Name: 내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 마우스 대뇌 피질의 미세영역 조직 저산소증을 2광자 이미징으로 시각화하는 방법을. NADH 형광과 혈관을 동시에 촬영하여 뇌 조직의 산소 공급을 고해상도로 분석할 수 있습니다.

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우리는 머리 플레이트 디자인을위한 박사 Maiken Nedergaard을 (로체스터 의료 센터의 대학) 감사합니다. 작품은 SD (R01DA026325 및 P30AI078498와 주식 회사 (다나 재단의 두뇌와 Immunoimaging 프로그램, 미국 심장 협회 0635595T와 ALS 협회 [# 1112)]에 기초 보조금)에 NIH 보너스에 의해 지원되었습니다.

1. 이미징을위한 동물의 준비 참고 : 우리는 성인 c57BL 마우스를 사용합니다. 서로 다른 유전자 변형 종자는 연구 질문에 따라 사용할 수 있습니다. Microvascular 수술 및 펄스 oximetry은 흰색 모피와 생쥐 (예 FVB 스트레인)에 용이합니다. <ol><li> 벤치에서 외과 사이트를 준비합니다. 모든 수술 장비는 70 % 에탄올로 autoclaved하거나 소독해야합니다. </li><li> 직장 프로브를 삽입하고 지속 절차 전반에 걸쳐 동물의 체온을 측정 </li><li> 처음에 5 % isoflurane을 사용 마우스를 마취. 15-30의에서 동물이 이동하지 않는 경우, 손난로 (37 ° C)에 배치하고, isoflurane 1.3-1.5 %)를 포함하는 공기의 지속적인 제공을위한 얼굴 마스크를 적용합니다. 동물이 통증 자극 (예 : 꼬리 핀치)에 응답하지 않았는지 확인합니다. </li><li> 건조한 공기에 노출을 막기 위해, 마우스의 시선을 충당하기 위해 인공 눈물 젤을 사용하십시오. </li><li> 전기 면도기를 사용하여, 헤어 F를 제거롬 머리와 양쪽 허벅지에서. 2 분의 허벅지에 머리 제거제 (예 : 나이르) 적용하고 나머지 머리를 제거 조심스럽게 닦아냅니다. 이 허벅지는 oximetry에 사용됩니다. </li><li> 10 % povidone-요오드 용액과 70 % 에탄올을 사용하여 두피를 소독. </li></ol> 2. 열린 두개골 두개골 창 준비하기 <ol><li> 두개골에 꼬리 5mm 시작하면 가위로 두피에 절개를하고, 일cm을 부활시켰습니다. 두개골을 노출 언저리 피부를 이동합니다. </li><li> 두개골 위에 세포막을 제거하기 위해서는 두개골의 맨 10 % 산화철 염화물 솔루션을 적용합니다. 과잉 솔루션을 닦아하고, 45 ° 각도 # 5 핀셋으로 멀리 세포막을 다쳤어요. 그것은 머리에 접시가 안전 (단계 # 4-6) 두개골에 장착할 수 있도록하기 위해 신중하게 사이트를 준비하는 것이 중요합니다. </li><li> 해부 현미경 사용하여 관심 영역을 식별합니다. 두개골 봉합은 피해야한다합니다 인해 두개골 C다음 행과 함께 예측할하다. </li><li> 머리 접시의 창 (그림 1)의 가장자리 주위에 빠른 접착제의 얇은 레이어 (예 Locktite 454)을 적용합니다. 관심 지역 창에 노출되는 등의 방법으로 헤드 플레이트를 둡니다. 헤드 접시 빛의 압력을 적용합니다. 급속하게 접착제를 중합하는 치과용 시멘트의 작은 금액을 적용합니다. 접착제가 polymerizing하는 동안 10 초 동안 잡아. </li><li> 머리 판과 두개골을 봉인하기 위해 창의 가장자리로 빠른 접착제의 작은 금액을 적용합니다. 절개 범위 하에서 동물의 소유자로 머리 판 치고. </li><li> 6,000 RPM 및 IRF 005 드릴 비트에서 설정 Microtorque II 드릴을 사용하여 두개골에서와 헤드 플레이트의 모든 여분의 접착제를 제거합니다. 이것이 달리 유리 커버의 부착을 방해하므로 헤드 판에 남아있는 접착제가 제거되어야합니다. </li><li> 1,000 rpm으로 드릴을 설정하고, 지름 ~ 5 m의 헤드 플레이트 창 내부에 원을 만들어 두개골을 뚫는 시작줄게. 당신은 아주 부드러운 연필로 드로잉하는 것처럼 빛을 전면 움직임을 사용합니다. 압축 공기를 사용하여 뼈 먼지를 제거하는 모든 20~30초을 뚫는 중지합니다. 참고 : 헤드 플레이트의 구멍의 모양은 원형 두개골 창을 만들 쉽게 드릴 비트 (왼쪽 및 오른쪽 손으로 외과 의사에 대한)에 대한 추가 액세스하실 수 있습니다. 