내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내에서 마우스 피질의 미시 지역 조직 저산소증을 직접 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 마취된 쥐에서 열린 두개골 창을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로, 형광 염료를 정맥 주사하여 뇌 혈관에 라벨을 붙입니다.

마지막으로, 내재적 NADH 형광과 형광 표지된 피질 미세혈관 구조의 광자 이미징을 동시에 수행합니다. 궁극적으로, 환원된 형태의 니코틴아미드인 아데닌 디뉴클레오티드의 존재를 시각화하여 뇌 실질의 미세 영역에서 기능적 저산소증을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. Clark 스타일 전극과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 넓은 시야에 대해 높은 특수 해상도를 제공하고 덜 침습적이라는 것입니다.

이 방법은 두 개의 형광 채널이 있는 표준 적용된 두 개의 사진 시스템에서 수행할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학의 미생물학 및 면역학 교수 겸 학과장인 스티브 허스트(Steve Hurst)이며, 오늘 시연을 시연하는 사람은 키시카 연구소(Kishka Laboratory)의 아니타(Anita)의 아들이며, NADH 이미징 기술을 개척한 키시카 박사(Dr. Kishka)는 최근 독일로 이주하여 오늘 이 자리에 참석할 수 없습니다. 70%의 에탄올로 오토클레이브 또는 소독한 필요한 기구로 수술 부위를 준비하고 5%의 불소로 마우스에 마취한 후 발열 패드에 놓고 안면 마스크를 바르면 공기 중에 1.3-1.5%의 불소가 전달됩니다.

꼬리 꼬집기를 수행하여 마취 수준을 확인하십시오. 다음으로, 직장 프로브를 삽입하고 시술 내내 동물의 체온을 지속적으로 측정합니다. 마우스의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 인공 눈물 젤을 마우스에 바르십시오.

그런 다음 머리에서 머리카락을 제거하고 양쪽 허벅지에 제모제를 2 분 동안 바르고 남은 머리카락을 제거하면 허벅지가 산소 측정에 사용됩니다. 마지막으로 10% 포비돈 요오드 용액과 70% 에탄올을 사용하여 두피를 소독합니다. 두개골 창을 만들기 위해 5mm부터 시작하여 가위로 두개골을 꽉 쥐었습니다.

두피를 절개하여 1cm 전진합니다. 두개골을 노출시키기 위해 피부를 옆으로 움직여 두개골 상단의 막을 제거합니다. 10%염화제2철 용액을 도포합니다.

여분의 용액을 닦아내고 45도 각도로 멤브레인을 긁어냅니다. 다섯째, 핀셋 해부 현미경을 사용하여 관심 영역을 식별합니다. 헤드 플레이트의 창 가장자리 주위에 빠른 접착제를 얇게 바르십시오.

관심 영역이 창에 노출되는 방식으로 헤드 플레이트를 배치하고 헤드 플레이트에 가벼운 압력을 가합니다. 접착제를 빠르게 중합시키기 위해 소량의 치과용 시멘트를 바르십시오. 접착제가 중합되는 동안 10초 동안 유지합니다.

창문 가장자리에 소량의 빠른 접착제를 바르고 헤드 플레이트와 두개골을 밀봉합니다. 그런 다음 헤드 플레이트를 해부 범위 아래의 동물 홀더에 나사로 고정합니다. 마이크로 토크 2 드릴 세트 6, 000 RPM 및 IRF 0 0 5 드릴 비트를 사용합니다.

두개골과 헤드 플레이트에서 여분의 접착제를 모두 제거합니다. 그런 다음 드릴을 1,000RPM으로 설정하고 직경 약 5mm의 헤드 플레이트 창 내부에 원을 만들어 두개골 드릴링을 시작합니다. 매우 부드러운 연필로 그림을 그리는 것처럼 가볍게 쓸어넘기는 동작을 사용하십시오.

20-30초마다 드릴링을 중지하고 압축 공기를 사용하여 뼈 먼지를 제거합니다. 시추가 진행됨에 따라 중앙의 손상되지 않은 두개골 주위에 굴이 형성됩니다. 얇은 두개골을 뚫고 들어가지 않도록 주의하되, 이 굴의 두께가 균일한지 확인한다.

또한 큰 혈관 주변을 특히 조심해야 합니다. 그들은 타협해서는 안되며, 가능하면 만져서는 안되며, 핀셋의 한 갈래로 창문 중앙의 뼈를 들어 올리고 창문에 인공 뇌척수액을 한 방울 떨어 뜨립니다. Kim 물티슈의 모서리를 사용하여 인공 뇌척수액을 45도 각도로 부드럽게 닦아냅니다.

다섯 번째는 핀셋입니다. 창 가장자리를 따라 손상된 듀라 영역을 찾아 들어 올려 제거합니다. 출혈이 발생하면 인공 CSF를 한 방울 떨어뜨리고 경미한 출혈이 멈출 때까지 2-3분 동안 기다립니다.

다음으로, 인공 뇌척수액에 용해된 0.07% 저용융 에어로 10ml를 준비합니다. 녹은 에어로를 체온으로 가져옵니다. 뇌 표면에서 과도한 인공 대뇌 척수액을 닦아냅니다.

