Name: 결합 지노 믹스, Metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 학습하세요 대사체 프로파일링과 공동발현 분석을 결합하여 식물 유전자 기능을 주석하는 방법을. HPLC와 바이오정보학을 활용해 후보 유전자를 식별하고 대사 경로를 특성화합니다.

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1. 샘플 준비 <ol><li> 식물 재료는 수확 즉시 냉동있다. </li><li> 냉동 식물 재료는 -80 ° C.에 믹서 분쇄기에 의해 가루 (또는 절구)와 팔콘 튜브 또는 Eppendorf 튜브에 저장됩니다 </li></ol> 2. 신진 대사 프로파일을위한 추출 <ol><li> 나누어지는는 2 ML Eppendorf 튜브에 식물 재료 냉동. </li><li> 냉동 식물 소재의 신선한 무게 밀리그램 당 추출 버퍼의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 25인가 -1에서 2 분 믹서 밀 하나의 금속 (또는 gilconia) 볼을 넣고 냉동 분말의 homogenize. </li><li> 12,000 rpm으로 10 분 원심 분리기. </li><li> 원심 필터를 NANOSEP하기 뜨는을 전송합니다. </li><li> 4,000 rpm으로 2 분을 원심 분리기. </li><li> 사용할 때까지 -20 ° C에서 새로운 Eppendorf 튜브, 그리고 저장소로 뜨는을 전송합니다. </li></ol> 3. LC-MS에 의한 신진 대사 프로 파일링 <ol><li> HPLC를 설정하고 열 오븐 및 샘플 트레이의 온도를 확인. </li><li> MS 조건을 설정하고 진공과 가열 모세관의 상태를 확인합니다. </li><li> MS 검출기의 M / Z 보정을 수행합니다. </li><li> LC-MS에 대한 추출물의 50 μl의 유리관에 전송합니다. </li><li> LC-MS에 추출물의 5 μl를 주입. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> Xcalibur 또는 Metalign 4를 구성하고 처리하는 데이터 분석을 선택합니다. </li><li> 표 봐도에서 화합물 클래스에 따라 귀하의 관심 감지 봉우리의 테이블을 준비합니다. </li><li> 표준 화합물의 공동 용출하여 봉우리를 식별합니다. </li><li> 주석은 MS이 분석, 문헌 조사, 신진 대사 데이터베이스를 검색합니다 (그림 2, 12,13)를 사용하여 봉우리를 발견했습니다. </li></ol> 5. 대사 경로의 예측 <ol><li> 검색된 화합물로 가능한 통로를 구축. 피크 주석을 사용하여 경로의 예측은 검색된 화합물의 화학적 구조에 기초해야대사 경로 13 효소 기능을 연결하는 예측하여의. 구조화 biosynthetic 단계는 정확한 피크 주석과 함께 실시되어야한다. 설탕 잔기와 adducted 위치 예측은 MS 분석에 의해 파악하는 것은 매우 어렵기 때문이죠 그러나 세부적인 화학 구조의 결정은, 예를 들어 설탕 잔기에 대해이 단계에서 필수가 아닙니다. 이러한 hexoside 및 pentoside 같은 설탕 유형의 결정은 프로젝트의 마지막 단계에서 설탕 기증자의 효소 분석에 의해 식별됩니다. 대부분 경로의 예측 건설은 작은 분자 같은 탈수 반응과 같은 일부 경우를 제외하고 큰 분자의 중간 그대로 수행해야합니다. 예를 들어 원자 분자량 목록, 16-H 사이의 차이에 대한 M / Z 및-OH 잔기 (산화), 14 M / Z (탄소 원자) 차이에 대한간에-OH 및-OMe (methylation)와 162m / Z ( hexose (글리코 실화)에 대한 MW-H 2 O)를 예측하는 데 유용합니다. 의 결정조직의 specificities의 상관 분석과 수정 유형은 대사 경로의 예측을하는 데 도움이됩니다. 이러한 KEGG 데이터베이스 (같은 일반적인 대사 경로의 데이터베이스 <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> )와 PlantCyc은 ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> )에 관심의 대사 경로의 예측에 매우 효과적입니다. </li></ol> 6. Arabidopsis Orthologous 유전자 ID를 가진 유전자 목록의 작성 <ol><li> 게놈 데이터베이스로부터 유전자의 ID 목록을 다운로드합니다. </li><li> , orthologous 유전자의 Arabidopsis 유전자 ID를 추가하여 타겟 공장의 경우 Arabidopsis 않습니다. </li><li> 귀하의 통로 -의 - 관심 유전자의 목록을 준비합니다. Arabidopsis 경로 데이터와 유전자 가족 데이터의 해설 테어 웹사이트 (에서 사용할 수 있습니다 <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). 당신은 Arabidopsis orthologous 유전자의 목록을 준비하면 이후 combi 수NE 그들. </li></ol> 7. 공동 표명 유전자 분석 <ol><li> 귀하의 통로 -의 - 관심 (표 II)에서 잘 알려진 유전자 쌍을 사용하여 상관 관계를 선택하여 경로에 대한 최고의 데이터베이스를 검색할 수있는 준비된 유전자의 ID 목록을 사용하여 테스트합니다. 공동 표현식 데이터베이스 또는 유전자 발현 데이터베이스가 여러분의 흥미에 공장에서 사용할 수없는 경우, Arabidopsis 공동 식은 데이터베이스는 Arabidopsis orthologous 유전자의 목록을 사용해야합니다. 보리의 경우, 쌀, 포플러, 밀, medicago와 대두, 식물 종의 공동 발현 분석 (표 II) 사용할 수 있습니다. </li><li> 귀하의 통로 -의 - 관심 잘 알려진 유전자의 연결을 기반으로 타겟 공동 표현식 네트워크 프레임 워크를 구축. </li><li> 서로 관련 후보 유전자 (귀하의 통로 -의 - 관심 잘 알려진 유전자의 연결 사이의 계수 가치의 대략적인 값 내에서 R &lt;0.4 ~ 0.90) 추가 및 홍보에 자신의 유전자 주석을 확인최상의 후보 유전자 (그림 3)을 찾는이 네트워크 연결에 edicted 가족. 