게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

두 단백질 간의 상호작용을 테스트하려면, Gateway 클로닝 기술을 사용하여 관심 있는 두 유전자를 BF 및 벡터에 클로닝해야 합니다. 이 컨스트럭트들을 Agrobacterium GV3101에 형질전환합니다. 해당 컨스트럭트를 포함하는 GV3101 박테리아 배양액을 혼합하여 잎에 공동 침투시킵니다.

두 후보 단백질이 서로 상호작용하는 경우, 공초점 현미경을 사용하여 YFP 신호를 관찰할 수 있습니다. BFC 기법의 주요 목적은 두 단백질 간의 상호작용을 테스트하는 것입니다. vavo에서 당사는 연구자들이 BFC 및 이중 하이브리드 분석을 모두 쉽게 수행할 수 있도록 gateway 호환 BFC 및 이중 하이브리드 벡터 시리즈를 제작하였습니다.

이 영상에서는 BFC 시스템의 간편한 사용법을 시연하겠습니다. BiFC 발현 시스템에서 단백질 및 단백질 간 상호작용을 테스트하기 위해, 먼저 GV 3 1 0 1 박테리아 배양액을 준비해야 합니다.

플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 적절한 항생제가 포함된 5 mL의 YEB 배지에 접종합니다. 그런 다음 이 배양액을 28°C에서 하룻밤 동안 배양하며, 진탕 속도는 분당 200회(200 rpm)로 설정합니다.

박테리아 배양액은 다음 날 아침에 준비되어야 합니다. 박테리아가 과성장하지 않았는지 확인하십시오. 배양액을 인큐베이터에서 꺼내어 각 배양액의 일부를 멸균된 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.

원심분리 튜브를 데스크탑 원심분리기에 넣습니다. 실온에서 1000 G로 10분 동안 박테리아를 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 그런 다음 침투 배지 1배량을 추가하고 몇 번 가볍게 두드려 재현탁하여 펠렛을 세척합니다.

세척 단계를 두 번 더 반복하십시오. 이는 박테리아 배지에 남아 있는 항생제 흔적을 제거하는 데 중요하며, 제거하지 않을 경우 침투 후 식물 세포가 파괴될 수 있습니다. 최종 세척 후, 펠렛을 0.5 mL의 침투 배지에 재현탁하십시오. 침투 배지를 공시료로 사용하여 분광광도계로 이 박테리아 현탁액의 OD600을 측정하십시오.

OD 측정 후, 침투 배지를 사용하여 OD를 조정해야 합니다. 최종 OD는 1에서 1.2 사이여야 합니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 모든 세균 현탁액을 준비하십시오.

두 가지 후보 단백질에 해당하는 동일한 양의 박테리아 현탁액을 옮겨 새 1.5 mL 튜브에 넣고 혼합합니다. 이제 박테리아 혼합물을 침투시킬 준비가 되었습니다. 모든 조합을 준비하고, 음성 대조군을 포함하는 것을 잊지 마십시오. 침투에는 5~6주 된 Nicotiana benthamiana 식물을 사용해야 합니다.

침투 전 기공을 열어주기 위해 식물을 생장실에서 꺼내 한 시간 동안 암조건에 둡니다. 이는 침투 과정을 돕습니다. 부유 상태의 박테리아 현탁액 약 100 µL를 취합니다.

바늘이 없는 수컷 슬립 팁 주사기를 사용하여 혼합합니다. 주사기 팁을 잎의 뒷면에 대십시오. 손가락으로 잎의 윗면을 받쳐 줍니다.

일반적으로 플런저를 아래로 누릅니다. 액체가 잎의 기공을 통해 확산되는 것을 확인할 수 있으며, 침투 후에는 중간 엽육 조직의 공극이 더 얇아진 느낌이 듭니다. 침투시킨 부위를 마커 펜으로 표시하십시오. 그렇게 하지 않으면 이틀 후에 어떤 부위에 침투시켰는지 식별할 수 없게 됩니다. 서로 다른 박테리아 혼합액을 침투시켜야 하는 경우, 반드시 장갑에 50% ethanol을 분사하거나 침투 작업 사이에 장갑을 교체하십시오.

교차 오염을 방지하기 위해 침투 지점 사이에 1m의 늑골 간격을 두십시오. 침투 후 5일까지 24시간마다 PFA 신호를 모니터링해야 합니다. 샘플을 고정하기 위해 서로 다른 크기의 커버 슬리브 두 개를 사용할 수 있습니다.

먼저, 노치 커버 슬리브 위에 미세 수분 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 침투 구역 내의 조직 조각을 칼로 작게 절단합니다. 시료 내의 구역 정맥은 피하도록 주의하십시오.

절단된 칼 조직을 슬라이드 위 물속에 놓은 다음, 작은 커버글라스를 덮고 가볍게 누릅니다. 이제 시료를 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 여기서는 BIFC 신호를 시각화하기 위해 NACA T CSS P two 공초점 현미경을 사용합니다.

일반적인 형광 현미경도 사용할 수 있습니다. 공초점 현미경은 더 나은 이미지를 제공하며 약한 신호를 검출할 수 있습니다. 이 NCAs P two 시스템에서 VFC 신호를 검출하려면 YFP 파라미터를 사용할 수 있습니다.

여기 있는 YFP 프리셋을 더블 클릭하면 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 excitation이 자동으로 켜지고 emission 검출 범위가 설정됩니다. 다른 시스템을 사용하고 계신다면, 매뉴얼을 참조하여 파라미터를 적절하게 설정하시기 바랍니다. 이 영상을 시청하신 후, unbe MI Transcend 발현 시스템을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 BFCE를 수행하실 수 있기를 바랍니다.

이 절차는 담배 및 AY 식물에도 적용할 수 있습니다. 당사의 BFC 벡터에는 각각 HA 및 flag 태그가 포함되어 있으므로, 필요한 경우 co IP를 수행하여 상호작용을 검증할 수 있습니다.