마우스에 γHV68 감염의 측정

이 비디오에서는 플라크 및 감염 센터 분석을 통해 마우스의 비강 내 감염 후 급성 및 잠복 헤르페스 바이러스 감염을 평가합니다. 생리학적 노출을 모방하기 위해 먼저 마우스는 뉴런 감마 헤르페스 바이러스의 비강 내 투여에 의해 감염됩니다. 68, 5-7일 후에 폐 조직이 채취되어 균질화됩니다.

그런 다음 급성 바이러스 부하를 결정하기 위해 플라크 분석을 수행합니다.잠복 바이러스 부하를 결정하기 위해 마우스에서 비장을 채취합니다. 감염 후 12-14일 후에 감염된 SPOC 조준경의 단세포 현탁액을 생성하고 감염 센터 분석을 수행합니다. 이러한 분석의 결과는 생체 내 바이러스 복제 및 감염성의 시공간 프로파일을 보여줍니다.

따라서 바이러스 감염 연구를 위해 조직 배양 시스템을 사용하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 감마 헤르페스 바이러스의 수명 주기 및/또는 발병기전의 생체 내 특성화를 위해 마우스의 해양 감마 헤르페스 바이러스 감염을 활용한다는 것입니다. 생후 6주 된 생쥐를 감마 헤르페스 바이러스 68 또는 감마 HV 68에 감염시키고 마취 투여 후 5-10분 후에 발가락 꼬집기를 수행하여 이 프로토콜을 시작합니다. 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

비강 내 투여가 아닌 경우 바이러스를 투여하면 재채기가 발생하고 올바른 복용량을 받지 못합니다. 다음으로 피펫 끝을 마우스의 코 구멍에 놓고 감마 HV 68의 단위를 한 방울씩 형성하는 500-2, 500 플라크를 포함하는 15 마이크로 리터의 PBS를 천천히 전달합니다. 마우스는 방울을 흡입해야 하며 거품이 다른 쪽 콧구멍을 반복하여 형성되어서는 안 됩니다.

마우스를 가열 패드에 놓고 10-15분 동안 회복되도록 합니다. 쥐가 의식을 되찾으면 케이지로 돌아가 급성으로 감염된 폐의 바이러스 역가를 확인할 수 있습니다. 플라크 분석은 비강 내 감염 후 5-7일 후에 수행되었습니다.

제물로 바친 쥐에서 채취한 폐를 밍크처럼 차가운 PBS 교반을 넣어 잠시 저어준 다음 PBS를 제거하고 이 세척을 한 번 더 반복합니다. 남아 있는 혈액 세포를 제거하려면 1ml의 얼음처럼 차가운 완전한 DMEM이 들어 있는 5ml 원형 바닥 튜브에 폐 중 하나를 넣습니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 폐의 다른 쪽을 다른 튜브에 넣고 드라이 아이스와 에탄올 슬러리에 담그십시오.

빠르게 얼립니다. QPCR로 폐의 바이러스 DNA 부하를 검사하기 위해 튜브를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 다음으로, 얼음 위에 놓인 조직을 1초 동안 최대 속도로 균질화합니다.

그런 다음 튜브를 드라이아이스에 10분 동안 올려 샘플을 동결 및 해동합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 수조에 2분 동안 옮깁니다. 균질화기를 70% 에탄올과 PBS로 세척하십시오.

그런 다음 균질화 과정을 반복하고 다음 샘플로 동결 해동합니다. 각 샘플 사이의 균질화기 청소. 균질화된 조직을 3000RPM에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 연속 희석액을 제조합니다. S 상등액 튜브를 10에서 0으로 표시합니다.

그런 다음 540마이크로리터의 일반 DMEM이 들어 있는 8개의 추가 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 10에서 마이너스 10에서 마이너스 8로 표시합니다. 10으로 표시된 튜브에서 0으로 표시된 튜브에서 10으로 표시된 튜브에서 1을 뺀 캡 소용돌이로 60 마이크로 리터를 옮깁니다. 그런 다음 60 마이크로 리터를 빼서 10에서 마이너스 2로 표시된 튜브로 옮깁니다.

10에서 마이너스 8까지 연속 희석을 계속합니다. 다음으로, 인큐베이터에서 하루 전에 준비된 변이 세포 단층을 제거합니다. 세포는 고르게 분포되어야 하며 세포 밀도는 플라크 분석 당일에 30-40%에 도달해야 합니다.

분석을 위해 플레이트에 라벨을 붙입니다. 중복의 각 희석액은 배지를 흡인시킨 다음 12개의 웰 각각으로 흡인합니다. 연속으로 희석된 균질산염의 웰당 200마이크로리터를 10에서 마이너스, 8에서 10에서 0의 역순으로 추가합니다.

배양 중 15분마다 1시간 동안 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에 변이 세포를 5%이산화탄소에 넣고, 플레이트를 부드럽게 부풀어 올려 배양 후 단층에 바이러스가 고르게 분포되도록 하고, 접종물을 흡인하고 오버레이 배지 웰당 2밀리리터로 교체합니다. 그런 다음 일주일이 지난 후 일주일 동안 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 오버레이 배지를 흡입하고 플라크 분석을 위해 2ml의 고정 염색 배지로 교체합니다.

플레이트를 실온에서 최소 1시간 동안 배양합니다. 고정 된 얼룩 매체를 붓고 물로 두 번 씻으십시오. 그런 다음 접시가 건조되면 뚜껑을 닫고 접시를 자연 건조시킵니다.