계수 값의 임계값을 서로 관련 유전자의 네트워크 구조와 밀도에 따라 조정되어야한다. </li><li> 당신의 대상 경로에 대한 전문적인하다고 좁힐 수있는 유전자의 목록을 확인하십시오. </li><li> 당신의 후보 유전자의 장기 specificities 및 스트레스 반응의 유전자 발현을 확인합니다. </li></ol> 8. 새로운 경로를 예측하는 모든 정보의 통합 <ol><li> 예측 대사 경로에 공동 표현 분석의 쿼리에 사용되었습니다 잘 특징 유전자를 추가합니다. </li><li> 이 경로에 uncharacterized 부분을 확인, 예를 들어 효소 단계, 수송 단백질과 전사 요인을 uncharacterized. </li><li> 이러한 누락 uncharacterized 단계를 위해 가장 적합한 유전자 주석을 예측. </li><li> silico GE에의 신진 대사 프로 파일링 및 후보 유전자의 결과를 결합NE 표현은 예측 경로를 기반으로. </li><li> oxidised 화합물에 대한 P450, 사이드위한 acetylated 신진 대사, glycosyltransferase위한 acetyltransferase 예를 들어 유전자 기능에 따라 예측된 경로, 귀하의 후보 유전자를 마련. 아미노산 시퀀스의 Phylogenetic 트리 분석은 P450과 glycosyltransferase과 같은 몇 가지 다양한 유전자 가족을 위해 유용합니다. </li><li> 신진 대사 축적 및 후보 유전자의 유전자 발현 수준 간의 조직 specificities이나 스트레스 응답의 일관성을 확인합니다. </li><li> 기판 및 스트레스 반응 유전자를 제공하는 다른 신진 대사에 대한 연결을 확인합니다. </li></ol> 9. 바이오 자원을 이용한 유전자 식별을위한 실험 <ol><li> 후보 유전자 식별을위한 실험의 촉진을위한 bioresources의 가용성을 확인합니다. </li><li> 같은 KO 돌연변이 라이브러리 및 전체 길이 cDNA 라이브러리 등 바이오 자원을 이용한 유전자 기능의 식별을위한 실험을 수행합니다. 티overexpression의 식물과 한방의 돌연변이, 효소 분석 및 발기인 구속력 분석의 준비와 유전자의 기능 확인을위한 그 실험은, 당신의 예측에서 가장 좋은 후보 유전자에 대해 수행되어야한다. 단백질 속성의 특성화 및 그 변혁을위한 재조합 단백질 및 유전자의 복제를 준비하는 데 상당히 오래 걸리기 때문에 KO 돌연변를 사용하여 신진 대사 프로필을 확인 후 진행해야하는 가장 좋은 overexpression 공장의 준비를위한 재조합 단백질 분석. </li></ol> 10. 대표 결과 이 프로토콜에서 설명하는 통합 분석의 절차는 지정된 실험 목적 및 생물 학적 및 분석 조합의 선택에 따라 많은 가능성을 가지고 있습니다. 절차 및 실험 설계의 선택은 대상 경로, 화합물과 식물 종의 기초로 제대로 진행해야한다. 이 프로토콜에 설명된 통합 전략은 foc입니다 여러 바이오 및 데이터 자원의 효율적인 사용과 식물 유전자 기능과 새로운 유전자 기능의 발견 주석에 사용됩니다. 예상 결과는 결정적인 예측의 유일한 케이스를 제공하겠다고 약속한다. 이 사실은 충분한 증거가 조합 프로파일에 의해 주어질 수 없다면 실험이 시작하지 말아야함을 나타냅니다. 이러한 이유로, 어떠한 경우에 RT-PCR에 의한 이러한 타겟 유전자 발현 프로 파일링 같은 추가 예비 실험, 유전자 기능의 예측을 지원할 수 있습니다. 예측의 정확도와 정확성이 높은 조합의 유사 콘텐츠의 질적 차이와 수에 따라 연결합니다. 또한, 좋은 후보자 및 유효한 결과는 경로의 정확한 예측에서 온 수 있습니다. 피크 주석은 예제 문헌 조사, 참고 식물 추출물, MS N 분석, 장기 특이성 및 돌연변이 분석 13 여러 방법의 조합에 의해 실시되어야한다. 1 "SRC ="/ files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/&gt; 1 그림. 통합 접근 방식을 통해 유전자 주석의 실험 흐름의 개요. 어떤 경우에는 프로젝트는 특별한 조건이나 조직에서 발견되는 소설 피크하며, 신진 대사 내에서 그 역할을 이해하고자하는 욕구의 발견과 함께 시작합니다. 다른 경우에는 프로젝트의 목적은 이러한 전사 인자와 같은 주요 규제 요인 유전자 식별하거나 발견이다. 실험 설계는 여러 기관에서 조직 샘플의 광범위한 사용하여 대상 경로의 신진 대사 단계의 명확한 차이를 보여주는 데이터 세트와 함께 계획이었습니다, 그리고 스트레스 조건에 노출 differentially 재배 식물이나 식물과에 자료를 쓰는해야 신진 대사 프로 파일링. 돌연변이와 유전자 변형 식물뿐만 아니라 QTL 은닉 번식 재료는 또한 이러한 연구에 적합한 유전 물질을 나타냅니다. 소설 경로의 예측은 정확로 신중하게 수행되어야이러한 여러분의 통로 -의 - 관심 유전자 발현 자료에 따르면 장기 증권 및 스트레스 반응 등 metabolotype의 다른 유형 피크 주석과 조합 방식. 마지막 단계에서, 신진 대사 및 성적표 프로파일은 결국, 웹 자원의 silico 분석과 heterologous 표현을 통한 유전자 발현의 체외 특성화에 결합하면, 그 함수의 유전자 후보와 해설의 확인을 가져다 줄 수있는 수행하여야한다 그리고 대사 경로 내의 위치. 약어 : QTL, 양적 특성의 Loci. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 피크 해설을 위해 조합 접근법의 흐름을 작동합니다. 피크 식별 및 주석 표준 화합물에 의한 야생 유형의 비교 및 뮤턴트를 내라을위한 절차, 대상 최고의 다차원 질량 분광법은 순수 com의 질량 스펙트럼을 나타내는데이터베이스를 12 파운드. 약어 : DB, 데이터베이스, 펀치 노크 아웃, 1-D, 한 차원, 2 차원, 2 차원, NMR, 핵 자기 공명, 적외선, 적외선, MS N, 대량 양산 spectrometries. