조) 분석 플레이트에 추가됩니다. 자동 세포 배양 시스템에의 shRNA lentivirus을 포함하는 분석 번호판을로드합니다. </li><li> 24 시간 후에, 미디어검정 접시는 0.5 % FBS 및 차별화 과정을 시작하려면 0.1 μm의 retinoic 산성을 포함 Opti - 가상으로 변경됩니다. SH - SY5Y 세포의 분화는 neuritic 구조의 시각화 수 있도록하고 세포 분열을 동기화합니다. </li><li> 오일에 대한 차별화 미디어의 분석 접시의 배양을 계속합니다. 이것은 목표 유전자 표현의 최대한의 최저을 보장합니다. </li><li> 5 일째, mitochondria에 DJ1의 translocation을 촉진하기 위해 24 시간 동안 분석 접시의 절반 50 μm의 H 2 O 2를 추가합니다. </li><li> 일 6 일에 잘 200 NM의 최종 농도에서 세포 Mitotracker의 CmxROS (Invitrogen)를 추가하고 37 품어 ° C를 30 분. </li><li> 하나는 직접 HC 영상기 또는 접시가 추가 처리를 위해 시스템에서 내보낼 수를 사용하여 이미지 판에 시스템을 지시하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 검정 접시의 자동 immunostaining (소요 시간 : 2 일) 이미지 품질 paramoun입니다민감하고 신뢰할 수있는 HCS를 실시하기 위해 T. 정확 pipetting에 의한 세포 monolayer에 손상이 좋지 이미지 품질과 irreproducible 결과를 초래할 수 있습니다. 셀 계층 피해를 최소화하기 위해 immunostaining는 로봇 스테이션을 사용하여 실시되었다. 절차는 이전 26 설명했습니다 하나 비슷하지만 처리량을 증가시키고 소모품 사용량을 줄이기 위해 정의되었습니다. <ol><li> 100 4 % paraformaldehyde의 μl 37 미리 예열 ° C. 세포와 수정 상온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS는 10 분 0.1 %의 트리톤 (PBST)이있는 200 μl와 분석 번호판을 품어. </li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> 상온에서 1 시간 블록 버퍼 200 μl (5 % FBS와 PBST)로 분석 번호판을 품어. </li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> foll과 부화4 하룻밤 때문에 일차 항체 ° C : <ol><li> 염소 DJ1 N20 (산타 크루즈, 5 μg / ML) </li><li> 토끼 β - III의 tubulin (시그마 - 올드 리치, 1 μg / ML) </li></ol></li><li> 다음날 5 분, 3 번 PBS 200 μl와 세포를 씻는다. </li><li> 상온에서 다음 이차 항체 일시간와 분석 번호판을 품어 : <ol><li> AlexaFluor 488 당나귀 안티 - 염소 (Invitrogen, 2 μg / ML) </li><li> AlexaFluor 647 염소 안티 - 토끼 (Invitrogen, 2 μg / ML </li></ol></li><li> 5 분 3 회 대한 PBS 200 μl와 세포를 씻으십시오. </li><li> 10 분, Hoechst (1 μg / ML Invitrogen)로 품어 세포. </li><li> 5 분 3 회 200 μl PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 4 스토어 번호판 ° C까지 그들은 몇 군데 있습니다. </li></ol> 5. (소요 시간 : 5 일) 높은 콘텐츠 이미지 수집 및 이미지 분석 <ol><li> 20x 목적 렌즈를 사용하여 잘 초당 30 필드의 총 이미지. FI와 DJ1를 떠올TC 필터 설정 TRITC 필터 설정 Cy5 필터 세트와 UV 필터 세트 (그림 3)를 사용하여 핵과 β - III의 tubulin과 mitochondria. </li><li> mitochondria 내에서 Mitotracker 신호의 평균 강도를 결정하기 위해 Compartmental 분석 Bioapplication (Cellomics, ThermoFisher)를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. (그림 4B, F). </li><li> DJ1과 mitochondria 사이의 평균 오버랩 계수를 확인하려면 Cellomics Colocalisation의 bioapplication (Cellomics, ThermoFisher)를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. 