또한, 두 이상한 모양의 구멍은 추가 polarographic 또는 electrophysiological 측정 두개골 창 아래에 뇌 조직으로, 클락 - 전극이나 유리 전극을 삽입하기 위해 필요한 공간을 제공합니다. </li><li> 시추가 진행되면서 뚫으는 중앙의 손상 두개골 주위에 형성됩니다. thinned 두개골을 통해 찌를하지만, 설령 두께의이 뚫으을하지 않도록주의하십시오. 대형 혈액 혈관 - 그들이 타협하지 않으며, 가능한 경우도 건드리지 않았어야 주위에 여분주의하십시오. </li><li> 윈도우의 중앙에 ( "탁 끄다") 뼈 올려 핀셋 # 3 중 하나 "다리"를 사용합니다. artific 한 방울을 적용창문에 ial 뇌척수 (aCSF). </li><li> 부드럽게 부드러운 조직 종이 모서리를 (예 : Kimwipe)를 사용 aCSF를 닦아주십시오. 보통 경질은 창의 가장자리 주위에 하나 이상의 장소에서 손상되었습니다. 이러한 사이트 중 하나에서 시작은 부드럽게 들어올리 다음 45 ° 각도 핀셋 # 5를 사용하여 뇌 표면에서 경질을 제거합니다. 경질을 제거하기 시작하기에서 사이트를 선택하면, 큰 혈관에 인접한 지역을 피하십시오. 출혈이 발생하면 aCSF 한 방울을 적용하고 막을 경미한 출혈에 대해 2-3 분 기다립니다. </li><li> 0.07 %의 낮은 용융 aCSF에 녹아있는 아가로 오스)이 체온에 녹아 아가로 오스 가져와 준비합니다. 뇌의 표면에서 aCSF의 초과 멀리 닦아주십시오. 윈도우에서 아가로 오스를 붓고, 그리고 유리 슬라이드와 커버. 유리와 헤드 플레이트 사이의 접촉을 만들기 위해 부드럽게 유리를 눌러 아가로 오스는 고체 때까지 10-20 초 정도 기다리십시오. </li><li> 핀셋과 부드러운 티슈를 사용하여 유리 커버에서 초과 아가로 오스를 제거합니다. </li><li> 작은 넣고접착제 헤드 판에 유리로 유리 주위 급속한 접착제의 금액입니다. 접착제 (그림 1)을 고체화하기 위해 치과 시멘트의 작은 금액을 적용합니다. </li></ol> 3. 정맥 주사와 혈액 산소 모니터링 참고 : 우리는 일상적으로 정맥 주사 텍사스 적색의 응용보다는 꼬리 정맥에 대한 대퇴 정맥을 사용. 대퇴 정맥 주사는 염료의 안전하고 재현성 bolus 주사를 제공하기 때문입니다. <ol><li> 부분적으로 왼쪽 허벅지 안쪽을 폭로를 통해 동물을 켭니다. 이 자세로 동물을 보호하기 위해 테이프를 사용하십시오. </li><li> 살균 스크럽 후 피부에 100 % 에탄올을 적용합니다. </li><li> 무릎에서 치골 symphysis로 내측 허벅지를 따라 절개를합니다. 족집게 # 5를 사용 무딘 절개로 구분 부드러운 조직. </li><li> 텍사스 레드 (2.5 밀리그램 / ML) 130 μl로 1ml 주사기를 채우십시오. 새로운 바늘 (30 게이지) 첨부하고, 베벨을 유지, 30 °에서 신중하게 그것을 구부. 바늘 WI를 채우일 텍사스 레드 솔루션입니다. </li><li> 해부 현미경에서 대퇴 정맥에 바늘을 삽입하고 텍사스 레드 100 μl를 주입. 바늘을 제거하고 가볍게 출혈을 멈추게하기 위해 거즈로 정맥을 누르십시오. </li><li> 4-0 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다. </li><li> 혈액 SpO 2의 지속적인 모니터링 (적절한 혈액 산소를 보장하기 위해) 허벅지 (있는 머리는 이전에 제거되었다)에 산소 농도계 프로브를 배치하십시오. </li></ol> 4. 두 광자 이미징 참고 : 여기 소스로 사 레이저 : 우리는 스펙트럼 - 물리 MaiTai HP DeepSee femtosecond 티가있는 올림푸스 Fluoview1000 multiphoton 이미징 시스템 (직립)을 사용합니다. 이미징 들어, × 10 NA 0.45 (자이스 혈구는 C-고차 색지움) 또는 × 25 NA 1.05 (올림푸스 XLPlan N) 물에 침지 목표를 사용합니다. 우리는 512의 해상도 × 픽셀과 512 픽셀 2 μs의 시간을 머물러에서 12 비트 심도에서 이미지를 가져가라. NADH와 텍사스 - 레드-dextran은 동시에 740 nm의에서 흥분하고, 형석있다escence은 이색성 거울 / 니어 IR-차단 필터 조합을 사용하여 여기 빛으로부터 분리합니다 (FF665-Di01을, FF01-680/SP, Semrock, 로체스터, 뉴욕, 미국)이 이색성 거울을 사용하여 두 개의 채널로 나누어 (505DCXRU, 채도 , Rockingham, 버몬트, 미국), 그리고 대역 통과는 (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36) 필터링. 