Name: 게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 식물에서 단백질 상호작용을 검출하는 BiFC 기법을 활용한 방법입니다. Gateway 클로닝과 YFP 형광 보완을 통해 단백질 결합을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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우리는 원고와 일반적인 실험실 지원을 읽을 바이올렛 Nguyen 감사합니다.

1. Agrobacterium 문화의 준비 <ol><li> Agrobacterium 긴장 GV3101은 이전에 게이트웨이와 호환 BiFC 벡터 pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN, 융합 GOI의 구조가 포함된 각 변형. </li><li> BiFC 융합 단백질의 5 ML YEB (5g L -1 쇠고기 추출물, 1g L -1 효모 추출물, 5g L -1 펩톤, 5g L -1 자당, 2mM MgSO 4, 산도 7.2) 문화를 예방하기와 agrobacterium 변형 구성 적절한 항생제 선택합니다. 28 야간 문화를 성장 ° C 200 rpm으로 흔들어. </li><li> 멸균 1.5 ML의 원심 관에 문화 1 ML를 제거합니다. </li><li> 상온에서 10 분 1,000g에서 펠릿 세포가 뜨는 폐기. </li><li> 침투 미디어 1 ML (5g L -1 D - 글루코오스, 50 MM MES (시그마), 2 MM 나 3 PO 4, 0.1 MM acetosyringone) 11을 추가하여 펠렛을 씻으십시오. pipetting하여 Resuspend 펠렛, 10 분 1,000g에서 다시 펠릿 세포. </li><li> 세척 단계 두 번 더 반복합니다. </li><li> 0.5 ML의 침투 미디어의 펠렛을 Resuspend. </li><li> 600 nm의 흡광도에서를 측정하고 1.2-1.0로 OD 600 최종 조정합니다. </li><li> 새로운 1.5 ML 튜브에 각 구조의 agrobacterium 정지의 동일한 금액을, 10 초위한 와동 나누어지는. 하나의 침투에 대한 각 구조 100 μL 정도 이상입니다. </li><li> agrobacterium 혼합물은 이제 침투 준비가되었습니다. </li></ol> 2. 침투 <ol start="11"><li> N. benthamiana 공장 16 - H 조명 및 8 - H 어두운 사이클로, 21 ° C에서 성장하고 있습니다. 6 주 된 식물 다섯은 침투에 대한 사용해야합니다. </li><li> stomata 완전히 열 수 있도록 infiltratring 전에 1 H에 대한 하얀 빛 아래 성장 공간과 장소에서 식물을 제거합니다. </li><li> 1 - ML 슬립 팁 투베르쿨린 주사기 바늘없이 resuspended agrobacterium 혼합을 그립니다. </li><li> 잎의 아래쪽에 대해 주사기의 팁을 놓고 직접 손가락으로 잎의 상단을 지원하면서 부드럽게 플런저를 우울. 그것이 mesophyllar 공기 공간을 가득 채우고 같은 액체는 나뭇잎을 통해 확산됩니다. </li><li> 미래를 식별 마커 펜으로 침투 지역을 라벨. </li><li> 다른 구조로 침투하면 장갑을 변경하거나 infiltrations 사이에 70 % 에탄올과 그들을 청소하거나 있는지 확인하십시오. 가능하면, 교차 오염을 방지하기 위해 다른 샘플 간의 잎의 중륵맥 공간을 둡니다. </li><li> 정상적인 성장 조건에서 성장 캐비닛에 식물을 놓습니다. </li></ol> 3. 재구성 YFP 신호의 관측 <ol start="18"><li> 침투 영역 내에서 잎 조직의 소비세 5mm X 5mm 세그먼트 </li><li> 물 속에 들어가면, 유리 현미경 슬라이드에 coverslip으로 샘플을 커버하고 공촛점 또는 형광 현미경을 사용하여 상호 작용을 조사, 샘플을 탑재합니다. </li><li> 시간 코스 이상의 여러 다른 위치를 표시하는 형광 융합 단백질을 높일 수 표현 / 매매 이상과 같은 표현식은 최대 5 일 후로 침투의 시간에서 24 시간마다 모니터링해야합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : BiFC 분석하여 테스트 단백질 단백질 상호 작용의 예제는 그림 1에 표시됩니다. AtTHP1과 AtSAC3A는 효모 TREX - 2 복합 Arabidopsis 상동체의 구성 요소로 여겨지고 있습니다. 그들은 nuclearporin AtNUP1과 상호 작 용할 수 있으며 mRNA 수출 10 용이하게하실 수 있습니다. AtNUP1가 pEarlyGate202 - YN에 복제하는 동안 AtTHP1와 AtSAC3A는 pEarlyGate201 - YC으로 복제했다. 구조는 이후 GV3101으로 변형되었다. 침투에 대한 (AtNUP1 + AtSAC3A,, AtTHP1 + AtSAC3A AtTHP1 + AtNUP1) 세 개의 구성 가능한 조합은 3와 쌍을했다. 재구성 YFP 신호 침투 후 LCSM 48시간 아래에 관찰되었다. 신호는 표피 세포에서 관찰하고 이러한 단백질의 서브 셀룰러 로컬 리 제이션과 일치 핵 주변이나 핵 플라즈마에 현지되었습니다. 부정적인 통제는 YFP 신호를 보여주지 않았다. <img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Arabidopsis TREX - 2 mRNA 수출 복잡한 구성 요소가 서로 상호 작용할 수 있습니다. N. benthamiana 단풍, GOI의 구조와 공동 변화는 Leica TCS SP2 confocol 현미경을 사용하여 침투 후 48-72 H 몇 군데 있었다 pEarleyGate201 - YC 및 pEarleyGate202 - YN (로 표시)로 융합된. 이미지 통합 공촛점 YFP 및 표피 N.의 밝은 필드 이미지로 표시됩니다 benthamiana 잎 세포