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. anthocyanin 경로의 예 공동 규제 네트워크 분석. Coexpression 분석은 프라임 (를 사용하여 수행되었다 <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> 3 개 8,2 ATTEDII 버전의 설정 데이터를 기반으로)을 Pajek 프로그램 ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). 긍정적인 상관 관계는 (R &lt;0.5) 네트워크 연결을하기 위해 사용됩니다. 레드 노드 : 열두 anthocyanin 효소 유전자 (At5g13930, CHS, TT4, chalcone의 synthase; At3g55120, C안녕, TT5, chalcone isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-hydroxylase; At5g07990, F3'H, TT7, 플라 보노이드 3'-hydroxylase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, 플라 보노이드 3 - O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol 환원 효소, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin synthese; At4g14090, A5GT, anthocyanin 5 - O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 "XT, putative anthocyanin 3 - O-glucoside 2"- O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyanin 5 - O-glucoside 6 '' '- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyanin 3 - O-glucoside 6 "- O - P-coumaroyltransferase) 및 anthocyanin 생산을위한 두 전사 요인 (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2)는 후보 유전자를 찾기 위해 사용되었다 R의 계수와 임계값과 후보 유전자가 "세트의 교차로"에 의해 발견된 검색 &lt;./ 그들이 쿼리 모든 유전자 (천 anthocyanin의 biosynthetic 유전자)에 의한 집합의 교차에 의해 쿼리 0.50을보기 &gt;&gt;. 서로 관련 후보 유전자 (68 유전자)와 쿼리 유전자 (14 유전자)를 포함하여 공동 표현식 네트워크, R&gt;는 0.50이 국회베이스를 이용한 "세트의 상호"에 의해 다시 만들어진 검색했습니다. 프라임 데이터베이스 및 네트워크에서 '. NET'파일과 함께 서식이 있었다 출력 파일은 Pajek 소프트웨어를 사용하여 그립니다. 파란색 노드는 anthocyanin의 유전자와 상호 후보 유전자를 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 종 </td><td> 주요 신진 대사 보조 </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolate, flavonol, anthocyanin, sinapoyl 유도체 </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonol, anthocyanin, 살리실산 유도체 </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonol, anthocyanin, 탄닌, stilbene </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonol, anthocyanin, glycoalkaloid는 관련 chrologenate, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum의 </td><td> Flavonol, anthocyanin, nicotianamide, acylsugar를 관련 chrologenate </td></tr><tr><td> Oryza sativa 로구나 </td><td> Glycoflavone, anthocyanin, 스테롤 유도체 </td></tr><tr><td> Zea 년 5 월 </td><td> Glycoflavone, anthocyanin, benzoxazinone, 스테롤 유도체 </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> 아이 소플라본, anthocyanin, 사포닌, </td></tr><tr><td> japonica 로터스 </td><td> 이소플라본, flavonol, anthocyanin, 사포닌, </td></tr></tbody></table> 모델 식물 수종의 표 전 주요 보조 metabolites. <table border="1"><tbody><tr><td> 공동 표현 데이터베이스 </td><td> 주소 </td></tr><tr><td> 공장 교차 사양이거야 </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> 행성 </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> 식물 종 </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> 바 </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> 주문 </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> 프라임 </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa 로구나 </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> 쌀 배열 데이터베이스 </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> 표 II. silico 공동 발현 분석에 사용할 수있는 유전자 발현 데이터베이스.