객관적 후 측정된 레이저 파워 레이어 전의 이미지와 레이어 II의 이미징을위한 20-50 MW를위한 10-20 MW했습니다. <ol><li> 현미경 단계에 수술 준비 마우스를 전송합니다. 높은 배율 두 광자 angiographies으로 등록 기준지도로 사용할 4X 확대 명시야 조명을 사용하여 두개골 창 사이트의 초기 그림을 가져가라. </li><li> × 10 배율을 사용하여 관심 영역을 확대. 피질 층의 관심 분야를 선택 I 또는 II (pial 표면 아래에 150 μm의). 높은 배율이 원하는 경우 × 25 목표를 사용 </li><li> (Figu 시계열을 기록 시작2) 다시. 우리는 이미지의 품질을 높이기 위해 3-5 프레임의 평균을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 동물이 호흡하고있는 공기의 50 %의 N2를 추가하여 hypoxemia를 유도. 이것은 10 % 산소 수준을 가져올 것이다. 산소 농도계 데이터를 모니터링하여 hypoxemia을 확인합니다. </li><li> hypoxemia (예를 들어, 30 초)를 통해 시계열을 기록 계속하고, 정상 O2 수준은 복원 후. </li><li> , 검출 측정하고 혈관 주위 hypoxia와 산소를 조직 실린더의 영역을 quantifying하여 산소 분포의 계산에 대한 데이터를 수집합니다. </li></ol> 5. 데이터 처리 <ol><li> Krogh 조직 실린더 반경 R. 이것은 혈관의 중심과 높은 NADH의 형광이 감지되는 경계 사이의 거리를 측정하여 (그림 3)을 수동으로 할 수를 결정합니다. </li><li> 또는 조직 실린더 반경 R의 전산 탐정 독립적인 세미 - 자동 결정 및 중앙 blo를 사용하여보충 형태로 이전 1을 설명하고이 프로토콜의 토론 섹션에 요약되어 OD의 선박 R. </li><li> 오픈 액세스 이미지 분석 소프트웨어, 예를 들어 ImageJ를 사용하여 hypoxia의 영역을 결정합니다. 이렇게하려면 고가 NADH 조직 형광이있는 영역을 측정 후 높은 NADH 강도 영역을 delineates 임계값을 정의, NADH 신호를 사용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 그림 2는 과도 hypoxemia (이 그림의 PDF 버전을위한, 선택한 스틸 이미지가 사용되었습니다) 중에 NADH / 혈관 조영술 이미지의 비디오를 표시합니다. 영감 산소 농도는 3 분 동안 21 %에서 10 % 인하되었다. 실험적으로 유도된 hypoxemia의이 수준은 대뇌 피질에 심한 hypoxia를 유발하기에 충분합니다. Hypoxia는 동맥 혈액 공급에서 멀리 있던 지역에 초기에, NADH 형광의 증가를 가져온다. 날카로운 NADH 조직 참고피질 microcirculation에서 산소 확산의 관찰할 조직 경계를 나타내는 경계. 그림 3의 이미지는 대뇌 혈관 주위의 산소 확산 경계의 지오메 트리를 보여줍니다. 그것은 이전에 한 설명한 바와 같이, 이러한 경계에서 실린더 직경 Krogh 추론할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 이미징 준비 두개골 창에 (A) 마우스. (B) 헤드 플레이트의 치수. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 내생 NADH 녹색 형광이 약 50 μm의 pial 표면 아래 두개의 창문을 통해 두 개의 광자 이미징과 시각. 혈관 텍사스 레드 dextran과 시각입니다. 흡입된 공기 중의 산소가 3 분 동안 10 % 감소하고 21% 위해 복원되었습니다. 스케일 바 : 50μm. &lt;IMG 고도 = "그림 3"SRC = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg"/&gt; 그림 3. NADH 형광 경계 기하학. 노란색 테두리는 기능성 hypoxia의 경계를 표시, 파란색 동그라미가 예상 산소 (Krogh) 실린더를 보여줍니다. 블루 라인 실린더 반지름을 보여; 번호는 micrometers의 반지름을 보여줍니다.

