결합 지노 믹스, Metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석

다음 실험의 전반적인 목표는 대사체 프로파일링과 공발현 분석의 결합 분석을 통한 유전자 주석 처리를 이용하여 새로운 유전자 기능을 발견하고 특성화하는 것입니다. 이는 특정 대사 경로와 식물 종에 초점을 맞춘 실험 설계의 고려를 통해 달성됩니다. 두 번째 단계로, 검출된 화합물의 화학 구조를 기반으로 전체 대사 경로를 구축하기 위한 분석적 접근 방식이 사용됩니다.

다음으로, 예측된 경로의 구조를 공발현 분석(co-expression analysis)과 통합하여 후보 유전자를 좁힘으로써 대사의 핵심 유전자로 추정되는 것들을 찾아냅니다. 최종적으로, 유전자의 기능적 식별을 특성화하기 위해 여러 바이오 리소스를 효율적으로 활용하여 최소한의 실험 세트를 수행함으로써 결과를 얻습니다. 우리는 ate라는 공발현 데이터베이스에서 Abosi OID 바이오 시스틱 유전자의 매우 높은 상관관계를 발견했을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다.

우리는 이 전략이 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스의 정보를 활용하고 생물학적 자원을 효율적으로 사용하여 새로운 유전자 기능을 찾는 가장 빠른 방법 중 하나라고 생각했습니다. 추출을 시작하려면 식물 재료를 수확한 후 즉시 액체 질소로 급속 냉동하십시오. 믹서 밀을 사용하여 식물 재료를 동결 분말로 만든 다음, 동결된 식물 재료를 2mL EPR 튜브에 분주하고 튜브에 금속 볼을 넣으십시오.

시료 50 mg당 250 µL의 추출 버퍼를 첨가합니다. 추출 버퍼에는 정규화를 위한 내부 표준 물질이 포함되어 있습니다. 그 후, 믹서 밀을 사용하여 냉동 분말을 2분 동안 균질화합니다.

25의 빈도로, 샘플을 12, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 원심분리 필터로 옮깁니다. 두 번째 원심분리를 수행한 후, 상층액을 새로운 einor 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 먼저 컬럼 오븐의 온도가 35 °C인지, 샘플 트레이의 온도가 10 °C인지 확인하여 HPLC를 설정합니다. 질량 분석 조건을 설정하고 진공 상태와 가열 모세관의 상태를 확인합니다. 교정 용액 혼합물을 주입하여 MS 검출기의 질량 과충전 교정을 수행합니다.

소프트웨어의 자동 보정 애플리케이션을 사용하십시오. 그 다음 추출물 50 µL를 유리 바이알로 옮깁니다. HPLC의 경우, 서면 절차에 설명된 대로 첫 번째 시료 분석을 수행하기 전에 추출 버퍼를 최소 5회 주입하십시오.

질량 분석 도구 설정을 마친 후, 처리할 데이터를 선택하십시오. 서면 프로토콜에 제시된 화합물 분류에 따라 검출된 관심 피크 표를 작성하십시오. 표준 화합물과의 공용리(co-evolution)를 통해 피크를 식별하고, 이 단계에서 Ms.MS 분석, 문헌, 서베이 및 대사체 데이터베이스 검색을 이용하여 검출된 피크에 주석을 다십시오.

경로 예측은 대사 경로 내의 효소 기능을 연결함으로써 화학 구조를 기반으로 이루어져야 합니다. 따라서 이러한 단계들은 검출된 화합물의 정밀한 피크 지정(peak attribution)을 통해 수행되어야 합니다. KEGG 데이터베이스 및 Plant metabolomics와 같은 일반 대사 경로 데이터베이스는 관심 있는 대사 경로를 예측하는 데 매우 효과적입니다.

Arabidopsis 오솔로그(ortholog) 유전자가 포함된 유전자 목록을 준비하려면, 먼저 게놈 데이터베이스에서 유전자 ID 목록을 다운로드하십시오. 대상 식물이 Arabidopsis가 아닌 경우에는 오솔로그 유전자의 Arabidopsis 유전자 ID를 추가하십시오. 그런 다음 관심 경로에 있는 유전자 목록을 준비하십시오.