다음과 같이 관심 영역 (ROI)을 정의 : 투자 수익 (ROI) - 핵 (그림 4A, E), 투자 수익 (ROI) B - mitochondria (그림 4 B, F). 은 세포질의 분석을 보장하기 위해 투자 수익 (ROI) B의 투자 수익 (ROI)을 제외할 수 있습니다. 대상 지역 대상 지역 II (그림 4C, G)로 I와 DJ1으로 mitochondria를 정의합니다. </li><li> β - III의 tubulin의 얼룩 (그림에서 neurites의 평균 길이를 추적의 연결 프로 파일링 bioapplication (Cellomics, Thermofisher)를 사용하여 이미지를 분석4D, H). </li><li> 오페라 LX 자동 공촛점 리더 (Perkin - 엘머)를 사용하여 이미지 번호판입니다. 물 물속 60x 객관적인 렌즈를 사용하여 잘 초당 30 필드의 총 이미지. UV 여기로 561 NM 레이저와 핵과 mitochondria 시각화. </li><li> 그 자리 에지 - 리지 (SER) 텍스쳐 기능 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. SER - 릿지 필터 산등성이 같은 패턴을 형성 픽셀 강도를 전송합니다. 더 많은 조각 mitochondria, 높은 SER - 릿지 점수 (그림 8). </li></ol> 6. 데이터 정규화 및 분석 <ol><li> R 소프트웨어 환경에 대한 BioConductor CellHTS2 패키지 (R 버전 2.11.1, BioConductor 버전 2.6)에 이미지 분석 소프트웨어에서 데이터를 가져옵니다. </li><li> 대수베이스 (2) 사전에 당 평균 판을 기반으로 정상화 27, 28 데이터를 변환. 판 당 편차 조정을 적용하지 마십시오. </li><li> 표현형의 수정자를 확인하려면 differe 사이에 양방향 ANOVA를 사용하여NT 치료 그룹 즉 감염 치료 세포를 으깬 대 독소 치료 세포 대 타겟 유전자 치료 세포 대 타겟 유전자 치료 세포를 (그림 5-7) 발진. </li></ol> 7. 대표 결과 DJ1 내에서 변이는 초기 발병 - 열성 parkinsonism 21 야기할하지만 DJ1의 손실은 질병 표현형에 상승을 제공하는 방법 확실하지 않다. 그것은 DJ1의 결함 세포가 더 산화 스트레스 유발 세포 죽음에 감염될과 산화 스트레스, mitochondria 29 세포질에서 DJ1 translocates, 30에 대응되는 것으로 알려져 있습니다. 이 phenotypes을 모니터 HC의 assays를 구축함으로써, 우리는 DJ1와 관련된 phenotypes을 조절하거나 영향을 미치는 유전자를 확인할 수 있습니다. 이 방법은 해독 기능 DJ1하고이 질병 pathogenesis에 관여 수있는 내의 경로 도움이 될 수 있습니다. DJ1과 epistatic 상호 작용 (그림 5)의 예 : 노출 셀에 DJ1의 최저세포 생존에 큰 손실 독소 결과 (BAR - B : 이미지 - B) 스크램블 lentivirus에 감염된 세포에 비해 (BAR - A : 이미지). 대상 유전자의 최저 A는 DJ1 최저 (이미지 - C 바 - C)과 세포에서 관찰 것과 비슷한 효과가 있습니다. DJ1 및 대상 유전자 혼자 두 유전자의 손실 (이미지 - D BAR - D)보다 세포 생존 능력이 상당히 큰 손실 결과를 모두 최저. 이것은 DJ1과 대상 사이의 유전자 A. epistatic 상호 작용을 제시 세포가 독소에 노출되고, mitochondria으로 세포질에서 DJ1 translocates, DJ1 간의 높은 중복 계수와 mitochondria (BAR - A에 의해 계량입니다 : : 이미지 비교 DJ1 translocation (그림 6)을 조절 유전자의 예 BAR - C : 이미지 C). 대상 유전자 B가 침묵되었습니다 세포에서 적은 mitochondria에 DJ1 translocates은 세포가 독소에 노출된 경우. 이것은 목표 유전자 B는 mitochondria에 DJ1의 전송에 관련되어 제안합니다. (BAR - B : 이미지 B 및 BAR - D : 이미지 D) neurite 길이 크게 증가 야생 타입 SH - SY5Y 세포 결과에서 대상 유전자 C의 최저 :의 연결을 가지 (그림 7)에 참여 유전자의 예 (BAR - B는 : 이미지 - B) 스크램블을 표현 lentivirus에 감염된 세포에 비해 shRNA (BAR - A : 이미지). 