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</ol>

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산소 확산에 대한 높은 공간적 해상도 정보는 뇌의 혈액 흐름이 뇌 세포에 산소를 제공하고, 신진 대사 수요를 충족하기 위해 규제하는 방법을 이해하는데 중요합니다. 클락 스타일의 유리 전극을 사용하여 전통 polarographic 산소 측정은 고도의 침해이며, 낮은 공간 해상도 2-3과 의미 (두 번째 범위) 응답 시간이 있습니다. 지금까지 뇌 조직에 PO 2를 측정하는 유일한 비침습 방법 흥분 프로브의 부패 비율이 산소 농도 4 ~ 비례 phosphorescence 담금질이다. 이 방법은 정확한 산소 농도을 제공하지만, 독자적인 염료와 기술적으로 정교한 phosphorescence 평생 이미징 시스템이 필요합니다. 여기서는 두 flurescence 채널과 표준 두 광자 이미징 시스템에서 수행할 수 간단, 단순한 접근법을 보여준다. 우리의 접근 방식은 내장 세포 신호 5 활용ND는 대뇌 피질의 microcirculation의 대조적인 시각이 필요합니다. 때문에 기능적으로 산소 농도에게 1 제한에서 NADH 형광의 비선형, 본질적 이진 증가로 인해 고유 NADH 형광은 크게, metabolically 제한 hypoxia와 지역에서 관찰되어 증가했다. 중요한 의미는 대뇌 피질의 microvessels에서 산소 확산의 조직 경계 직접 내생 NADH의 형광 cylindrically 모양의 밀도 변화에 의해 관찰할 수있다는 점이다. 혈관 주위 조직의 산소 볼륨을 정의 cylindrically 모양의 구조의 개념 8 월 Krogh에 의해 소개되었으며, 최근에 실험적으로 두 광자 NADH 이미징 1을 사용하여 관찰 되었기 때문에 우리는 Krogh 실린더 이러한 구조를 참조하십시오. Krogh 실린더 이미지는 이미지 프레임의 Z-스택을 복용하여 3 차원으로 수집 할 수 있습니다. 그들은 예리한 arterioles 부근에서 특히 유명하며 그들이 일치하는 기지입니다H는 소진 periarteriolar 조직 실린더의 1,4를 모세관. Krogh 조직 실린더 반경 R의 객관적 결정 (5.2 참조) 우리는 실린더의 중심과 Matlab 함수 &quot;improfile&quot;을 이용하여 바깥 경계 사이의 잘 정의된 세그먼트 내에 방사상 픽셀 강도 값을 측정을 제공한다. 세그먼트의 바깥쪽 경계는 보이는 경계 너머 안전 마진으로 연장하도록 선택되어야한다. 신호 대 잡음 수준을 향상시키려면 우리는 1 ° 단계에서 눈에 띄는 실린더 세그먼트를 충당하기 위해 필요한 모든 요골 대사 averageed. 세그먼트 내의 결과 평균 요골 강도 프로파일 보이는 조직 경계 R에 통신을 가파른 증가를 전시. 우리는 평균 요골 강도 프로필 sigmoidal 기능 (예 : 볼츠만 함수)를 맞게 및 R의 정의로서 반곡점을 (또한 X 0이라고도 함) 사용됩니다. 해당하는 두 개의 Photon microangiography (텍사스 빨간색)은 실린더의 중앙에 독방 중앙 혈관의 단면을 공개했다. 중앙 혈관의 지름이 직접 R을 결정하는 데 적용할 수 있습니다. 두 광자 NADH 영상은 피질 microangiography의 동시 고해상도 영상과 동일한 공간 해상도를 제공합니다. 이 방법의 정량 응용 프로그램의 중요한 특징은 P NADH 형광 증가 50 3.4 것으로 측정되어있다는 ± 0.6 mm HG 1과 그것 참 microregional 조직 PO 2의 함수로 NADH 형광 강도는 수학적으로 표현할 수 sigmoidal 기능. . 우리는이 기술 하나 hypoxia (10 %로 공기 중에 산소 함량을 감소하여)에 가장 취약한 뇌 영역을 식별할 수있는 표시됩니다. 우리는 또한 산소 확산은 간단한 기하학적인 perivascular 패턴을 따르는 것으로 나타났습니다. 하나 crit이 방법에 대한 ICAL 단계는 두개골 창 준비의 품질입니다. 수술은 노출된 지역으로 혈액 흐름을 방해하지 위해서는 최소한의 손상을 생산한다. 우려가 수술 손상 준비, 창 아래에있는 피질 어떤 의미있는 실험을 precluding,로 시작하는 hypoxic있을 수있다는 것입니다. 잘 준비된 두개골 창에서 모든 선박 유형의 생생한 혈액 흐름과 가장자리를 따라 노 상당한 출혈 상태로 그대로 전공 및 부전공 혈관이 있어야합니다. normoxic 조건에서 (PaO2 80-100 mmHg, SP O2 97-99%) 뇌 실질 조직이 높긴하지만 NADH의 형광과 눈에 밝은 조직 패치없이 균일 균질 NADH의 형광을 전시한다. 우리의 접근 방식의 근본적인 물리적인 제약이 깊이 침투가 제한됩니다. 뇌 속의 청록색 NADH의 형광은 이러한 파장의 헤모글로빈 흡수 및 조직 비산에 의해 급속하게 감쇠됩니다. 비록 높은 수치 조리개와 (예 : 1.05) 물침지 목표는 두 광자 NADH 이미징은 현재 피질 층 I 및 II로 제한됩니다. 또는 흰색 물질에 근접 에너지 대사 가능성이 회백질 다를 수 있기 때문에이 제한은 과학적으로 적합합니다. 그러나 이러한 레이어 IV-VI 또는 흰색 물질 책자 또는 striatum 같은 subcortical 구조로 깊이 피질 구조의 조사는 생체내 6 마우스 피질에서 설명한 특수 microlenses의 사용을 요구한다. 이러한 기능적인 충혈 및 모세관 유동 속도의 검출 7 분석과 같은 다른 측정과 결합하면 산소 확산 경계 NADH 기반의 측정은 특히 유용할 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 뇌졸중과 알츠하이머 병 (AD) 모델에서 hypoxia를 시각적으로 적응 할 수 있습니다. 산소 확산의 간단한 기하학 하나는 모세관 밀도 드이다 상황에서 microvascular 침대에서 산소 그라디언트를 예측할 수8 (예 : AD 9) 주름잡은 감소 모세관 밀도가 뇌 세포 영역이 microstrokes에 의한 hypoxia 손해에 대한 증가 위험이 있는지 살펴보아야한다. 조직 hypoxia와 후속의 연결을 사망 또는 모세관 리모델링 10 ~ 이미지 능력 microregionally 또한 한 조직 microstrokes의 형상과 크기를 검사하여 hypoxia가 발생하는 조직의 볼륨을 확인할 수 있습니다뿐만 아니라 관계. 내생 NADH의 형광의 증가는 급성 mitochondrial 부전의 직접적인 결과이기 때문에 마지막으로,이 방법은 신경 에너지 대사 11 mitochondrial 부전 프록시에 대한 특정 기자로 NADH 이미징을 사용할 수있는 기회를 만듭니다. 결론적으로 내생 NADH 형광의 2 광자 영상 모두 정상 아래의 두뇌에 산소 공급과 소비를 이해하는 데 사용할 수있는 간단하고 undemanding 도구입니다그리고 pathologic 상태 인치