Arabidopsis 경로 데이터 및 유전자 가족 데이터의 어노테이션은 TAAR 웹사이트에서 확인할 수 있습니다. 이후 Arabidopsis 오솔로그 유전자 목록을 결합할 수 있습니다. 준비된 유전자 ID 목록을 사용하여 예측 경로에 가장 적합한 데이터베이스를 검색함으로써 공발현 네트워크 분석을 수행하십시오.

관심 경로 내의 잘 알려진 유전자 쌍의 상관관계를 확인합니다. 공동 발현 데이터베이스나 유전자 발현 데이터베이스를 사용할 수 없는 경우, 관심 식물의 경우 Arabidopsis 공동 발현 데이터베이스를 Arabidopsis 상동 유전자 목록과 함께 사용해야 합니다.

다음으로, 대상 공발현 네트워크의 프레임워크를 구축합니다. 관심 경로 내의 잘 알려진 유전자 간의 연결을 기반으로 합니다. 상관관계가 있는 후보 유전자를 추가하고, 최적의 후보를 찾기 위해 예측된 패밀리 내의 유전자 주석을 확인하여 이 네트워크의 연결성에 반영합니다.

유전자 계수 값의 임계값은 네트워크 구조와 상관관계가 있는 유전자의 밀도에 따라 조정되어야 합니다. 이제 표적 경로에 특이적인 것으로 좁힐 수 있는 유전자 목록을 작성하십시오. 이 목록을 사용하여 후보 유전자의 기관 특이성 및 스트레스 반응에 대한 유전자 발현을 확인하십시오.

공발현 분석의 쿼리로 사용된 특성이 잘 알려진 유전자들을 예측된 대사 경로에 추가하여 정보 통합을 시작하십시오. 문헌 조사를 수행하여 특성이 밝혀지지 않은 효소 단계, 수송 단백질 및 전사 인자를 포함한 이 경로의 미분석 부분들이 새로운 것인지 확인하십시오. 이 시점에서, 이러한 누락된 미분석 단계에 가장 적합한 유전자 주석을 예측하십시오.

대사체 프로파일링 결과와 예측된 경로를 기반으로 한 silico 유전자 발현 후보 유전자들을 결합합니다. 그 다음, 유전자 기능에 따라 후보 유전자들을 예측된 경로 상에 배치합니다. 예를 들어, 아세틸화된 대사체에는 아세틸 전이효소를, 배당체에는 당 전이효소를, 산화 화합물에는 P450을 배치합니다.

대사체 축적과 후보 유전자의 유전자 발현 수준 사이의 조직 특이성 또는 스트레스 반응의 일관성을 확인하십시오. 또한, 기질 제공 및 스트레스 반응 유전자와 관련된 다른 대사 경로와의 연결성을 확인하십시오. 마지막 단계로, 녹아웃 돌연변이 라이브러리 및 전체 길이 cDNA 라이브러리와 같은 바이오 리소스를 사용하여 유전자 기능을 규명하기 위한 실험을 수행하십시오.

다음은 안토시아닌 경로의 공동 조절 네트워크 분석 예시입니다. PX 프로그램에서 빨간색 노드로 표시된 버전 3의 추가 데이터셋 기반 PRAM 공동 발현 지수를 사용하여 공동 발현 분석을 수행하였으며, 후보 유전자 탐색을 위해 12개의 안토시아닌 효소 유전자와 안토시아닌 생산을 위한 2개의 전사 인자가 사용되었습니다. PRAM 데이터베이스의 세트 검색 상호 연결을 통해 68개의 상관 관계 후보 유전자와 14개의 쿼리 유전자가 포함된 공동 발현 네트워크를 재구성하였으며, 그 결과로 생성된 T net 출력 파일을 PX 소프트웨어를 사용하여 시각화하였습니다.

파란색 노드는 발달 후 안토시아닌 유전자와 상관관계를 보인 후보 유전자들을 나타냅니다. 이 전략은 식물 대사 과정에서 새로운 유전자 기능을 예측하는 데 유용한 단서를 제공할 것입니다.