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

BiFC 분석은 단백질 상호 작용을 공부를위한 강력한 도구입니다. 전통 Y2H 분석과는 달리, BiFC뿐만 아니라 단백질 단백질 상호 작용의 시각화을 허용뿐만 아니라 하위 세포 지방화 같은 단백질 복잡한 더 많은 정보를 제공합니다. 또한, 그것은 두 후보 단백질이 세번째 파트너 가까이에 충분히 가져 수있는만큼 간접적인 상호 작용을 검출하는 것이 가능합니다. 모든 기술과 마찬가지로, BiFC는 제한 사항이 있습니다. 형광단 형성에 대한 분자 산소의 요구로 인해, BiFC은 산소의 존재에서 살아남기 수없는 의무를 anaerobes에서 사용할 수 없습니다. 이것은 에어로빅 생물 6 BiFC의 사용을 제한합니다. 형광단 단지의 형성은 되돌릴 수 있습니다. 이것은 다른 사람과 상호 작용하는 단백질을 방지하고 동적인 평형 6 단백질 단지의 협회와 disassociation를 중단 있습니다. 그러나,이 비가 역성은 약하거나 교통 상호 작용을 시각화하는 데 수 있습니다. 형광 단백질 조각들은 융합 아르...

<table><tbody><tr><td>아세토시링곤(Acetosyringone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES 수화물(MES hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 슬립 팁 투베르쿨린 주사기(slip-tip tuberculin syringe)</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

게이트웨이 가능 bimolecular의 형광 complementation (bifc) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

우리는 생체내 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하는 BiFC 기술을 개발했습니다. 이 두 아닌 중복 조각으로 분할 노란색 형광 단백질 (YFP를)에 의해 수행됩니다. 각 조각은 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 이러한 구성은 다음 융합 단백질의 통과 식을 수 있도록 Agrobacterium의 중재 ​​변환을 통해 Nicotiana benthamiana에 공동 변형하실 수 있습니다. 심리 단백질은 1-7을 상호 작용을 때 YFP 신호의 reconstitution에만 발생합니다. 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하고 유효성을 검사하려면 BiFC는 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이것은 Y2H에서 간과된 수있는 간접적인 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 게이트웨이 기술에 관심 셔틀의 유전자를 (GOI)에 연구자 수있는 범용 플랫폼입니다 많은 표현 가능한 8,9와 같은 기능 분석 시스템과 같은. 오리 엔테이션 및 읽기 프레임 모두 표현 가능한 클론을 만들기 위해 제한 효소 또는 결합을 사용하지 않고 유지하실 수 있습니다. 그 결과, 하나는 실험을 통해 일관성있는 결과를 보장하기 위해 모든 다시 시퀀싱 단계를 제거할 수 있습니다. 우리는 BiFC와 Y2H 모두 assays 10을 수행하기 위해 사용하기 쉬운 도구를 통해 연구자를 제공 게이트웨이 호환 BiFC 및 Y2H 벡터 일련의를 만들었습니다. 여기, 우리는 N.에 단백질 단백질 상호 작용을 테스트하기 위해 BiFC 시스템을 사용의 용이성을 보여주 benthamiana 식물.