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<li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+storage+metabolome%3A+profiling+the+barley+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li>
<li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

transcriptomics 및 metabolomics 기술이 몇 년 동안 사용되었음을 감안할 때, 유전자 주석을 도와 주었던 metabolomics를위한 데이터 통합​​의 과정은 일반적으로 알려지지 않은 신진 대사를 대표하는 소설 최고의 식별로 시작합니다. 이 사실은 신진 대사 봉우리의 양적 분산 또는 생합성 대한 책임 것으로 생각 소설 후보 유전자를 평가하는 것입니다 다음 단계로 이어집니다. 이 프로토콜에 설명된 전략은 그러나, 세 가지 주요 문제 I) 피크 주석의 어려움, II) 경로 예측의 복잡성, 3) 유전자 발현 데이터의 유전자 정보와 품질의 해상도를 가지고 있습니다. 첫 번째 문제를 대응하기 위해, 최대 주석은 표준 물질 또는 MS N 분석, 참조 추출물, 돌연변이 분석, 신진 대사 데이터베이스 검색 및 문헌 조사 (그림 2, 12)의 조합적인 접근 이용한 정보의 공동 용출과 함께 진행되어야한다. s에 대한econd 문제는 경로 예측은 정확 피크 주석에 의해 얻을 수 있습니다. 신진 대사 축적이 관련 유전자의 유전자 표현과 상호되어야하지만,이 조직 특이성의 신진 대사 프로 파일링 또한, 지원 피크 주석이 될 수 있습니다. 따라서 다른 조직과 성장 조건의 조합 프로파일이 두 번째 문제에 대한 도움이 될 수 있습니다. 유전자 정보의 해상도에 관한 세 번째 문제는 시퀀스 데이터의 진행에 따라 달라집니다. 게놈 시퀀스를 완료하지 않고 모델 식물의 경우에는 다른 모델 식물에서 orthologous 유전자를 사용하여 공동 표현 분석에 유용합니다. 아미노산 서열에 대한 상세한 정렬 비교 및​​ phylogenetic 트리 분석은 다른 수종에 모형 유기체를 연결하는 데 지원할 수 있습니다. 이 프로토콜은 모든 신진 대사에 적합합니다. 그것은 잘 강력한 transcriptional C의 대상이 될 특징 중급 및 보조 신진 대사의 분석에 가장 효율적인ontrol 1,5,11,16. 몇 가지 예제, 유황 동화에서 수행되어야 성공한 공동 발현 분석, β-산화, 측쇄 체인 아미노산 저하, 엽록소 분석하고, 라이신 catabolism 3에 대한 유전자, 세포 벽 대사 10,7 및 계단식 14 신호 빛합니다. 통합 유전체학, metabolomics 및 정보학을 통한 유전자 기능의 해설 전사 인자의 biosynthetic 유전자와 직접적인 조절을 위해뿐만 아니라 생리적 과정과 반응을 이해하는 데뿐만 아니라 (예를 들어 그림 3. 14 참조). 모델 식물에서 작물 종에 대한이 접근법을 개발하기 위해 식물 종 전체의 신진 대사 비교는 몇 가지 일반적인 신진 대사의 강력한 접근이다. 동일한 화합물이 다른 식물 종으로 감지하고, 경우 예를 들어, 일부 orthologous 유전자 이러한 식물 수종에서 발견되며, orthologous 유전자를 사용하여 크로스 종 공동 표현식 분석 stron에게 제공할 수 있습니다당신의 예측을위한 g 지원. 이 접근법은 이외에 포플러, medicago, Arabidopsis에서 수행할 수 같은 식물 종의 공동 발현 분석 (6, 플래닛에 의한 보리, 쌀, 밀과 대두 등 중요한 작물 : <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . 드 /</a> ; 9, COP : <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/가</a> ;) 15 예제를 참조하십시오.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 증류수 ULC / MS 마치고 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitrile (ACN) ULC / MS 학년 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> 메탄올 (MeOH) ULC / MS 학년 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> 액체 크로마 토그래피를위한 개미의 산성 (HCOOH) ULC / MS 학년 </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> 표준 화합물 </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> 선형 이온 트랩 (IT) ESI-MS 시스템 FINNIGAN-LTQ </td><td> 써모 Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC 시스템 서베이 </td><td> 써모 Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> C18 분석 칼럼 루나 (2), 2.0 밀리미터 직경 150 밀리미터 길이, 100의 기공크기가 3 mm의 구형 입자 </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur 소프트웨어 </td><td> 써모 Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

