빠른 스캔 순환 Voltammetry와 Striatal 뇌 조각의 Presynaptic 도파민 역학

이 절차의 전체적인 목적은 slice fast scan cyclic V Telemetry를 위한 일반적인 프로토콜을 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뇌 조직을 관상면 절단을 위해 준비합니다. 그런 다음 관심 있는 특정 뇌 영역에 전극을 배치합니다.

다음 단계는 도파민을 검출하기 위해 전극을 통해 삼각형 파형의 전압을 인가하는 것입니다. 마지막으로, 관심 있는 약리학적 제제를 뇌 절편에 처리하고 시냅스 전 도파민 역학에 미치는 영향을 관찰합니다. 결과적으로, 본 프로토콜은 고속 스캔 순환 전압전류법(fast scan cyclic voltammetry)을 통해 자극된 도파민 방출 및 도파민 재흡수 속도와 같은 시냅스 전 도파민 역학의 변화를 보여줍니다.

이 방법은 시냅스 전 도파민 역동성에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 쥐나 초파리 같은 동물과 세로토닌 및 노르에피네프린과 같은 신경전달물질을 포함한 다른 시스템에도 적용될 수 있으며, 본 절차의 시연은 저희 연구실의 대학원생인 Francis Mena, MEA Khalid, Erin oo가 진행하겠습니다. 이 절차를 시작하기 위해, 첨부된 원고에 따라 수크로스 A-CSF, 전압-전류 기록용 A-CSF 용액, 전극 보정용 수정 A-CSF 용액의 세 가지 인공 뇌척수액 용액을 준비하십시오. 다음으로, 10 mL의 수크로스 A-CSF를 작은 비커에 옮겨 담고 아이스 버킷에 넣으십시오. 그런 다음, 즉석 Loctite 접착제를 아이스 버킷에 넣으십시오.

그 후, 면도날과 핀셋, 스파툴라, 가위 등 해부에 필요한 도구들을 알코올 패드로 닦아 준비합니다. 그런 다음 마우스의 목을 절단하여 희생시키고 뇌를 빠르게 적출합니다. 적출한 뇌를 얼음처럼 차가운 sucrose, A CSF가 담긴 비커에 약 10분 동안 담가 둡니다.

그동안 슬라이싱을 위해 VIBRAM을 준비합니다. 시료조에 분쇄된 얼음을 넣습니다. 그런 다음 시료 챔버를 Vibram에 넣고 단단히 고정합니다.

틈새를 메우기 위해 시료 챔버 주변에 얼음을 더 추가하고, 챔버 내부로 얼음이 들어가지 않도록 주의하십시오. 그 후, 세척된 면도날을 날 홀더에 장착하십시오. 그런 다음 시료 챔버를 차가운 sucrose A CSF로 채우십시오.

그 다음, 뒤집어 놓은 페트리 접시 위의 종이 타월에 차가운 sucrose A CSF를 소량 붓습니다. 갓 적출한 마우스 뇌를 포셉을 사용하여 그 위에 옮깁니다. 그런 다음 면도날로 내측-외측 축(medial lateral axis)을 따라 절단하여 소뇌를 제거합니다.

이렇게 하면 진동 스테이지(vibram stage)에 부착할 수 있는 평평한 바닥면이 만들어집니다. 다음으로, 시료 스테이지 위에 Loctite 접착제를 한 방울 떨어뜨립니다. 준비된 뇌의 평평한 끝부분을 즉시 스테이지에 부착하고, 최대한 수직 상태를 유지하십시오.

그 후 스테이지를 시료 챔버에 넣고 나사를 조입니다. 뇌가 챔버 내의 sucrose A CSF에 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 그런 다음, 컨트롤러를 사용하여 면도날이 뇌의 상단과 일직선이 되도록 스테이지를 조정합니다.

진동기의 최적 파라미터는 주파수와 속도를 낮게 설정하여 얻습니다. 다음으로, 슬라이스 두께를 400 micrometers로 설정하십시오. 처음 몇 개의 슬라이스에는 대개 선조체가 포함되지 않습니다.

선조체(striatum)가 포함된 절편을 얻을 때까지 슬라이싱을 반복합니다. stri AAL 영역에 도달하면, 붓을 사용하여 절편을 들어 올려 산소가 공급된 상온의 CSF가 담긴 비커에 넣습니다.