이 효과는 독소 (BAR - C 및 D)과 함께 incubated 셀에 손실됩니다. mitochondrial 형태 (그림 8)에 참여 유전자의 예 : mitochondrial SER - 릿지 세분화 값 (그림 8, 이미지 C 및 D)의 감소에 유전자 D 결과를 타겟팅하는 shRNA와 야생 타입 SH - SY5Y 세포의 감염에 비해 세포 잡음이 lentivirus (그림 8, 이미지 A와 B)에 감염된. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg"><img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1."></a> 그림 1 자동 세포 배양 프로토콜의 개요. : ntent "&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg"><img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2."></a> 그림 2 도식 심사 과정에 대한 개요, 이미지 분석 및 심사 과정에서 사용되는 통계 방법 :. 그들이 합류하고 shRNA의 lentivirus를 포함하는 분석 접시에 연속적으로 도금 때까지 I) 세포가 양식입니다. 셀은 5 일 동안 차별하고 독소는 다음 24 시간 동안 접시에 추가됩니다. 검정 접시는 시스템에서 출력하고 immunostained. 프로세스의 각 촬영 시간 금액은 괄호 안에 표시됩니다. ii) 본 데이터는 HC 영상기 (세포 생존 능력, 단백질 translocation과의 연결을 가지) 및 자동 공촛점 이미지 전송 (mitochondrial 형태)를 사용하여 인수입니다. 데이터가 R 내에 CellHTS2 패키지 수출,베이스는 (2) 변환하고 정규화 로그인하십시오. 양방향 ANOVA는 다른 변수 사이의 중요한 상호 작용을 식별하는 데 사용됩니다. 그림 3. HC 이미징 인수 세포의 복합 이미지. A) 치료 세포, B) 세포는 H 2 O 2 치료. DJ1은 녹색, 빨간색과 파란색의 핵에 mitochondria에 표시됩니다. Neurite의 얼룩이 강조 표시되지 않습니다. <img alt="그림 4." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4."> 그림 4. HCS에서 얻은 몇 가지 세포 기능의 부량. AD) 치료 SH - SY5Y 세포. EH) H 2 O 2 처리 SH - SY5Y 세포. 투자 수익 (ROI)의 A, E) 핵의 세분화 및 정의, mitochondria, 투자 수익 (ROI) B의 B, F) 확인 및 부량, C, G) DJ1의 확인, 대상 채널 II, 평균 neurite 길이의 D, G) 식별 및 계산. 이미지의 가장자리에 가까운 세포는 분석에서 제외됩니다. 삽입 이미지 사전 분석에 이미지 수 있습니다. <img src files> 그림 5. DJ1 (바에있는 글자가 이미지에있는 문자에 해당)와 epistasis에서 유전자의 식별. 이미지는 D를 통해 A는 세포 건강 부량 사용되었다 Mitotracker CMXRos (적색)으로 표시 SH - SY5Y 세포 수 있습니다. <img alt="그림 6." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 6."> 그림 6. DJ1 translocation을 (바에있는 글자가 이미지에있는 문자에 해당하는) 규제 유전자의 식별. 이미지는 D를 통해 A는 mitochondria에 DJ1 translocation의 부량 사용되었습니다 mitochondria DJ1 (녹색), (빨간색)과 핵 (파란색)에 대한 표시 SH - SY5Y 세포 수 있습니다. <img alt="그림 7." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 7."> 그림 7. 파생물의 연결과 관련된 유전자의 식별 (바에있는 글자가 이미지에있는 문자에 해당). D를 통해이 neurite 길이의 부량에 사용된 β - III의 tubulin (녹색)과 핵 (파란색)에 대한 표시 SH - SY5Y 세포있는 이미지. <img alt="그림 8." src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 8."> 그림 8. mitochondrial 형태와 규제에 관련된 유전자의 식별. 이미지 및 C는 각각 스크램블 shRNA 또는 shRNA 대상으로 유전자 D에 감염 SH - SY5Y 세포 합성 이미지입니다. 핵이 파란색으로 색깔있는 동안 Mitochondria는 빨간색으로 물들어 있습니다. 이미지 B와 D는 SER - 리지의 부량의 시각화 있습니다.

