게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출
2011년 9월 16일
우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.
두 단백질 간의 상호 작용을 테스트하려면 gateway longing 기술을 사용하여 두 개의 관심 유전자를 BF와 벡터에 클로닝해야 합니다. 이 구조체는 에어륨 GV 3 1 0 1로 변형됩니다. 구축하기 위해 함유된 GV 3 1 0 1 박테리아 배양물을 혼합하여 잎에 공동으로 침투시킨다.
두 후보 단백질이 서로 상호 작용하는 경우 결과 초점 멕시코를 사용하여 YFP 신호를 관찰할 수 있습니다. BFC 기술의 주요 목적은 두 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 것입니다. vavo에서는 연구자에게 BFC 및 ISTO 두 가지 하이브리드 분석을 모두 수행할 수 있는 사용하기 쉬운 도구를 제공하는 일련의 게이트웨이 호환 BFC 및 IS 두 가지 하이브리드 벡터를 만들었습니다.
이 비디오에서는 BFC 시스템을 쉽게 사용하는 방법을 보여 드리겠습니다. 단백질을 테스트하기 위해 unbe 방식의 단백질 상호 작용은 발현 시스템을 초월합니다. 먼저 GV 3 1 0 1 박테리아 배양을 준비해야 합니다.
플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 YEB 배지의 남성 5명에게 적절한 항생제를 접종해야 합니다. 그런 다음 이 문화를 28도에서 하룻밤 사이에 흔들어야 합니다. 속도는 분당 200 실행입니다.
박테리아 배양은 다음날 아침에 준비되어야 합니다. 박테리아 D가 자랐는지 확인하십시오. 인큐베이터에서 배양물을 꺼내 각 배양물의 수컷 한 마리를 멸균 1.5 수컷 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
원심분리기 튜브를 탁상용 원심분리기에 넣습니다. 실온에서 1000G에서 10분 동안 박테리아를 스핀다운하고 그물을 버립니다. 그런 다음 침투 매체를 한 끼 추가하고 몇 번 쓰다듬어 재평가하여 페네이트를 관찰합니다.
세탁 단계를 두 번 더 반복합니다. 이것은 침투 후 물개를 심게 하는 박테리아 배지에서 미량의 항생제를 제거하는 데 도움이 되기 때문에 중요합니다. 최종 세척 후, resus는 침투 매체를 은행 제어로 사용하는 분광 광도계를 사용하여 이 박테리아 현탁액 600개를 빚진 0.5 남성 침투 매체 측정으로 팔레트를 중단합니다.
OD 측정 후 침투 매체를 사용하여 OD를 조정해야 합니다. 최종 OD는 1에서 1.2 사이여야 합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 모든 박테리아 현탁액을 준비해야 합니다.
두 개의 후보 단백질에 해당하는 동일한 양의 박테리아 현탁액을 전달하고 새로운 1.5 수관 음성 박테리아 혼합물에 혼합하면 이제 침투와 관련이 있습니다. 모든 조합을 준비하고 음수 컨트롤을 포함하는 것을 잊지 마십시오. 침투를 위해 5-6 주 코드와 최상의 매너 식물을 사용해야합니다.
성장실에서 식물을 제거하고 폭풍 공격을 시작하기 위해 침투하기 전에 한 시간 동안 We night에 놓을 수 있습니다. 이것은 침투 과정에 도움이 될 것입니다. 약 100마이크로리터의 Resus 부유 박테리아를 추출합니다.
바늘 없이 한 수컷이 미끄러진 팁 주사기 근처에 섞습니다. 주사기 끝을 잎 라이의 아래쪽에 놓습니다. 손가락으로 무릎 위쪽을 지지합니다.
일반적으로 플런저를 누릅니다. 잎을 통해 액체가 확산되는 것을 볼 수 있어야 하지만 침투 후 Meso 더 얇은 공기 공간이 마크 펜으로 침투된 에어로를 가능하게 하는 것을 느낄 수 있어야 합니다. 그렇지 않으면 이틀 후에 침투 한 A를 식별 할 수 없습니다. 다른 박테리아 믹스 믹스로 침투해야하는 경우 장갑에 50 % 에탄올을 뿌리거나 침투 사이에 G 장갑을 교체하십시오.
