Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 질환 모델에서 고함량 분석(high content assay)을 활용하여 신경퇴행성 질환에서 영향을 받는 경로를 정량화하는 것입니다. 이를 위해 질환 표현형의 세포 모델을 자동 세포 배양 시스템에 넣고, 필요한 세포 수에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 그 후 세포를 분할하고 수를 센 다음, 다양한 SH RNA를 발현하는 렌티바이러스가 포함된 96웰 플레이트에 분주합니다.

6일간의 세포 분화 후, 면역 염색 및 고함량 이미징(high content imaging)을 위해 시스템에서 세포를 꺼냅니다. 마지막으로, 다양한 분석 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석함으로써 세포 건강, 신경 돌기 성장 및 미토콘드리아 기능과 관련된 특성들을 정량화합니다.

결과는 또한 Novas에서 이원 분산 분석(two-way ANOVA)을 통해 분석하여 유의미한 상호작용 효과를 확인합니다. 이 방법은 질환 관련 유전자의 기능과 이들이 작용하는 전반적인 경로에 관한 핵심 질문에 더 빠르게 답할 수 있게 해줍니다. 이는 결과적으로 신경퇴행성 질환에 관여하는 병원성 메커니즘에 대한 더 깊은 이해로 이어질 것입니다.

세포 배양 과정을 시작하려면, 세포 배양 플레이트 입력을 위해 자동 세포 배양 시스템을 준비하십시오. 피펫 팁, 세포 배양 플레이트 및 분석 플레이트와 같은 소모품을 시스템에 적재하십시오. 또한, 시스템 내에 충분한 세포 배양 배지, PBS 및 trypsin이 있는지 수동으로 확인하십시오.

SH SY five Y 신경모세포종 세포주를 플레이트당 2 × 10⁶개의 세포로 두 개의 omni tray 플레이트에 분주합니다. 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 최적 배지에서 세포를 배양하고, 플레이트를 세포 배양 로봇의 투입 선반에 배치합니다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 사용하여 A 부착 세포 배양 프로토콜을 선택하고, 부착 세포주 전용 파라미터 파일을 조정하여 합류(confluence) 임계값이 70%로 설정되도록 합니다.

총 초기화 시간을 2분으로 설정합니다. 시스템에 플레이트당 2 × 10⁶개의 세포가 분주되는 새로운 omni tray 플레이트를 준비하도록 지시하십시오. 시스템에 omni tray 플레이트당 4개의 분석 플레이트를 준비하며, 웰당 총 5,000개의 세포가 포함되도록 지시하십시오. 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하십시오.

본 부착 세포 배양 프로토콜에는 다음과 같은 단계들이 포함됩니다. 세포가 미리 정의된 합일도(confluence) 임계값에 도달할 때까지 플레이트를 배양하고 이미징합니다. 5회 측정 내에 세포가 합일도 임계값에 도달하지 않을 경우, 해당 플레이트는 시스템에서 제거합니다.

사용자가 정의한 합류(confluence) 임계값에 도달하면 세포를 세척하고, 트립신 처리(trypsinization) 및 세포 수를 측정합니다. 미리 정해진 수의 세포를 새로운 omni trait 플레이트에 추가하며, 세포 수가 충분할 경우 지정된 수의 분석 플레이트를 데크로 운반하고 각 웰에 정의된 수의 세포를 분주합니다. 마지막으로, 통합 현미경을 사용하여 분석 플레이트를 직접 촬영하거나, 바이러스 생산 절차를 시작하기 위한 추가 처리를 위해 시스템에서 플레이트를 배출할 수 있습니다.

ampicillin이 함유된 LB 배지에 HRNA 벡터가 포함된 박테리아 글리세롤 스톡을 접종하여 하룻밤 동안 배양한 후, 다음 날 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. Wizard Magnus cell 플라스미드 정제 시스템을 사용하여 플라스미드를 추출합니다. 플라스미드 DNA가 포함된 최종 Eluate를 96-well 플레이트에 수집합니다. shRNA 렌티바이러스는 RNAi 컨소시엄을 통해 96-well 플레이트에서 렌티바이러스 생산 방식으로 제조합니다. 모든 실험은 ML2 또는 BSL2 생물 안전 실험실에서 수행되어야 하며, 사용한 모든 시약과 소모품은 사용 후 30% 염소 용액으로 오염 제거해야 합니다.