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어

유전자 기능을 수정하는 강력한 게놈 - 광범위한 도구의 가용성과 함께 HT / HC 세포 검사 시스템의 비용 감소와, HT / HC 화면 학계에서 일상지고 있습니다. 접근 방식은 이미 성공적으로 이러한 암 9, 31-33 및 34-36 배아 개발의 약물 표적의 식별과 같은 연구의 다양한 분야에 적용되고 심지어 neuropsychiatric 장애 37,38에 관련된 경로를 파악의 응용 프로그램에 대한 잠재력을 갖고있다. 그러나 이러한 시스템의 구현은 시간과 종종 6 개월 최소 복용 공정 최적화를 통해 노력의 상당한 투자를 필요로합니다. 이러한 trypsinization 시간, pipetting 속도와 시딩 밀도 등 모든 단계는 세포가 건강한 것을 확인하고 지속적으로 성장하기 위해 조정해야합니다. 세균 오염의 방지는 C에서 매주 청소 프로토콜과 자동 세포 배양을 직면하고있는 가장 어려운 문제 중 하나입니다오염 무료로 문화가 필요하고 70 % 에탄올로 모든 액체 베어링 라인 rinsing 상수와 ombination. 그것은 로봇을 향상시키기 위해 또한 필요합니다 그래서 이러한 높은 해상도와 -80 화합물 스토리지 ° C 냉동고가 통합될 수에 대한 공촛점 현미경 같은 추가 악기. 유전자 네트워크를 연구하고 병원성 분자 경로에 관련된 유전자를 확인하기 위해이 방법의 민감한, 속도 및 유틸리티를 개선하기 위해 해결되어야 할 한계도 있습니다. HT / HC 화면을 실시하고 신뢰할 수있는 데이터가 수집되었는지 확인하기 위해 몇 가지 측면 최적화해야합니다. 첫째, 측정의 신뢰도는 파라마운트이며, 분석의 견고하고 감도에 의존적일 수 밖에 없습니다. 예를 들어, assays 위에서 설명한 작은 화면에 적합하지만, 인해 이미지 수집하기 전에 필요한 숫자 처리 단계에 게놈 넓은 규모에 구현하기가 어렵습니다.따라서, 하나는 직접 영상에 대한 허용 및 가공 단계의 수를 감소로 인해 감소 변화로 이어질 것입니다 리포터 유전자를 표현하는 안정적인 세포 라인을 구축해야합니다. 현재 정확하게 묘사하고 안정적​​으로 관심 표현형이 HC 심사 과정에서 주요 병목이다 quantifies 분석을 설계. 많은 화면은 오프 대상 효과, 제한된 유전자 입을 효율성 및 불완전한 게놈 범위에서 고통받는 모든 것 중에서 다른 RNAi 라이브러리를 사용하여 포유류 세포에서 실시하고 있습니다. 따라서 도서관은보다 구체적인, 강력한하고 더 나은 범위를 보유하고있는하여야합니다. 노력은 만들 진행 등 그것은 이러한 노력은 HT / HC scre의 재현성을 향상시킬 계획이다<html> 욕실 안타. 그들은 유전자 상대적으로 쉽게 조작 및 대형 숫자 교양 수 있기 때문에 많은 대형 셀 기반 화면의 제한은 그들이 neuroblastoma 세포에서 실시한다는 점입니다. 그러나, 생체내 기능에 전 (前) 생체내 세포 배양 모델에서 확인된 &#39;히트&#39;의 관련성이있는 두뇌는 고도로 통합된 단위로 기능 시냅스 연결의 밀도와 복잡한 네트워크를 형성 고도로 전문화된 세포 유형으로 구성되어 있습니다 특히, 의심됩니다. 그 결과로서, 그것은 위에서 설명한 심사 접근법을 사용 식별, 추가 기술을 사용하여 보조 화면에서보다 생리 관련 모델을 39 확인 아르 안타 것이 일반적입니다. HCS 동안 확인된 히트의 번역을 개선하기 위해 이러한 기본 세포와 차별화된 줄기 세포 또는 공동 문화 시스템과 같은 더 많은 대표와 정교한 모델 개발 및 HT / HC 방식에 맞게해야합니다. 자동 세포 culturing 및 HC 이미지 하나의 조합 ntent &quot;&gt; 빠르게 뉴런이 작동하는 방법에 새로운 통찰력을 얻고있는 경로는 질병 개발에 중요하다. 다른 &#39;omics&#39;접근 방식에서 생성된 정보와 HCS / HTS 데이터를 결합하여 확인할 수 있습니다, 그것은 것입니다 그리고 따라서 치료 개발을 촉진, 뇌 질환의 시스템 생물학의 개요를 구축하는 것이 가능합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> AI.CELLHOST </td><td> 해밀턴 </td><td> <a href="http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/</a> </td></tr><tr><td> OPTI - 가상 </td><td> INVITROGEN </td><td> 31985-054 </td></tr><tr><td> RETINOIC ACID </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R2625 </td></tr><tr><td> OMNITRAY 플레이트 </td><td> NUNC </td><td> 465,219 </td></tr><tr><td> 96 음 문화 플레이트 </td><td> GRENIER </td><td> 655,086 </td></tr><tr><td> DJ1 N20 항체 </td><td> 산타 크루즈 </td><td> SC27004 </td></tr><tr><td> 베타 - III의 TUBULIN 항체 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T3952 </td></tr><tr><td> MITOTRACKER의 CMXROS </td><td> INVITROGEN </td><td> M - 7512 </td></tr><tr><td> HOECHST - 33342 </td><td> INVITROGEN </td><td> H1399 </td></tr><tr><td> 과산화수소 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 216763 - 100ML </td></tr><tr><td> 트립신 </td><td> INVITROGEN </td><td> 25050014 </td></tr><tr><td> DULBECCO &#39;S 인산염은 염분 버퍼 </td><td> INVITROGEN </td><td> 14190086 </td></tr><tr><td> PROMEGA 마법사 MAGNESIL TFX </td><td> PROMEGA </td><td> A2380 </td></tr><tr><td> SHRNA 클론 </td><td> OPEN BIOSYSTEMS </td><td> <a href="http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems</a>.com / RNAi / shRNALibraries / TRCLibraryDetails / </td></tr><tr><td> CELLOMICS의 BIOAPPLICATIONS </td><td> 열 피셔 </td><td> <a href="http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs</a> </td></tr></tbody></table>

neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

genomes의 기능 주석, 분자 네트워크 및 소설 약물 표적 식별 건설은 아주 위급 1-4 문제로 해결되어야 할 중요한 과제입니다. 여러 보완 &#39;omics&#39;접근 방식은 유전 위험 요소 및 여러 neurodegenerative 질병을 기본 병원성 메커니즘에 대한 단서를 제공하지만, 대부분의 결과는 아직 기능 검증 5가 필요합니다. 예를 들어, 파킨슨병 (PD), 질병에 대한 위험 요인으로 식별 많은 새로운 loci하지만, 기본 원인이되는 변종 (S) 또는 병원성 메커니즘에 대한 최근의 게놈 넓은 협회 연구는 6, 7을 알 수 없습니다. 각 관련 영역에 여러 개의 유전자를 포함하는 수 있듯이, 전통적인 세포 생물학 기법을 사용하여 질병와 관련된 phenotypes에있는 유전자의 각의 기능 평가 너무 오래 걸립니다. 분자 네트워크를 이해하는 필요도있다는 것을 링크그들은 원인 phenotypes에 유전 변이. 그것은 질병 phenotypes이 중단되었습니다 여러 상호 작용의 결과 것으로 기대된다. 전통적인 분자 방법을 사용하여 이러한 네트워크의 재건은 시간이 소요됩니다. 또한, 개별 구성 요소의 독립적인 연구, reductionism 방식에서 네트워크 예측은 아마 네트워크의 복잡 8 과소 평가합니다. 이 싼 견적이 부분에서 원하지 않는 또는 독성 부작용으로 인해 약물 승인의 낮은 성공률을 설명할 수 있습니다. HT / HC 세포 검사 방법을 사용하여 이러한 경로 내에서 핵심 노드를 식별하는 질병 관련 경로의 네트워크 관점을 확보하면, 치료 개입에 대한 더 적합한 목표의 식별을 초래할 수 있습니다. 하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 9-12 이러한 문제를 해결하기 위해 이상적인 방법입니다. 하지만 전통적인 방법은 simpli를 사용하여 1 차원 전체 - 음 세포​​ assays, 있었다stic 복잡한 생물 학적 과정에 대한 설치 했어요. 그들은 동시에 같은 형태의 속성 13, 14 axonal 교통 결손 또는 변경과 같은 neurodegenerative 질병에서 관찰 많은 phenotypes를 정할 수 없습니다. 이 접근법은 세포의 일부에서 발생 셀룰러 프로세스 또는 병원성 사건의 동적 특성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다. 하나가 다차원 phenotypes로 이동이 이러한 기능을 계량하기 위해서는 높은 콘텐츠 심사 (HCS) 4, 15-17을 칭했다. HCS는 HTS에 비해 다양한 perturbations에 대한 세포 반응의 자세한 표현을 제공하는 동시에 여러 프로세스의 세포 기반 부량입니다. HCS는 HTS 18, 19 이상의 많은 장점을 가지고 있지만,의 연결 모델에 높은 처리량 (HT) - 높은 콘텐츠 (HC) 화면을 실시하는 것은 인해 높은 비용, 환경 변화와 인간의 오류로 문제가있다. &#39;phenomics&#39;규모의 세포 반응을 감지하기 위해HC 이미지 하나를 사용하여 감도와 재현성을 증가하는 동안 변화하고 오류를 줄일 수있다. 여기에 우리는 정확하고 안정적으로 세포의 연결을 모델로 자동 세포 culturing 20 HC 이미징을 사용하여 shRNA 화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 변이된 것은 autosomal 열성 parkinsonism 21 원인이 하나의 특정 단백질, DJ1에 대한 모듈 레이터를 식별하는이 방법론을 사용한 방법에 대해 설명합니다. HT의 방법으로 HC 이미징의 융통성 결합, 그것은 정확하게 phenotypes의 과다를 정할 수 있습니다. 이것은 이후에뿐만 아니라 잠재적인 치료 표적을 식별로 게놈에 대한 우리의 이해, 질병 pathogenesis에 관련된 경로를 사전에 활용 수 있습니다.