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> 가열 패드 </td><td> Bodi 히트 너머 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 안과 연고 (인공 눈물) </td><td> 화이자 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidone-요오드 10 % 용액 </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 산화철 염화물 10 % 용액 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 시멘트 </td><td> 회사 Stoelting </td><td> 51,456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanoacrylate 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> 하버드 장치 </td><td> 597,316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II handpiece 키트 </td><td> 피어슨 </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 드릴 비트 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 # 5 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11,295 </td><td></td></tr><tr><td> 집게 # 45분의 5 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 유리 coverslip </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Photomultiplier 관 </td><td> 하마 마츠 </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> 티 : 사파이어 레이저 마이 - 타이 </td><td> 스펙트럼 - 물리 </td><td> 및nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

내생 nadh 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 microregional hypoxia의 탐지

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

신진 대사 수요가 높은 수준에서 작동하려면 두뇌의 능력은 혈류와 조직 산소 확산을 통해 지속적인 산소 공급에 따라 달라집니다. 여기에 직접 microregional 조직 hypoxia을 시각화하고 마우스 피질에서 perivascular 산소 그라디언트를 추측하는 시각화된 실험 및 방법론 프로토콜을 소개합니다. 그것은 니코틴 아데닌 dinucleotide (NADH) 내생 형광 강도 및 조직 NADH 형광이 갑자기 10 mmHg 한 아래의 조직에 산소 수준에서 증가 관찰 조직에서 산소 분압 간의 비선형 관계를 기반으로합니다. 우리는 텍사스 레드 dextran와 대조 내장 NADH 조직 형광 및 혈장의 동시 여기를 허용 740 NM에서 두 광자 여기를 사용합니다. 기존의 접근 방법 이상이 방법의 장점은 다음과 같습니다 그것은 본질적인 조직 신호의 활용 및 생체내 인스턴트 메시지에 표준 두 개의 광자를 사용하여 수행할 수 있습니다장비를 노화, 그것은 ~ 50 μm의 깊이 해상도로보기의 전체 분야에서 지속적인 모니터링을 허용합니다. 우리는 대뇌 혈관에서 멀리 뇌 조직 영역 혈관 산소 공급의 감소에 따라 기능적으로 hypoxic 될 최초 취약한 유역 지역에 해당 보여줍니다. 이 방법은 이미지 microregional 피질 산소에 한 수 있으므로 neurovascular 질환과 뇌졸중의 불충 분한 또는 제한된 조직 산소 공급의 역할을 조사하는 데 유용합니다.

여기에 직접 마우스 피질의 microregional 조직 hypoxia을 시각화하는 방법을 설명<em&gt; 생체내에서</em&gt;. 그것은 니코틴 아데닌 dinucleotide (NADH)와 피질 microcirculation 동시에 두 개의 광자 이미징을 기반으로합니다. 이 방법은 조직 산소 공급의 고해상도 분석을 위해 유용합니다.

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

높은 수준의 대사 요구량에서 뇌가 기능할 수 있는 능력은 혈류를 통한 지속적인 산소 공급과 조직 내 산소 확산에 달려 있습니다. ...