결합 지노 믹스, metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석

Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

전체 게놈 시퀀스를 사용할 수있는 등 한방의 돌연변이, 야생 accessions 및 고급 번식 집단 등의 바이오 자원을 풍부하게하는 모델 식물 종의까지 확대 수를 감안할 때, 유전자의 기능적인 해설을 위해 상승 부​​담이 있습니다. 이 프로토콜에서는 결합된 공동 발현 유전자 분석을 이용한 식물 유전자 기능의 주석은, metabolomics 및 정보학은 (그림 1) 제공됩니다. 이 접근법은 metabolomics 통해 목표 화합물의 신분으로 특정 대사 과정에 참여하지 않은 주석이 유전자의 식별 가능성이 허용하는 것으로 알려진 함수의 대상 유전자를 사용하여 이론에 근거한다. 전략은 손쉽게있는 이들 없음에도 불구하고 모두 순방향 및 역방향 유전자 접근 방법에 의해 생성된 인구에서이 정보를 적용하기위한 개진하고 있습니다. 추론으로이 접근법은 또한 신규 또는 특정 SE를 나타내는 미지의 봉우리를 특성화하는 방식으로 사용할 수 있습니다제한된 조직, 식물의 종 또는 현재 식물의 신진 대사를 이해하는 중요한 시험이다 스트레스 치료에서 condary metabolites.

신진 대사를 통해 유전체학, 공동 발현 유전자 분석 및 대상 화합물의 식별의 조합은 유전자 기능 주석을 제공합니다.

결합 지노 믹스, Metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석

전체 게놈 서열을 이용 가능한 모델 식물 종의 수가 계속해서 증가하고 있으며, ...와 같은 바이오 자원이 풍부해짐에 따라...