렌티바이러스 제작 절차는 이 영상에서 시연되지 않지만, 총 4일이 소요되며 다음과 같은 단계로 구성됩니다. 우선, 0일째 오후에 패키징 세포를 파종합니다. 1일째에 패키징 세포를 트랜스펙션하며, 트랜스펙션 18시간 후에 세 개의 렌티바이러스 플라스미드를 도입합니다.

2일 차에 배지를 신선한 고농도 BSA 또는 고농도 혈청 배지로 교체합니다. 배지 교체 24시간 후인 3일 차에 바이러스를 회수하고 배지를 다시 신선한 고농도 BSA 또는 고농도 혈청 배지로 교체합니다.

마지막으로, 첫 번째 바이러스 수확 후 24시간이 지난 4일 차에 바이러스를 다시 수확하고 패키징 세포를 폐기하여 렌티바이러스의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)를 계산합니다. 렌티바이러스를 단계별로 희석하여 SHSY 5Y 세포를 형질전환하고, 37°C에서 72시간 동안 배양합니다. 현미경으로 GFP 발현을 시각화하여 GFP 양성 세포의 백분율을 결정합니다. MOI 3으로 shRNA 렌티바이러스를 분석 플레이트에 분주합니다. 분석 플레이트에 shRNA 렌티바이러스를 분주한 후, 렌티바이러스 형질전환을 위해 플레이트를 자동 세포 배양 시스템에 로드합니다.

24시간 후, 분석 플레이트의 배지를 0.5% FBS와 0.1 micromolar 레티노산(retinoic acid)이 포함된 최적화 배지로 교체합니다. 분화 과정을 시작하기 위해 분석 플레이트를 분화 배지에서 5일 동안 계속 배양하여 5일 차에 표적 유전자 발현의 최대 녹다운(knockdown)을 유도합니다. 6일 차에 DJ one 단백질의 미토콘드리아 전이를 자극하기 위해 분석 플레이트의 절반에 H2O를 넣고 24시간 동안 처리합니다. 각 웰당 최종 농도가 200 nano molar이 되도록 MIT tracker를 세포에 첨가하고 37 degrees Celsius에서 30분 동안 배양합니다.

이후, 플레이트를 하이 콘텐츠(HC) 이미저로 옮겨 이미징할 수 있습니다. 또는, 면역 염색과 같은 추가 처리를 위해 플레이트를 시스템에서 꺼낼 수 있습니다. 하이 콘텐츠 이미징의 경우, 20x 대물렌즈를 사용하여 웰당 총 30개 영역을 이미징하며, DJ1은 trixy 필터 세트로, 베타 3 튜뷸린은 S5 필터 세트로, 그리고 핵은 UV 필터 세트로 시각화합니다.

이것은 하이 콘텐츠 이미징(high content imaging)을 통해 획득한 세포의 합성 이미지 예시입니다. 처리하지 않은 세포는 패널 A에, H2O two로 처리한 세포는 패널 B에 표시되어 있습니다. DJ one은 녹색으로, 미토콘드리아는 적색으로, 그리고 핵은 청색으로 표지되었습니다. DJ one과 미토콘드리아 사이의 평균 중첩 계수(average overlap coefficient)를 결정하려면, colocalization bio 애플리케이션을 사용하여 이미지를 분석하십시오.

관심 영역(ROI)을 설정합니다. ROI를 다음과 같이 정의합니다. ROI A는 그림 4 A와 E의 핵이며, ROI B는 그림 4 B와 F의 미토콘드리아입니다. ROI B에서 ROI A를 제외합니다. 세포질만 분석하기 위해, 미토콘드리아를 타겟 영역 1로, DJ 1을 타겟 영역 2로 정의합니다(그림 4 C 및 G). com compartmental analysis 바이오 애플리케이션을 사용하여 이미지를 분석하고, 미토콘드리아 내 MIT tracker 신호의 평균 강도를 측정합니다.

beta three tubulin 염색을 통해 뉴라이트(neurite)의 평균 길이를 추적한 결과는 그림 4 B 및 F에 나타나 있습니다. Opera LX 자동 공초점 리더(automated confocal reader)의 뉴런 프로파일링(neuronal profiling) 바이오 애플리케이션을 사용하여 이미지 플레이트를 분석한 결과는 그림 4 D 및 H에 제시되어 있습니다.

561 nanometer 레이저를 사용하여 미토콘드리아를 시각화하고, UV 여기 이미지를 사용하여 핵을 시각화합니다. 수침 60 x 대물렌즈를 사용하여 웰당 총 30개 영역을 관찰합니다. 마지막으로 spot edge ridge 또는 SER 텍스처 특징 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다.