오류를 최소화하기 위해 각 희석에서 플라크의 수를 계산하십시오. 플라크가 10개 미만 또는 100개 이상인 웰은 제외합니다. 다음 공식을 사용하여 바이러스를 더 엄격하게 계산하며, 밀리리터당 플라크 온난화 단위의 역가는 웰당 플라크 수를 웰당 접종물의 부피로 나누고 여기에 희석 계수를 곱하여 잠재 바이러스 부하를 결정합니다.

감염 센터 분석은 비강 내 감염 후 12-14일 후에 수행됩니다. 먼저 제물로 바친 쥐에서 채취한 비장을 10ml의 DMEM과 2%FBS가 포함된 10ml의 냉각된 DMEM에 모아 10cm 플레이트에 넣고 비장을 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 매체를 사용하여 적십니다.

2개의 젖빛 끝 유리 현미경 슬라이드. 한 슬라이드의 서리가 낀 면에 비장을 놓고 모든 붉은 덩어리가 으깨질 때까지 두 슬라이드를 함께 누르고 문질러 비장을 기계적으로 분리합니다. 이렇게 하면 지방 입자가 있는 경우 제거하여 슬라이드를 10cm 플레이트 위에 고정합니다.

그 위에 피펫 DMEM을 사용하여 내용물을 플레이트에 헹구고 뒤집어서 다른 쪽을 씻습니다. 그런 다음 다른 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다. 세포 여과기를 통해 전체 조직 현탁액을 50ml 원추형 나사 캡 튜브에 부드럽게 붓습니다.

그런 다음 비장 균질액이 포함된 10cm 접시를 PBS 10밀리리터로 세척하고 세포 여과기를 통해 붓고 1, 300RPM에서 10분 동안 단일 세포 현탁액을 원심분리하고 스핀 후 스내트를 버립니다. 스내트를 버리고 5밀리리터의 CK 버퍼를 추가합니다. 적혈구를 지연시킵니다.

세포 알갱이를 튕겨 덩어리를 부수십시오. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 스핀 후 1, 300RPM으로 게인을 원심분리하십시오. 세나를 버리고 가볍게 피펫팅하여 두 개의 FBS로 PBS에 펠릿을 다시 매달립니다.

그런 다음 자동 세포 계수기를 사용하여 생존 가능한 세포를 얼음 계수에 다시 놓습니다. 세포 수가 결정되면 PBS 재현탁 SP 세포를 375배 G에서 4분 동안 스핀다운합니다. supinate를 폐기하고 4ml의 완전한 DMEM 표지에 세포를 재현탁합니다.

2.4 밀리리터의 DMEM을 함유한 5개의 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 1-5, 1-25, 1-125, 1-250 및 동결 및 해동을 5배 연속 희석합니다. 그런 다음 600마이크로리터의 PLE 세포 현탁액을 첫 번째 튜브에 희석하고 잘 섞습니다. 소용돌이치지 마십시오.

각 튜브에 대한 직렬 희석을 계속합니다. 다음으로, 하루 전에 준비된 다양한 세포의 제조된 6웰 단층에서 배지를 흡인하고, 순차적으로 희석된 세포 1ml를 10웰의 여러 세포에 시딩하여 사용하게 한다. 플레이트를 8-12시간 동안 배양하고, 파종된 세포 현탁액을 흡인하고, 6일이 지난 후 추가로 6일 동안 각 웰 인큐베이트에 4ml의 오버레이 배지를 추가합니다.

감마 헤르페스 바이러스 68 및 잠복 감염 C 마우스에서 바이러스 항 세포사멸 단백질 BCL 2의 역할을 평가하기 위해 이전과 같이 플라크 분석으로 비장 감염 센터의 수준을 결정하고, 비기능성 바이러스 BCL 2를 포함하는 감마 HV 68 또는 감마 HV 68의 돌연변이 균주에 감염되었으며, 급성 및 잠복 감염률을 본 비디오와 같이 평가했습니다. 바이러스성 BCL 2는 BC 마우스에서 비강 내 감염 7일 후 폐에서 야생형 감마 HV 68과 유사한 수준으로 복제되었습니다. 바이러스의 폐 타이투스에서 두 그룹 간에 통계적으로 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다.

이러한 데이터는 바이러스 BCL 2가 생쥐에서 Gamma H HV 68의 급성 감염에 결정적인 요인이 아님을 나타냅니다. 그러나 감염 후 28일이 지났을 때 비장에서 바이러스성 BCL 2 돌연변이 바이러스의 역가는 감염 센터 분석으로 측정한 야생형에 비해 6배에서 10배 감소했습니다. 이는 바이러스 BCL 2 돌연변이 gamma H 68 바이러스가 감염 후 비장 잠복기 유지에 결함이 있음을 시사하며, 감염 분석으로 얻은 결과를 확인하거나 바이러스 잠복 부하의 감소로 인해 감염률이 감소했는지 여부를 확인하기 위해 X vivo 바이러스 게놈 수치를 QPCR에 의해 평가했습니다.

반복된 실험에서 바이러스 BCL 2 돌연변이 바이러스의 바이러스 게놈 부하가 28일째에 야생형 바이러스에 비해 크게 감소했습니다. 바이러스 게놈 부하와 감염 잠복 단계에서 생체 외 잠복 감마 HV 68 바이러스 BCL 두 돌연변이 바이러스 재활성화의 빈도 사이의 밀접한 상관 관계는 이 돌연변이 바이러스 감염의 잠복 결함을 강조합니다. 이 절차에 따라 바이러스 게놈 보유 세포의 빈도를 평가하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 희석 PCR 제한과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.