이 프로토콜의 전체적인 목적은 생체 내(in vivo) 마우스 피질에서 미세 영역 조직 저산소증을 직접적으로 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 마우스에 개두술을 통해 두개창을 준비합니다. 그 다음, 뇌혈관을 표지하기 위해 형광 염료를 정맥 주입합니다.마지막으로, 내인성 NADH 형광과 형광 표지된 피질 미세혈관의 광자 이미징을 동시에 수행합니다. 최종적으로, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드의 환원형 존재 여부를 시각화함으로써 뇌 실질의 미세 영역에서 발생하는 기능적 저산소증을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. Clark 방식의 전극과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 넓은 시야 범위에서 높은 공간 분해능을 제공하며, 침습성이 더 낮다는 점입니다.이 방법은 두 개의 형광 채널을 갖춘 표준 응용 이광자 시스템에서 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, 로체스터 대학교 미생물학 및 면역학 교수이자 학과장인 Steve Hurst입니다. 오늘 절차를 시연할 분들은 Kishka 연구소의 Anita's son과 제 연구실의 연구 조교수 Oxana Paulka입니다. NADH 이미징 기술을 개척한 Dr.Kishka는 최근 독일에로 거처를 옮겨 오늘 이 자리에 함께하지 못했습니다. 오토클레이브 처리하거나 70%ethanol로 소독한 필수 기구들로 수술 부위를 준비하고, 마우스를 5%isof fluorine으로 마취시킨 후, 가열 패드 위에 올리고 페이스 마스크를 통해 공기 중 1.3에서 1.5%isof fluorine을 투여하십시오.꼬리 꼬집기(tail pinch)를 통해 마취 수준을 확인합니다. 다음으로, 직장 프로브를 삽입하여 절차 전반에 걸쳐 동물의 체온을 지속적으로 측정합니다. 마우스의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 인공눈물 겔을 도포합니다.그다음 머리와 양쪽 허벅지의 털을 제거합니다. 허벅지의 남은 털을 제거하기 위해 제모제를 허벅지에 2분간 도포하며, 허벅이는 옥시메트리(oximetry) 측정에 사용될 것입니다. 마지막으로 10% povidone iodine 용액과 70% ethanol을 사용하여 두피를 소독합니다. 가위로 두개골에서 5mm 떨어진 지점부터 절개하여 크레이니얼 윈도우(cranial window)를 만듭니다.두피에 절개를 가한 후 1cm 정도 전진시킵니다. 피부를 양옆으로 젖혀 두개골을 노출시키고 두개골 상단의 막을 제거합니다. 10% ferric chloride 용액을 도포합니다.과잉 용액을 닦아내고 45도 각도로 막을 긁어냅니다. 다섯 번째, 핀셋을 사용합니다. 해부 현미경을 사용하여 관심 영역을 확인합니다. 헤드 플레이트 창의 가장자리를 따라 래피드 글루를 얇게 도포합니다.관심 영역이 윈도우에 노출되도록 헤드 플레이트를 배치하고 헤드 플레이트에 가벼운 압력을 가합니다. 접착제가 빠르게 중합될 수 있도록 소량의 치과용 시멘트를 도포합니다. 접착제가 중합되는 동안 10초 동안 유지합니다.헤드 플레이트와 두개골을 밀봉하기 위해 창의 가장자리에 소량의 급속 접착제를 도포합니다. 그런 다음 해부 현미경 하에서 헤드 플레이트를 동물 홀더에 나사로 고정합니다. 이때 6,000 RPM으로 설정된 micro torque two 드릴 세트와 IRF 0 0 5 드릴 비트를 사용합니다.두개골과 헤드 플레이트에서 모든 여분의 접착제를 제거하십시오. 그런 다음 드릴을 1,000 RPM으로 설정하고, 헤드 플레이트 창 내부에 직경 약 5 mm의 원을 그리며 두개골을 천공하기 시작하십시오. 매우 부드러운 연필로 그림을 그리듯 가볍게 쓸어내리는 동작을 사용하십시오.20~30초마다 드릴링을 멈추고 압축 공기를 사용하여 골분을 제거하십시오. 