다음 실험의 전반적인 목표는 대사체 프로파일링과 공발현 분석의 결합 분석을 통한 유전자 주석 처리를 이용하여 새로운 유전자 기능을 발견하고 특성화하는 것입니다. 이는 특정 대사 경로와 식물 종에 초점을 맞춘 실험 설계의 고려를 통해 달성됩니다. 두 번째 단계로, 검출된 화합물의 화학 구조를 기반으로 전체 대사 경로를 구축하기 위한 분석적 접근 방식이 사용됩니다.다음으로, 예측된 경로의 구조를 공발현 분석(co-expression analysis)과 통합하여 후보 유전자를 좁힘으로써 대사의 핵심 유전자로 추정되는 것들을 찾아냅니다. 최종적으로, 유전자의 기능적 식별을 특성화하기 위해 여러 바이오 리소스를 효율적으로 활용하여 최소한의 실험 세트를 수행함으로써 결과를 얻습니다. 우리는 ate라는 공발현 데이터베이스에서 Abosi OID 바이오 시스틱 유전자의 매우 높은 상관관계를 발견했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.우리는 이 전략이 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스의 정보를 활용하고 생물학적 자원을 효율적으로 사용하여 새로운 유전자 기능을 찾는 가장 빠른 방법 중 하나라고 생각했습니다. 추출을 시작하려면 식물 재료를 수확한 후 즉시 액체 질소로 급속 냉동하십시오. 믹서 밀을 사용하여 식물 재료를 동결 분말로 만든 다음, 동결된 식물 재료를 2mL EPR 튜브에 분주하고 튜브에 금속 볼을 넣으십시오.시료 50 mg당 250 µL의 추출 버퍼를 첨가합니다. 추출 버퍼에는 정규화를 위한 내부 표준 물질이 포함되어 있습니다. 그 후, 믹서 밀을 사용하여 냉동 분말을 2분 동안 균질화합니다.25의 빈도로, 샘플을 12, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 원심분리 필터로 옮깁니다. 두 번째 원심분리를 수행한 후, 상층액을 새로운 einor 튜브로 옮깁니다.다음으로, 먼저 컬럼 오븐의 온도가 35 °C인지, 샘플 트레이의 온도가 10 °C인지 확인하여 HPLC를 설정합니다. 질량 분석 조건을 설정하고 진공 상태와 가열 모세관의 상태를 확인합니다. 교정 용액 혼합물을 주입하여 MS 검출기의 질량 과충전 교정을 수행합니다.소프트웨어의 자동 보정 애플리케이션을 사용하십시오. 그 다음 추출물 50 µL를 유리 바이알로 옮깁니다. HPLC의 경우, 서면 절차에 설명된 대로 첫 번째 시료 분석을 수행하기 전에 추출 버퍼를 최소 5회 주입하십시오.질량 분석 도구 설정을 마친 후, 처리할 데이터를 선택하십시오. 서면 프로토콜에 제시된 화합물 분류에 따라 검출된 관심 피크 표를 작성하십시오. 표준 화합물과의 공용리(co-evolution)를 통해 피크를 식별하고, 이 단계에서 Ms.MS 분석, 문헌, 서베이 및 대사체 데이터베이스 검색을 이용하여 검출된 피크에 주석을 다십시오.경로 예측은 대사 경로 내의 효소 기능을 연결함으로써 화학 구조를 기반으로 이루어져야 합니다. 따라서 이러한 단계들은 검출된 화합물의 정밀한 피크 지정(peak attribution)을 통해 수행되어야 합니다. KEGG 데이터베이스 및 Plant metabolomics와 같은 일반 대사 경로 데이터베이스는 관심 있는 대사 경로를 예측하는 데 매우 효과적입니다.Arabidopsis 오솔로그(ortholog) 유전자가 포함된 유전자 목록을 준비하려면, 먼저 게놈 데이터베이스에서 유전자 ID 목록을 다운로드하십시오. 