창문에 에어로를 붓고 유리 슬라이드로 덮으십시오. 그런 다음 유리를 부드럽게 눌러 유리와 헤드 플레이트가 접촉하도록 하고 에어로가 단단해질 때까지 10-20초 동안 기다립니다. 핀셋과 부드러운 티슈 페이퍼를 사용하여 유리 덮개에서 과도한 에어로를 제거합니다.

유리 주위에 소량의 빠른 접착제를 바르고 헤드 플레이트에 붙입니다. 그런 다음 소량의 치과 시멘트를 바르고 접착제를 응고시켜 대퇴 정맥에 주입합니다. 동물을 부분적으로 뒤집어 왼쪽 허벅지 안쪽을 드러냅니다.

테이프를 사용하여 동물을 고정합니다. 이 자세에서 소독 스크럽을 바르고 피부에 100% 에탄올을 바르십시오. 그런 다음 무릎에서 치골 합성까지 내측 허벅지를 따라 절개합니다.

필요한 경우 둔기 절개로 연조직을 분리하십시오. 1밀리리터 주사기에 130마이크로리터의 텍사스 레드를 채웁니다. 새 30 게이지 바늘을 부착하고 경사를 위로 유지하면서 30도 각도로 조심스럽게 구부립니다.

해부 현미경으로 바늘에 텍사스 레드 용액을 채우고 바늘을 대퇴 정맥에 삽입한 다음 100마이크로리터의 텍사스 레드를 주입합니다. 바늘을 제거하고 거즈로 정맥을 가볍게 누르면 출혈이 멈춥니다. 혈중 산소 포화도를 지속적으로 모니터링하기 위해 4개의 봉합사를 사용하여 피부를 닫습니다.

이전에 머리카락을 제거한 오른쪽 허벅지에 산소 농도계 프로브를 놓습니다. 이미징을 시작하려면 수술로 준비된 마우스를 현미경 스테이지로 옮깁니다. 광자 아니에 대한 더 높은 배율로 등록하기 위한 참조 맵으로 사용하기 위해 4배 배율에서 명시야 조명을 사용하여 두개골 창 위치의 초기 사진을 찍습니다.

10배 배율을 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 피질 층에서 관심 영역을 선택합니다. 하나 또는 두 개가 시계열을 기록하기 시작합니다.

이미지 품질을 높이기 위해 평균 3-5개의 프레임을 사용하는 것이 좋습니다. 다음으로, 동물이 호흡하는 공기에 질소를 50% 첨가하여 저산소혈증을 유발합니다. 이렇게 하면 산소 농도가 10%로 올라갑니다.산소 농도계 데이터를 모니터링하여 저산소혈증을 확인합니다.

약 30초 동안 저산소혈증을 통해 시계열을 계속 기록하고 정상적인 산소 수치가 회복된 후에도 시계열을 계속 기록합니다. 혈관 주변의 저산소증 및 산소가 공급된 조직 실린더 영역을 감지, 측정 및 정량화하여 산소 분포 계산을 위한 데이터를 수집합니다. 삐걱거리는 조직 실린더 반경 R을 측정하려면 혈관 중심과 높은 NADH 형광이 감지되는 경계 사이의 거리를 측정합니다.

데이터 처리 방법에 대해서는 작성된 프로토콜을 참조하십시오. 이 그림은 일시적인 저산소혈증 동안 기록된 비디오의 지리 이미지인 동시 NADH를 보여주며, 3분 동안 흡기 산소 농도가 21%에서 10%로 낮아졌습니다. 이 수준의 실험적으로 유도된 저산소혈증은 대뇌 피질에서 심각한 저산소증을 유발하기에 충분합니다.

저산소증은 동맥 혈액 공급에서 가장 먼 영역에서 처음에는 녹색으로 표시된 NADH 형광의 증가로 이어졌습니다. 선명한 NADH 조직 경계는 빨간색으로 표시된 피질 미세 순환에서 산소 확산의 관찰 가능한 조직 경계를 나타냅니다. 다음은 빨간색으로 표시된 피질의 형광 표지된 미세혈관과 녹색의 피질 회백질에서 고유한 NADH 형광의 동시 이미지이며, NADH 형광 강도 분포는 이진법입니다.

NADH 형광이 균일하게 낮은 영역과 NADH 형광이 균일하게 높은 영역이 있습니다. 노란색 선은 NADH 형광이 낮은 영역과 높은 영역 사이의 조직 경계를 나타냅니다. 이러한 조직 경계는 근처의 미세혈관과 공간적 관계를 나타냅니다.

이 관계는 미세혈관에서 조직으로의 산소 확산에 의해 결정됩니다. 일부 경우에, 이러한 조직 경계의 원통형 성질 또는 CRO 조직 실린더는 파란색 선으로 표시된 대로 직접 인식될 수 있습니다. 여기서 조직 경계는 동심원 중심 혈관이 있는 원형 모양입니다.

이 기술은 제대로 수행되면 1.5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 부종으로 인한 피질 표면의 수직 이동을 방지하기 위해 커버 유리를 금속판에 접착하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 조직 저산소증과 뇌혈관 결합 사이의 관계와 같은 추가 질문을 해결하기 위해 기능적 충혈 측정과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 마우스 피질에서 미시 지역 조직 저산소증을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.