SER 릿지 필터는 릿지 형태의 패턴을 형성하는 픽셀의 강도를 투과시킵니다. 미토콘드리아가 더 많이 파편화될수록 SER 릿지 점수가 더 높아집니다. 이 비디오에서는 상염색체 열성 파킨슨병을 유발하는 DJ-1A 단백질의 조절제를 식별하기 위해 고함량 분석(HC assay)이 사용되었습니다.

이 첫 번째 대표 결과는 DJ 1과의 상위성 상호작용(epistatic interaction)을 보여줍니다. 왼쪽의 막대 그래프는 표준화된 형광 단위(normalized fluorescence units)를 나타내며, 오른쪽의 이미지는 세포 생존율 정량을 위해 mito tracker로 붉게 염색된 SHSY 5Y 세포를 보여줍니다.

독소에 노출된 세포에서 DJ one을 넉다운했을 때, 스크램블 렌티바이러스를 감염시킨 세포에 비해 세포 생존율이 더 크게 감소하는 것이 관찰되었습니다. 타겟 유전자 A의 넉다운은 DJ one 넉다운 세포에서 관찰된 것과 유사한 효과를 나타냈습니다. 그러나 DJ one과 타겟 유전자 A를 모두 넉다운했을 때는 각 유전자를 단독으로 넉다운했을 때보다 세포 생존율의 손실이 유의미하게 더 컸으며, 이는 DJ one과 타겟 유전자 A 사이에 상위성 상호작용(epistatic interaction)이 있음을 시사합니다. 다음 예시는 DJ one 전위를 조절하는 유전자에 관한 것입니다.

막대 그래프는 DJ one과 미토콘드리아 사이의 정규화된 중첩 계수를 보여주며, 이는 세포질에서 미토콘드리아로의 DJ one 전위를 나타냅니다. 패널 A부터 D는 DJ one은 녹색으로, 미토콘드리아는 적색으로, 핵은 청색으로 염색된 SHSY five Y 세포의 이미지입니다. 세포가 독소에 노출되면 DJ one이 세포질에서 미토콘드리아로 전위되며, 이는 DJ one과 미토콘드리아 사이의 더 높은 중첩 계수로 정량화됩니다.

표적 유전자 B가 억제된 세포에서는 독소에 노출되었을 때 DJ one의 미토콘드리아 전이가 적게 나타났으며, 이는 표적 유전자 B가 DJ one의 미토콘드리아 수송에 관여함을 시사합니다. 여기 신경 돌기 성장에 관여하는 유전자의 예시가 제시되어 있습니다. 정규화된 신경 돌기 길이는 막대 그래프로 표시되었으며, 신경 돌기 길이 정량화에 사용된 세포는 베타 three tubulin이 녹색으로, 핵이 청색으로 표시된 이미지에 나타나 있습니다.

야생형 SHSY five Y 세포에서 표적 유전자 C를 넉다운하면, 스크램블 SH RNA를 발현하는 렌티바이러스에 감염된 세포와 비교하여 신경돌기 길이가 유의미하게 증가합니다. 이러한 효과는 독소와 함께 배양한 세포에서는 사라집니다. 결과적으로, 이 결과들은 미토콘드리아 형태에 관여하는 유전자의 예를 보여줍니다.

scrambled HRNA 또는 유전자 D를 표적으로 하는 A-S-H-R-N-A가 감염된 SHSY five Y 세포의 평균 미토콘드리아 SER ridge 분절 값(segmentation values)이 그래프에 나타나 있습니다. 이미지 A와 이미지 C는 각각 scrambled HRNA 또는 유전자 D를 표적으로 하는 A-H-R-N-A가 감염된 SHSY five Y 세포의 합성 이미지입니다. 미토콘드리아는 빨간색으로, 핵은 파란색으로 표시되었습니다.

이미지 B와 D는 여기에서 관찰된 SER 릿지 정량화의 시각화 결과입니다. 야생형 SHSY five Y 세포에 gene D를 표적으로 하는 HRNA를 감염시키면, 스크램블 렌티바이러스를 감염시킨 세포와 비교했을 때 미토콘드리아 SER 릿지 세그멘테이션 수치가 증가합니다. 이러한 접근 방식은 신경퇴행 분야의 연구자들이 질병 병인에 관여하는 경로를 적시에 탐색하고 주석을 달 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다.

이는 결과적으로 치료제 개발을 위한 더 나은 표적으로 이어질 것입니다.