우리는 높은 처리량 방식으로, 여러 세포 프로세스와 구조를 시각화하고 수치 높은 콘텐츠를 이미지로 자동 셀 culturing를 결합 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 genomes의 추가 기능 주석의 도움뿐만 아니라 질병 유전자 네트워크 및 잠재적 약물 표적을 식별할 수 있습니다.

Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

게놈의 기능적 주석 달기, 분자 네트워크 구축 및 새로운 약물 표적 식별은 해결해야 할 중요한 과제입니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 질환 모델에서 고함량 분석(high content assay)을 활용하여 신경퇴행성 질환에서 영향을 받는 경로를 정량화하는 것입니다. 이를 위해 질환 표현형의 세포 모델을 자동 세포 배양 시스템에 넣고, 필요한 세포 수에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 그 후 세포를 분할하고 수를 센 다음, 다양한 SH RNA를 발현하는 렌티바이러스가 포함된 96웰 플레이트에 분주합니다.6일간의 세포 분화 후, 면역 염색 및 고함량 이미징(high content imaging)을 위해 시스템에서 세포를 꺼냅니다. 마지막으로, 다양한 분석 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석함으로써 세포 건강, 신경 돌기 성장 및 미토콘드리아 기능과 관련된 특성들을 정량화합니다.결과는 또한 Novas에서 이원 분산 분석(two-way ANOVA)을 통해 분석하여 유의미한 상호작용 효과를 확인합니다. 이 방법은 질환 관련 유전자의 기능과 이들이 작용하는 전반적인 경로에 관한 핵심 질문에 더 빠르게 답할 수 있게 해줍니다. 이는 결과적으로 신경퇴행성 질환에 관여하는 병원성 메커니즘에 대한 더 깊은 이해로 이어질 것입니다.세포 배양 과정을 시작하려면, 세포 배양 플레이트 입력을 위해 자동 세포 배양 시스템을 준비하십시오. 피펫 팁, 세포 배양 플레이트 및 분석 플레이트와 같은 소모품을 시스템에 적재하십시오. 또한, 시스템 내에 충분한 세포 배양 배지, PBS 및 trypsin이 있는지 수동으로 확인하십시오.SH SY five Y 신경모세포종 세포주를 플레이트당 2 × 10⁶개의 세포로 두 개의 omni tray 플레이트에 분주합니다. 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 최적 배지에서 세포를 배양하고, 플레이트를 세포 배양 로봇의 투입 선반에 배치합니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 사용하여 A 부착 세포 배양 프로토콜을 선택하고, 부착 세포주 전용 파라미터 파일을 조정하여 합류(confluence) 임계값이 70%로 설정되도록 합니다.총 초기화 시간을 2분으로 설정합니다. 시스템에 플레이트당 2 × 10⁶개의 세포가 분주되는 새로운 omni tray 플레이트를 준비하도록 지시하십시오. 시스템에 omni tray 플레이트당 4개의 분석 플레이트를 준비하며, 웰당 총 5,000개의 세포가 포함되도록 지시하십시오. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하십시오.본 부착 세포 배양 프로토콜에는 다음과 같은 단계들이 포함됩니다. 세포가 미리 정의된 합일도(confluence) 임계값에 도달할 때까지 플레이트를 배양하고 이미징합니다. 5회 측정 내에 세포가 합일도 임계값에 도달하지 않을 경우, 해당 플레이트는 시스템에서 제거합니다.사용자가 정의한 합류(confluence) 임계값에 도달하면 세포를 세척하고, 트립신 처리(trypsinization) 및 세포 수를 측정합니다. 미리 정해진 수의 세포를 새로운 omni trait 플레이트에 추가하며, 세포 수가 충분할 경우 지정된 수의 분석 플레이트를 데크로 운반하고 각 웰에 정의된 수의 세포를 분주합니다. 마지막으로, 통합 현미경을 사용하여 분석 플레이트를 직접 촬영하거나, 바이러스 생산 절차를 시작하기 위한 추가 처리를 위해 시스템에서 플레이트를 배출할 수 있습니다.ampicillin이 함유된 LB 배지에 HRNA 벡터가 포함된 박테리아 글리세롤 스톡을 접종하여 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. Wizard Magnus cell 플라스미드 정제 시스템을 사용하여 플라스미드를 추출합니다. 