드릴링이 진행됨에 따라 중앙의 온전한 두개골 주변으로 구멍이 형성됩니다. 얇은 두개골을 뚫지 않도록 주의하면서, 이 구멍의 두께가 일정하게 유지되도록 하십시오.또한, 굵은 혈관 주변에서는 각별히 주의하십시오. 혈관이 손상되어서는 안 되며, 가능하다면 접촉조차 하지 않아야 합니다. 핀셋의 한쪽 끝을 이용하여 윈도우 중앙의 뼈를 들어 올린 후, 윈도우 위에 인공 뇌척수액 한 방울을 떨어뜨립니다. 킴와이프(Kim wipe)의 모서리를 사용하여 45도 각도로 인공 뇌척수액을 부드럽게 닦아냅니다.다섯 번째로, 핀셋입니다. 윈도우 가장자리를 따라 손상된 경막 부위를 찾아 들어 올려 제거합니다. 출혈이 발생하면 인공 CSF를 한 방울 떨어뜨리고, 미세 출혈이 멎을 때까지 2~3분 동안 기다립니다.다음으로, 인공 뇌척수액에 용해된 0.07% 저융점 agarose 10 milliliters를 준비합니다. 용해된 agarose를 체온까지 데웁니다. 뇌 표면에서 과잉의 인공 뇌척수액을 닦아냅니다.윈도우에 에어로젤(aero)을 붓고 유리 슬라이드로 덮습니다. 그다음 유리를 가볍게 눌러 유리와 헤드 플레이트가 접촉하게 하고, 에어로젤이 고체 상태가 될 때까지 10~20초 동안 기다립니다. 핀셋과 부드러운 티슈 페이퍼를 사용하여 유리 커버에서 과잉 에어로젤을 제거합니다.유리 부분을 헤드 플레이트에 접착하기 위해 유리 주변에 소량의 급결 접착제를 바릅니다. 그 다음, 대퇴정맥에 주입할 접착제를 고정시키기 위해 소량의 치과용 시멘트를 도포합니다. 동물을 부분적으로 돌려 왼쪽 허벅지 안쪽이 드러나게 합니다.테이프를 사용하여 동물을 고정합니다. 이 상태에서 피부에 살균 세정제를 바른 후, 100% ethanol을 도포합니다. 다음으로, 무릎부터 치골 결합까지 허벅지 내측을 따라 절개합니다.필요한 경우, 둔성 박리를 통해 연조직을 분리하십시오. 1mL 주사기에 Texas red 130 µL를 채웁니다. 새로운 30G 바늘을 장착하고, 베벨(bevel)이 위를 향하게 한 상태에서 30도 각도로 조심스럽게 구부립니다.해부 현미경 하에서 바늘에 Texas Red 용액을 채운 후, 바늘을 대퇴정맥에 삽입하고 100 µL의 Texas Red를 주입합니다. 바늘을 제거하고 거즈로 정맥을 가볍게 눌러 지혈합니다. 혈중 산소 포화도의 지속적인 모니터링을 위해 4-0 봉합사로 피부를 봉합합니다.제모를 마친 오른쪽 허벅지에 옥시미터 프로브를 부착합니다. 이미징을 시작하려면, 수술적으로 준비된 마우스를 현미경 스테이지로 옮깁니다. 고배율 광자 이방성(photon anisotropy) 등록을 위한 참조 맵으로 사용하기 위해, Bright Field 조명과 4배 배율로 두개골 창(cranial window) 부위의 초기 사진을 촬영합니다.10배율을 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 피질층에서 관심 영역을 선택합니다. 시계열 기록을 시작하기 위해 하나 또는 두 개를 선택합니다.이미지 품질을 높이기 위해 평균 3~5개의 프레임을 사용할 것을 권장합니다. 다음으로, 동물이 호흡하는 공기에 50% 질소를 첨가하여 저산소혈증을 유도합니다. 이렇게 하면 산소 농도가 10%가 됩니다. 옥시미터 데이터를 모니터링하여 저산소혈증 상태를 확인하십시오.저산소증 동안 약 30초 동안, 그리고 정상 산소 수치가 회복된 후까지 시계열 기록을 계속합니다. 혈관 주변의 저산소 조직 및 산소화된 조직 실린더의 영역을 검출, 측정 및 정량화하여 산소 분포 계산을 위한 데이터를 수집하십시오. 조직 실린더 반경 R을 결정하려면, 혈관의 중심과 높은 NADH 형광이 검출되는 경계 사이의 거리를 측정하십시오.데이터 처리 방법은 서면 프로토콜을 참조하십시오. 이 그림은 일시적 저산소혈증 동안 비디오로 기록된 NADH 및 지형 이미지의 동시 촬영 결과이며, 이때 흡입 산소 농도를 3분 동안 21%에서 10%로 낮추었습니다. 