일반적으로 미상핵-피각(caudate putamen)과 측좌핵(nucleus accumbens)이 포함된 시상-선조체(thalamo-striatal) 복합체를 포함하는 절편을 3~4개 얻을 수 있습니다. 실험을 진행하기 전, 절편을 실온에서 95%O2 5%CO2가 기포되는 A CSF 내에서 최소 한 시간 동안 적응시킵니다. 이 절차를 시작하려면 튜브를 침전 기록 챔버에 연결하십시오.

그 후 산소가 공급된 상온의 A CSF를 분당 1 mL의 속도로 펌핑합니다. A CSF가 맞춤 제작된 슬라이스 홀더를 채우면 온도 조절기를 32 °C로 설정하십시오. 니들 시린지를 사용하여 메쉬 아래의 기포를 모두 제거합니다.

버퍼의 과류를 제어하기 위해 시린지를 사용하여 유출 튜브에 음압을 형성함으로써 흐름을 시작합니다. 슬라이스 홀더 가장자리에 Kim wipe를 배치하여 심지 역할을 하게 합니다. 그런 다음, 실온에서 산소화된 A CSF가 지속적으로 관류되는 기록 챔버 내의 슬라이스 홀더로 슬라이스를 옮깁니다.

은-염화은 참조 전극을 슬라이스 홀더에 담그고 악어 클립으로 헤드 스테이지에 연결합니다. 탄소 섬유 미세 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고 악어 클립으로 헤드 스테이지에 연결합니다. 다음으로, 텅스텐 자극 전극과 탄소 섬유 미세 전극을 염분 처리된 뇌 슬라이스 표면까지 내립니다.

자극 전극은 슬라이스에 단일 펄스 또는 다중 펄스의 전기 자극을 전달하여 신경전달물질 방출을 유도하고, 고속 스캔 순환 전압전류법(fast scan cyclic voltammetry, FSCV)을 통해 전기적으로 유발된 도파민을 측정하는 데 사용됩니다. 전극에 삼각형 파형의 전압을 인가하십시오. 탄소 섬유 미세 전극의 전위를 -0.4 V로 유지하십시오. 이를 +1.2 V의 양의 한계값까지 램프(ramp)시키십시오.

그런 다음 400 V/s의 스캔 속도로 -0.4 V까지 다시 내립니다. 5분마다 슬라이스를 자극하고, 피크 높이 차이가 10% 미만으로 정의되는 안정적인 전기 자극 도파민 방출 기록이 최소 3회 나타난 후, 그때마다 15초 동안 결과 도파민 FLX의 부피 측정을 수행합니다.

기초 기록(baseline recording)과 유사한 최대 효과를 얻기 위해, 관심 있는 약물이 포함된 CSF를 분당 1 mL의 유속으로 30분 동안 슬라이스에 관류하며 전환합니다. 약물 관류 중에 5분마다 전기적으로 자극하여 도파민 방출을 측정합니다. 그림 A는 미상핵 껍질(caudate putamen)에서 단일 펄스 자극 후 FSCV를 사용하여 전기적으로 유발된 도파민 방출을 측정한 예시입니다.

그림 B는 전류 대 시간 트레이스와 순환 전압-전류 곡선의 정보를 결합한 3차원 의사 컬러 플롯(pseudo color plot)을 보여줍니다. 마찬가지로, 그림 A와 C는 각각 측좌핵 core와 shell에서 단일 전기 자극 펄스에 의해 유도된 도파민 방출을 보여주며, 측좌핵 core와 shell에 대한 3차원 의사 컬러 플롯은 각각 그림 B와 D에 표시되어 있습니다. 여기 제시된 것은 슬라이스를 약물 제제로 30분 동안 처리한 후, 미상핵 꼬리핵(caudate putamen)에서 도파민 방출을 유도하기 위해 단일 펄스 자극을 가한 대표적인 트레이스입니다.

실험에 사용된 약제는 quinol, methamphetamine 및 brain derived neurotrophic factor입니다. 이 영상을 시청한 후에는 fast-scan cyclic voltammetry를 이용해 시냅스 전 도파민 역동성을 획득하고 측정하기 위한 마우스 뇌 관상면 절편 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.