플라스미드 DNA가 포함된 최종 Eluate를 96-well 플레이트에 수집합니다. shRNA 렌티바이러스는 RNAi 컨소시엄을 통해 96-well 플레이트에서 렌티바이러스 생산 방식으로 제조합니다. 모든 실험은 ML2 또는 BSL2 생물 안전 실험실에서 수행되어야 하며, 사용한 모든 시약과 소모품은 사용 후 30% 염소 용액으로 오염 제거해야 합니다.렌티바이러스 제작 절차는 이 영상에서 시연되지 않지만, 총 4일이 소요되며 다음과 같은 단계로 구성됩니다. 우선, 0일째 오후에 패키징 세포를 파종합니다. 1일째에 패키징 세포를 트랜스펙션하며, 트랜스펙션 18시간 후에 세 개의 렌티바이러스 플라스미드를 도입합니다.2일 차에 배지를 신선한 고농도 BSA 또는 고농도 혈청 배지로 교체합니다. 배지 교체 24시간 후인 3일 차에 바이러스를 회수하고 배지를 다시 신선한 고농도 BSA 또는 고농도 혈청 배지로 교체합니다.마지막으로, 첫 번째 바이러스 수확 후 24시간이 지난 4일 차에 바이러스를 다시 수확하고 패키징 세포를 폐기하여 렌티바이러스의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)를 계산합니다. 렌티바이러스를 단계별로 희석하여 SHSY 5Y 세포를 형질전환하고, 37°C에서 72시간 동안 배양합니다. 현미경으로 GFP 발현을 시각화하여 GFP 양성 세포의 백분율을 결정합니다. MOI 3으로 shRNA 렌티바이러스를 분석 플레이트에 분주합니다. 분석 플레이트에 shRNA 렌티바이러스를 분주한 후, 렌티바이러스 형질전환을 위해 플레이트를 자동 세포 배양 시스템에 로드합니다.24시간 후, 분석 플레이트의 배지를 0.5% FBS와 0.1 micromolar 레티노산(retinoic acid)이 포함된 최적화 배지로 교체합니다. 분화 과정을 시작하기 위해 분석 플레이트를 분화 배지에서 5일 동안 계속 배양하여 5일 차에 표적 유전자 발현의 최대 녹다운(knockdown)을 유도합니다. 6일 차에 DJ one 단백질의 미토콘드리아 전이를 자극하기 위해 분석 플레이트의 절반에 H2O를 넣고 24시간 동안 처리합니다. 각 웰당 최종 농도가 200 nano molar이 되도록 MIT tracker를 세포에 첨가하고 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다.이후, 플레이트를 하이 콘텐츠(HC) 이미저로 옮겨 이미징할 수 있습니다. 또는, 면역 염색과 같은 추가 처리를 위해 플레이트를 시스템에서 꺼낼 수 있습니다. 하이 콘텐츠 이미징의 경우, 20x 대물렌즈를 사용하여 웰당 총 30개 영역을 이미징하며, DJ1은 trixy 필터 세트로, 베타 3 튜뷸린은 S5 필터 세트로, 그리고 핵은 UV 필터 세트로 시각화합니다.이것은 하이 콘텐츠 이미징(high content imaging)을 통해 획득한 세포의 합성 이미지 예시입니다. 처리하지 않은 세포는 패널 A에, H2O two로 처리한 세포는 패널 B에 표시되어 있습니다. DJ one은 녹색으로, 미토콘드리아는 적색으로, 그리고 핵은 청색으로 표지되었습니다. DJ one과 미토콘드리아 사이의 평균 중첩 계수(average overlap coefficient)를 결정하려면, colocalization bio 애플리케이션을 사용하여 이미지를 분석하십시오.관심 영역(ROI)을 설정합니다. ROI를 다음과 같이 정의합니다. ROI A는 그림 4 A와 E의 핵이며, ROI B는 그림 4 B와 F의 미토콘드리아입니다. ROI B에서 ROI A를 제외합니다. 세포질만 분석하기 위해, 미토콘드리아를 타겟 영역 1로, DJ 1을 타겟 영역 2로 정의합니다(그림 4 C 및 G). com compartmental analysis 바이오 애플리케이션을 사용하여 이미지를 분석하고, 미토콘드리아 내 MIT tracker 신호의 평균 강도를 측정합니다.beta three tubulin 염색을 통해 뉴라이트(neurite)의 평균 길이를 추적한 결과는 그림 4 B 및 F에 나타나 있습니다. Opera LX 자동 공초점 리더(automated confocal reader)의 뉴런 프로파일링(neuronal profiling) 바이오 애플리케이션을 사용하여 이미지 플레이트를 분석한 결과는 그림 4 D 및 H에 제시되어 있습니다.561 nanometer 레이저를 사용하여 미토콘드리아를 시각화하고, UV 여기 이미지를 사용하여 핵을 시각화합니다. 수침 60 x 대물렌즈를 사용하여 웰당 총 30개 영역을 관찰합니다. 