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

본 연구진은 두 단백질 간의 상호작용을 생체 내(in vivo)에서 테스트하기 위한 BiFC 기술을 개발하였습니다. 이는 황색 형광 단백질을 두 부분으로 나누어...

두 단백질 간의 상호작용을 테스트하려면, Gateway 클로닝 기술을 사용하여 관심 있는 두 유전자를 BF 및 벡터에 클로닝해야 합니다. 이 컨스트럭트들을 Agrobacterium GV3101에 형질전환합니다. 해당 컨스트럭트를 포함하는 GV3101 박테리아 배양액을 혼합하여 잎에 공동 침투시킵니다.두 후보 단백질이 서로 상호작용하는 경우, 공초점 현미경을 사용하여 YFP 신호를 관찰할 수 있습니다. BFC 기법의 주요 목적은 두 단백질 간의 상호작용을 테스트하는 것입니다. vavo에서 당사는 연구자들이 BFC 및 이중 하이브리드 분석을 모두 쉽게 수행할 수 있도록 gateway 호환 BFC 및 이중 하이브리드 벡터 시리즈를 제작하였습니다.이 영상에서는 BFC 시스템의 간편한 사용법을 시연하겠습니다. BiFC 발현 시스템에서 단백질 및 단백질 간 상호작용을 테스트하기 위해, 먼저 GV 3 1 0 1 박테리아 배양액을 준비해야 합니다.플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 적절한 항생제가 포함된 5 mL의 YEB 배지에 접종합니다. 그런 다음 이 배양액을 28°C에서 하룻밤 동안 배양하며, 진탕 속도는 분당 200회(200 rpm)로 설정합니다.박테리아 배양액은 다음 날 아침에 준비되어야 합니다. 박테리아가 과성장하지 않았는지 확인하십시오. 배양액을 인큐베이터에서 꺼내어 각 배양액의 일부를 멸균된 1.5 mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.원심분리 튜브를 데스크탑 원심분리기에 넣습니다. 실온에서 1000 G로 10분 동안 박테리아를 원심분리한 후 상층액을 제거합니다. 그런 다음 침투 배지 1배량을 추가하고 몇 번 가볍게 두드려 재현탁하여 펠렛을 세척합니다.세척 단계를 두 번 더 반복하십시오. 이는 박테리아 배지에 남아 있는 항생제 흔적을 제거하는 데 중요하며, 제거하지 않을 경우 침투 후 식물 세포가 파괴될 수 있습니다. 최종 세척 후, 펠렛을 0.5 mL의 침투 배지에 재현탁하십시오. 침투 배지를 공시료로 사용하여 분광광도계로 이 박테리아 현탁액의 OD600을 측정하십시오.OD 측정 후, 침투 배지를 사용하여 OD를 조정해야 합니다. 최종 OD는 1에서 1.2 사이여야 합니다. 다음 단계로 넘어가기 전에 모든 세균 현탁액을 준비하십시오.두 가지 후보 단백질에 해당하는 동일한 양의 박테리아 현탁액을 옮겨 새 1.5 mL 튜브에 넣고 혼합합니다. 이제 박테리아 혼합물을 침투시킬 준비가 되었습니다. 모든 조합을 준비하고, 음성 대조군을 포함하는 것을 잊지 마십시오. 침투에는 5~6주 된 Nicotiana benthamiana 식물을 사용해야 합니다.침투 전 기공을 열어주기 위해 식물을 생장실에서 꺼내 한 시간 동안 암조건에 둡니다. 이는 침투 과정을 돕습니다. 부유 상태의 박테리아 현탁액 약 100 µL를 취합니다.바늘이 없는 수컷 슬립 팁 주사기를 사용하여 혼합합니다. 주사기 팁을 잎의 뒷면에 대십시오. 손가락으로 잎의 윗면을 받쳐 줍니다.일반적으로 플런저를 아래로 누릅니다. 액체가 잎의 기공을 통해 확산되는 것을 확인할 수 있으며, 침투 후에는 중간 엽육 조직의 공극이 더 얇아진 느낌이 듭니다. 침투시킨 부위를 마커 펜으로 표시하십시오. 그렇게 하지 않으면 이틀 후에 어떤 부위에 침투시켰는지 식별할 수 없게 됩니다. 서로 다른 박테리아 혼합액을 침투시켜야 하는 경우, 반드시 장갑에 50% ethanol을 분사하거나 침투 작업 사이에 장갑을 교체하십시오.교차 오염을 방지하기 위해 침투 지점 사이에 1m의 늑골 간격을 두십시오. 침투 후 5일까지 24시간마다 PFA 신호를 모니터링해야 합니다. 샘플을 고정하기 위해 서로 다른 크기의 커버 슬리브 두 개를 사용할 수 있습니다.먼저, 노치 커버 슬리브 위에 미세 수분 한 방울을 떨어뜨립니다. 그런 다음 침투 구역 내의 조직 조각을 칼로 작게 절단합니다. 시료 내의 구역 정맥은 피하도록 주의하십시오.절단된 칼 조직을 슬라이드 위 물속에 놓은 다음, 작은 커버글라스를 덮고 가볍게 누릅니다. 이제 시료를 현미경으로 관찰할 수 있습니다. 여기서는 BIFC 신호를 시각화하기 위해 NACA T CSS P two 공초점 현미경을 사용합니다.일반적인 형광 현미경도 사용할 수 있습니다. 공초점 현미경은 더 나은 이미지를 제공하며 약한 신호를 검출할 수 있습니다. 이 NCAs P two 시스템에서 VFC 신호를 검출하려면 YFP 파라미터를 사용할 수 있습니다.여기 있는 YFP 프리셋을 더블 클릭하면 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 여기에서 excitation이 자동으로 켜지고 emission 검출 범위가 설정됩니다. 다른 시스템을 사용하고 계신다면, 매뉴얼을 참조하여 파라미터를 적절하게 설정하시기 바랍니다. 이 영상을 시청하신 후, unbe MI Transcend 발현 시스템을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 BFCE를 수행하실 수 있기를 바랍니다.이 절차는 담배 및 AY 식물에도 적용할 수 있습니다. 당사의 BFC 벡터에는 각각 HA 및 flag 태그가 포함되어 있으므로, 필요한 경우 co IP를 수행하여 상호작용을 검증할 수 있습니다.