대상 식물이 Arabidopsis가 아닌 경우에는 오솔로그 유전자의 Arabidopsis 유전자 ID를 추가하십시오. 그런 다음 관심 경로에 있는 유전자 목록을 준비하십시오.Arabidopsis 경로 데이터 및 유전자 가족 데이터의 어노테이션은 TAAR 웹사이트에서 확인할 수 있습니다. 이후 Arabidopsis 오솔로그 유전자 목록을 결합할 수 있습니다. 준비된 유전자 ID 목록을 사용하여 예측 경로에 가장 적합한 데이터베이스를 검색함으로써 공발현 네트워크 분석을 수행하십시오.관심 경로 내의 잘 알려진 유전자 쌍의 상관관계를 확인합니다. 공동 발현 데이터베이스나 유전자 발현 데이터베이스를 사용할 수 없는 경우, 관심 식물의 경우 Arabidopsis 공동 발현 데이터베이스를 Arabidopsis 상동 유전자 목록과 함께 사용해야 합니다.다음으로, 대상 공발현 네트워크의 프레임워크를 구축합니다. 관심 경로 내의 잘 알려진 유전자 간의 연결을 기반으로 합니다. 상관관계가 있는 후보 유전자를 추가하고, 최적의 후보를 찾기 위해 예측된 패밀리 내의 유전자 주석을 확인하여 이 네트워크의 연결성에 반영합니다.유전자 계수 값의 임계값은 네트워크 구조와 상관관계가 있는 유전자의 밀도에 따라 조정되어야 합니다. 이제 표적 경로에 특이적인 것으로 좁힐 수 있는 유전자 목록을 작성하십시오. 이 목록을 사용하여 후보 유전자의 기관 특이성 및 스트레스 반응에 대한 유전자 발현을 확인하십시오.공발현 분석의 쿼리로 사용된 특성이 잘 알려진 유전자들을 예측된 대사 경로에 추가하여 정보 통합을 시작하십시오. 문헌 조사를 수행하여 특성이 밝혀지지 않은 효소 단계, 수송 단백질 및 전사 인자를 포함한 이 경로의 미분석 부분들이 새로운 것인지 확인하십시오. 이 시점에서, 이러한 누락된 미분석 단계에 가장 적합한 유전자 주석을 예측하십시오.대사체 프로파일링 결과와 예측된 경로를 기반으로 한 silico 유전자 발현 후보 유전자들을 결합합니다. 그 다음, 유전자 기능에 따라 후보 유전자들을 예측된 경로 상에 배치합니다. 예를 들어, 아세틸화된 대사체에는 아세틸 전이효소를, 배당체에는 당 전이효소를, 산화 화합물에는 P450을 배치합니다.대사체 축적과 후보 유전자의 유전자 발현 수준 사이의 조직 특이성 또는 스트레스 반응의 일관성을 확인하십시오. 또한, 기질 제공 및 스트레스 반응 유전자와 관련된 다른 대사 경로와의 연결성을 확인하십시오. 마지막 단계로, 녹아웃 돌연변이 라이브러리 및 전체 길이 cDNA 라이브러리와 같은 바이오 리소스를 사용하여 유전자 기능을 규명하기 위한 실험을 수행하십시오.다음은 안토시아닌 경로의 공동 조절 네트워크 분석 예시입니다. PX 프로그램에서 빨간색 노드로 표시된 버전 3의 추가 데이터셋 기반 PRAM 공동 발현 지수를 사용하여 공동 발현 분석을 수행하였으며, 후보 유전자 탐색을 위해 12개의 안토시아닌 효소 유전자와 안토시아닌 생산을 위한 2개의 전사 인자가 사용되었습니다. PRAM 데이터베이스의 세트 검색 상호 연결을 통해 68개의 상관 관계 후보 유전자와 14개의 쿼리 유전자가 포함된 공동 발현 네트워크를 재구성하였으며, 그 결과로 생성된 T net 출력 파일을 PX 소프트웨어를 사용하여 시각화하였습니다.파란색 노드는 발달 후 안토시아닌 유전자와 상관관계를 보인 후보 유전자들을 나타냅니다. 이 전략은 식물 대사 과정에서 새로운 유전자 기능을 예측하는 데 유용한 단서를 제공할 것입니다.