마지막으로 spot edge ridge 또는 SER 텍스처 특징 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다.SER 릿지 필터는 릿지 형태의 패턴을 형성하는 픽셀의 강도를 투과시킵니다. 미토콘드리아가 더 많이 파편화될수록 SER 릿지 점수가 더 높아집니다. 이 비디오에서는 상염색체 열성 파킨슨병을 유발하는 DJ-1A 단백질의 조절제를 식별하기 위해 고함량 분석(HC assay)이 사용되었습니다.이 첫 번째 대표 결과는 DJ 1과의 상위성 상호작용(epistatic interaction)을 보여줍니다. 왼쪽의 막대 그래프는 표준화된 형광 단위(normalized fluorescence units)를 나타내며, 오른쪽의 이미지는 세포 생존율 정량을 위해 mito tracker로 붉게 염색된 SHSY 5Y 세포를 보여줍니다.독소에 노출된 세포에서 DJ one을 넉다운했을 때, 스크램블 렌티바이러스를 감염시킨 세포에 비해 세포 생존율이 더 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다. 타겟 유전자 A의 넉다운은 DJ one 넉다운 세포에서 관찰된 것과 유사한 효과를 나타냈습니다. 그러나 DJ one과 타겟 유전자 A를 모두 넉다운했을 때는 각 유전자를 단독으로 넉다운했을 때보다 세포 생존율의 손실이 유의미하게 더 컸으며, 이는 DJ one과 타겟 유전자 A 사이에 상위성 상호작용(epistatic interaction)이 있음을 시사합니다. 다음 예시는 DJ one 전위를 조절하는 유전자에 관한 것입니다.막대 그래프는 DJ one과 미토콘드리아 사이의 정규화된 중첩 계수를 보여주며, 이는 세포질에서 미토콘드리아로의 DJ one 전위를 나타냅니다. 패널 A부터 D는 DJ one은 녹색으로, 미토콘드리아는 적색으로, 핵은 청색으로 염색된 SHSY five Y 세포의 이미지입니다. 세포가 독소에 노출되면 DJ one이 세포질에서 미토콘드리아로 전위되며, 이는 DJ one과 미토콘드리아 사이의 더 높은 중첩 계수로 정량화됩니다.표적 유전자 B가 억제된 세포에서는 독소에 노출되었을 때 DJ one의 미토콘드리아 전이가 적게 나타났으며, 이는 표적 유전자 B가 DJ one의 미토콘드리아 수송에 관여함을 시사합니다. 여기 신경 돌기 성장에 관여하는 유전자의 예시가 제시되어 있습니다. 정규화된 신경 돌기 길이는 막대 그래프로 표시되었으며, 신경 돌기 길이 정량화에 사용된 세포는 베타 three tubulin이 녹색으로, 핵이 청색으로 표시된 이미지에 나타나 있습니다.야생형 SHSY five Y 세포에서 표적 유전자 C를 넉다운하면, 스크램블 SH RNA를 발현하는 렌티바이러스에 감염된 세포와 비교하여 신경돌기 길이가 유의미하게 증가합니다. 이러한 효과는 독소와 함께 배양한 세포에서는 사라집니다. 결과적으로, 이 결과들은 미토콘드리아 형태에 관여하는 유전자의 예를 보여줍니다.scrambled HRNA 또는 유전자 D를 표적으로 하는 A-S-H-R-N-A가 감염된 SHSY five Y 세포의 평균 미토콘드리아 SER ridge 분절 값(segmentation values)이 그래프에 나타나 있습니다. 이미지 A와 이미지 C는 각각 scrambled HRNA 또는 유전자 D를 표적으로 하는 A-H-R-N-A가 감염된 SHSY five Y 세포의 합성 이미지입니다. 미토콘드리아는 빨간색으로, 핵은 파란색으로 표시되었습니다.이미지 B와 D는 여기에서 관찰된 SER 릿지 정량화의 시각화 결과입니다. 야생형 SHSY five Y 세포에 gene D를 표적으로 하는 HRNA를 감염시키면, 스크램블 렌티바이러스를 감염시킨 세포와 비교했을 때 미토콘드리아 SER 릿지 세그멘테이션 수치가 증가합니다. 이러한 접근 방식은 신경퇴행 분야의 연구자들이 질병 병인에 관여하는 경로를 적시에 탐색하고 주석을 달 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다.이는 결과적으로 치료제 개발을 위한 더 나은 표적으로 이어질 것입니다.

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연구

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Medicine

의학

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Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

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