실험적으로 유도된 이러한 수준의 저산소혈증은 대뇌 피질에 심각한 저산소증을 유발하기에 충분합니다.저산소증으로 인해 초기에는 동맥 혈류 공급원에서 가장 먼 영역부터 NADH 형광(녹색으로 표시)이 증가했습니다. 빨간색으로 표시된 피질 미세순환으로부터의 산소 확산의 관찰 가능한 조직 경계를 나타내는 NADH 조직의 뚜렷한 경계에 주목하십시오. 여기는 빨간색으로 표시된 피질의 형광 표지된 미세혈관과 녹색으로 표시된 피질 회백질의 내인성 NADH 형광이 동시에 나타난 이미지이며, NADH 형광 강도 분포는 이진적입니다.NADH 형광이 균일하게 낮은 영역과 NADH 형광이 균일하게 높은 영역이 있습니다. 노란색 선은 NADH 형광이 낮은 영역과 높은 영역 사이의 조직 경계를 나타냅니다. 이러한 조직 경계는 인접한 미세혈관과 공간적 관계를 보입니다.이 관계는 미세혈관에서 조직으로의 산소 확산에 의해 결정됩니다. 어떤 경우에는 파란색 선으로 표시된 바와 같이, 이러한 조직 경계의 원통형 특성 또는 CRO 조직 실린더를 직접 확인할 수 있습니다. 여기서 조직 경계는 동심원 형태의 중앙 혈관을 가진 원형입니다.이 기술은 적절히 수행될 경우 1.5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 부종으로 인한 피질 표면의 수직 이동을 방지하기 위해 커버 글라스를 금속판에 접착하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 조직 저산소증과 뇌혈관 결합 사이의 관계와 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 기능적 충혈 측정과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 마우스 피질에서 미세 지역 조직 저산소증을 시각화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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Source: Nishimura, C.  외. HIV-induced Neuroinflammation의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 대뇌 혈관 건축의 정량화. J. Vis. 특급. (2016). 이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 피질 모세혈관의 생체 내 시각화를 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창이 있는 마취된 마우스에 형광 염료를 주입하고, 이미징을 위한 설정을 준비하고, 분석을 위해 뇌 미세혈관 구조의 상세한 이미지를 획득하는 단계를 간략하게 설명합니다.

 마우스 뇌 미세혈관 구조의 생체 내 이미징을 위한 이광자 현미경 

출처: Ouyang, Y., et al. 마우스 뇌 저산소증-허혈 중 동시 PET/MRI 영상. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 동시 양전자 방출 단층 촬영(PET) 및 자기 공명 영상(MRI)을 통해 뇌 저산소증 손상을 평가하는 기술을 보여줍니다. 마취된 쥐는 총경동맥(CCA) 결찰술을 받아 한쪽 뇌 반구로 가는 혈류를 감소시키고 저산소증으로 인한 손상에 걸리기 쉽습니다. PET 및 MRI 영상은 저산소증 중 포도당 대사 및 구조적 변화를 평가합니다. MRI는 제한된 수분 확산을 감지하는 반면, PET는 포도당 흡수 감소를 나타내어 저산소증으로 인한 세포 스트레스 및 대사 장애를 나타냅니다.

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과 양전자 방출 단층 촬영을 이용하여 비 침습적 영상 및 뇌허혈의 분석 생활 쥐<sup&gt; (18)</sup&gt; F-FDG

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