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 즉 떼루아 개념에 대한 통찰력을 얻기 위해 포도 베리 성적 증명서 및 대사에 타겟이 불분명 한 대사 체학, transcriptomics 및 다변량 통계 분석의 응용 프로그램을 설명 베리 품질 특성에 대한 환경의 영향.

포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

이 문서에서는 식별 및 Levadura에 애기 Tóxicos (ATL) E3 유비퀴틴 ligases 제품군에 적용 하는 소문에 유전자 가족의 특성에 대 한 절차를 설명 합니다.

게놈 넓은 식별 및 소문의 ATL E3 유비퀴틴 리가 유전자 가족의 식 메타 분석을 위한 포괄적인 워크플로

다중 생체 분자의 시스템 전반의 분석은 생물학적 과정에 대한 기능적 및 기계적 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 따라서, 광범위한 프로토콜은 동기화된 클라미도모나스 배양으로부터 수확된 단일 샘플로부터 지질, 대사산물, 단백질 및 전분의 높은 처리량 추출에 대해 설명된다.

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법

질량 분광법 유도 게놈 마이닝 프로토콜이 확립되고 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 게놈 순서 정보 및 LC-MS/MS 분석을 기반으로 하고 복잡한 미생물 및 식물 추출물에서 분자의 식별을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

새로운 천연 제품을 발견하는 도구로 질량 분광법 유도 게놈 채굴

경로 협회 연구 도구 (과거)를 실행 하 여, 빛나는 응용 프로그램을 통해 또는 R 콘솔을 통해, 연구원은 그들의 게놈 전체 협회 연구의 생물학적 의미의 깊은 이해를 얻을 수 있습니다 (GWAS) 관련 된 신진 대사 경로 조사 하 여 결과.

신진 대사 경로 정보의 GWAS 분석을 위한 통로 협회 연구 도구

이 프로토콜에서는 많은 샘플의 효율적이고 빠른 샘플 준비를 결합한 최적화된 워크플로를 제시합니다. 또한, 대사 GWAS 연구의 고처리량 평가를 위한 분석 변형을 줄이기 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석법과 결합된 13C 6-Glucose 라벨링의 개발된 방법은 다재다능하며 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 장기 및 경로에 대한 향후 연구와 이러한 2차 대사 산물의 포괄적인 활용을 위한 토대를 마련합니다.

13명LC-MS와 관련된 C6-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

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유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

노크를 다운 유전자 표현의에 대한 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS) 메서드에 대한...

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

학습하세요 대사체 프로파일링과 공동발현 분석을 결합하여 식물 유전자 기능을 주석하는 방법을. HPLC와 바이오정보학을 활용해 후보 유전자를 식별하고 대사 경로를 특성화합니다.

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