교차 오염을 방지하기 위해 침투 사이에 1미터의 갈비뼈 공간을 두십시오. PFA 신호는 침투 후 최대 5일까지 24시간마다 모니터링해야 합니다. 크기가 다른 두 개의 커버 슬리브를 사용하여 샘플을 담을 수 있습니다.
먼저 노치 커버 슬리브에 미니 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 침투 영역 내에서 작은 칼 조직 조각을 자릅니다. 샘플에서 메스꺼움 정맥을 피하십시오.
자른 칼 티슈를 슬라이드의 물에 넣고 내려 놓고 작은 전류 슬리브를 사용하여 덮고 부드럽게 누릅니다. 이제 멕시코 범위에서 샘플을 관찰할 수 있습니다. 여기에서는 이 NACA T CSS P 두 컨포칼 멕시코를 사용하여 BIFC 신호를 시각화합니다.
멕시코의 레귤러 향기도 사용할 수 있습니다. 컨포칼은 더 나은 사진을 제공하고 약한 신호를 감지합니다. YFP 매개변수를 사용하여 이 NCA P 두 시스템에서 VFC 신호를 감지할 수 있습니다.
여기에서 이 YFP 사전 설정을 두 번 클릭하기만 하면 여기가 자동으로 켜지고 방출 감지 범위가 설정됩니다. 다른 시스템을 사용하는 경우 설명서를 참조하여 매개변수를 올바르게 설정하십시오. 이 비디오를 시청한 후 unbe MI Transcend 발현 시스템을 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 BFCE를 수행할 수 있기를 바랍니다.
이 절차를 담배 및 AY 식물에도 적용할 수 있습니다. BFC 벡터에는 각각 HA 및 플래그 태그도 포함되어 있으므로 필요한 경우 co IP를 수행하여 상호 작용을 검증할 수도 있습니다.
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개요
본 연구는 분할된 노란색 형광 단백질(YFP) 접근법을 사용하여 식물에서 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 새로운 기술을 제시합니다. 관심 유전자와 연속적인 YFP 단편을 클로닝함으로써, 연구자들은 YFP 재구성을 관찰하여 단백질 상호작용을 알 수 있습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 식물 생물학
- 단백질 상호작용
- 형광 단백질 기술
배경
- 단백질 상호작용을 이해하는 것은 생물학적 과정을 규명하는 데 중요합니다.
- 기존 방법은 식물 시스템에 적합하지 않을 수 있습니다.
- 분할 YFP 기술은 상호작용의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.
- 게이트웨이 클로닝은 융합 단백질 구성을 촉진합니다.
연구 목적
- 식물에서 단백질 상호작용을 연구하는 효율적인 방법을 개발하는 것.
- 연구자들에게 BFC 및 ISTO 2-하이브리드 분석을 수행할 수 있는 도구를 제공하는 것.
- 식물 생물학에서 단백질 기능에 대한 이해를 향상시키는 것.
사용된 방법
- YFP 단편을 Gateway 호환 벡터로 클로닝하는 것.
- 구성체를 Agrobacterium GV3101로 변형시키는 것.
- 박테리아 배양물을 식물 잎에 공동 침투시키는 것.
- 현미경을 사용하여 YFP 신호를 관찰하여 상호작용을 확인하는 것.
주요 결과
- 성공적인 YFP 신호 재구성은 단백질 상호작용을 나타냅니다.
- 식물 시스템에서 BFC 기술의 효과를 시연합니다.
- 연구자들을 위한 사용자 친화적인 도구를 제공합니다.
- 다양한 단백질 쌍을 통해 방법을 검증합니다.
결론
- 분할 YFP 기술은 식물에서 단백질 상호작용을 연구하는 데 귀중한 도구입니다.
- 이 방법은 식물 생물학에 대한 추가 연구를 촉진할 수 있습니다.
- 향후 응용 분야에는 복잡한 단백질 네트워크 탐색이 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