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연구

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Biology

생물학

이 문서는 제대로 BioRad는 양파 표피 세포에 플라스미드 DNA을 소개하는 진 건 헬리 우스 및 Bimolecular 형광 Complementation의 원칙 (BiFC)를 기반으로 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 테스트를 사용하는 방법을...

헬리 우스 진 건을 사용하여 양파 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 Bimolecular 형광 Complementation (BiFC) 어세이

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

이분자 형광 보완의 유세포 분석은 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법을 제공합니다. 이 방법은 매핑 단백질 결합 부위와 단백질 - 단백질 상호 작용을 조절하는 요인을 선별 적용 할 수 있습니다.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

여기서 우리는 BiFC 기반 FRET-FLIM 분석법에 의한 형광 태그 단백질을 사용하여 3개의 단백질 파트너 간의 삼차 복합 형성을 시각화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생체 내에서단백질 단백질 상호 작용 복합체를 연구하는 데 유용합니다.

BIFC-FRET-FLIM 분석체에 의한 MADS 박스 전사 계수의 두 단백제와 칼슘 센서 단백질 간의 삼자 상호 작용 결정

여기에서는 AT4G18020(APRR2)-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이(Cucumis sativus L.)에서 근접 라벨링(PL) 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 벡터의 구성, 아그로인 침투를 통한 구성물의 변형, 비오틴 침투, 단백질 추출 및 친화성 정제 기술을 통한 비오틴 표지 단백질의 정제를 설명합니다.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

배우세요 식물에서 단백질 상호작용을 검출하는 BiFC 기법을 활용한 방법입니다. Gateway 클로닝과 YFP 형광 보완을 통해 단백질 결합을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

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