포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

이 절차의 목적은 세포주기의 여러 단계에서 세포의 비율을 결정할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 먼저 세포 증식 라벨링 시약 BRDU를 생존 가능한 세포 배양액에 첨가하여 새로 합성된 DNA 다음 염색에 통합하고, 시약을 통합한 세포의 BRDU를 결합한 다음 DNA를 프로피듐 요오드화물로 염색함으로써 수행됩니다. 마지막 단계는 유세포 분석을 통해 세포 주기의 여러 단계에서 세포의 비율을 평가하는 것입니다.

궁극적으로 실험 세포 집단의 세포주기 분포는 BRDU 표지 세포의 유세포 분석을 통해 시각화할 수 있습니다. tri to thyme incorporation 및 scintillation counting과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 BRD 라벨링을 통해 각 세포 주기 단계에서 세포의 비율을 결정할 수 있다는 것입니다. 조정해야 하는 다양한 매개변수의 이미지를 동반하지 않고는 동료 세포 분석 세트를 설명하기 어렵기 때문에 이 메시지를 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 두 대학원생인 Matt Chii와 Miri입니다. BRDU를 실험용 세포 배양에 1-1000 희석으로 첨가하고, 1시간 동안 배양하여 세포를 수확하고, 배양 배지를 흡인하고, PBS로 세포를 두 번 철저히 세척하여 배지의 모든 흔적을 제거합니다. 이번에는 3밀리몰 EDTA가 보충된 PBS를 사용하여 배양액을 한 번 더 빠르게 헹구고 P-B-S-E-D-T-A 용액을 철저히 흡인하여 세포를 분리합니다.

각 6cm 배양 접시에 약 0.5ml의 P-B-S-E-D-T-A를 넣고 섭씨 22도에서 약 5분 동안 접시를 배양합니다. 그런 다음 각 플레이트의 세포 배양물을 개별 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 지금 실온에 5 분 동안 500배 중력에 세포를 분리기를 설치하고 그 후에 supinate를 제거하고, 그 후에 PBS의 100개 마이크로리터에 있는 세포를 refuse

마지막으로, 95% 에탄올 5ml를 적방울로 첨가하여 세포를 고정하는 동시에 실온에서 5분 동안 중력의 500배로 세포를 와류로 원심융합합니다. 다시 한 번, 에탄올을 제거하고 0.5% Triton X 100을 함유하는 2개의 일반 HCL 1ml에 펠릿을 볼텍싱하면서 용액을 적하 방식으로 세포에 첨가한 다음 실온에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 펠릿화한 후 S 상등액을 다시 흡인하고 이 단계에서 세포가 매우 느슨한 펠릿을 형성하므로 특별한 주의를 기울입니다.

그런 다음 펠릿을 0.1 몰 사분나트륨 보어 속도 1 밀리리터에 부드럽게 현탁시키고 세포를 다시 배양합니다. 이제 세포를 한 번 더 펠릿화하고 이번에는 세포를 다시 펠릿화한 후 1에서 50으로 희석한 마우스 항 BRDU 항체를 포함하는 항체 용액 0.5ml에 배양합니다. 이 펠릿을 rabbit anti-US ZI 접합 2차 항체를 포함하는 50마이크로리터의 항체 용액에 현탁하고 1을 25로 희석합니다.

그런 다음 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양합니다. 최종 시간의 세포를 원심 분리 한 후, 0.5 밀리리터의 프로피듐 요오드화물과 RNA 용액을 섭씨 37도의 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다. 마지막으로, 분해된 세포 용액을 세포 스트레이너에 통과시켜 응집체를 제거합니다.

그런 다음 그림과 같이 비동기식으로 증식하는 세포 집단을 위해 유세포 분석기에서 샘플을 흡수할 수 있도록 단일 세포를 적절한 튜브로 이동합니다. 이 예에서는 doublet discriminating plot에서 가장 풍부한 두 피크 주위에 게이트를 배치하여 모든 후속 분석을 위한 단일 세포 이벤트를 선택합니다. 그런 다음 비동기식으로 증식하는 배양 샘플을 분석하여 염색 및 유세포 분석기 매개변수 설정에 대한 양성 대조군 역할을 합니다.

프로피듐 요오드화물 염색을 위한 광전자 증배관의 감도를 조정하여 단일 세포에서 2개의 N 및 4개의 N 피크가 x축에서 200 및 400의 임의의 단위에 중심을 두도록 합니다. 다음으로, FXI 음성 셀이 배경 수준보다 높도록 FXI 감지 광 증배관의 감도를 조정합니다. BRDU 양성 셀은 약 10배 더 밝아야 하며 x축은 로그 스케일로 표시되어야 합니다.

유세포 분석기에 의해 포착 된 단일 이벤트는 왼쪽 하단의 G 한 단계에서 S 상까지 말굽 모양의 호를 형성 한 다음 G 2 M 상에 대해 오른쪽 하단으로 다시 내려갑니다. 이 대표적인 숫자에서 보이는 것과 같이, 5개의, 000개에서 10, 000의 단세포 사건을 DNA 내용의 원한 범위를 달성하기 위하여 모으십시오. 프로피듐 요오드화물 및 BRDU 함량을 측정한 후, G 1의 경우 200, G 2 M의 경우 400을 중심으로 하는 두 개의 BRDU 음성 모집단 주위의 게이트를 사용하여 세포를 G 1 s 또는 G 2 MPH 위상에 할당합니다. 각 게이트의 세포 비율은 이전 산점도 그림에 대한 이 막대 그래프에서 설명한 것처럼 G, 1, s 및 G, 2 M 상의 상대적인 세포 수를 나타냅니다.

이 예에서 관심 세포 마커를 염색한 후 CD 20은 섭씨 22도에서 10분 동안 500배 중력으로 세포를 원심분리한 다음 1% BSA가 보충된 5ml의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 5분 동안 중력의 500배에서 세포를 다시 펠릿화한 후 0.5ml의 프로피듐 요오드화물과 RNA 용액을 사용하여 세포를 재수화합니다. 그런 다음 지금 그림과 같이 세포를 염색하고 소화하여 2개의 n 및 4개의 말단 단일 세포 피크를 게이트한 다음 염색되지 않은 세포가 배경 수준보다 높도록 FXI 검출을 위해 광전자 증배관의 감도를 조정합니다.

이상적으로, CD 20 FXI 양성 세포는 배경보다 10배에서 100배 더 강하게 염색됩니다. 다시 말하지만, x축은 로그 스케일 스케일로 표시되어야 합니다. 마지막으로, 배경 수준보다 10배 더 밝고 200에서 400 사이의 프로피듐 요오드화물 염색이 있는 CD 20 양성 세포를 선택하여 이 샘플 그림과 같이 프로피듐 요오드화물 대 세포 수 히스토그램에 표시하고, 각 샘플에 대해 최소 1000 CD 20 양성 이벤트를 수집하여 이 그림의 변동성을 제한합니다.

프로피듐 요오드화물 및 BRDU 염색 세포의 3차원 유세포 분석이 표시됩니다. 2개의 n과 4개의 NDNA 콘텐츠가 있는 셀은 X 축 척도의 200 및 400 마크의 중앙에 있습니다. 프로피듐 요오드화물 염색 강도의 경우 BRDU 염색 강도는 로그 척도로 측정됩니다.

Y축에서는 세포 주기의 G 1 s 및 G 2 M 단계에서 세포를 정량화하는 데 사용되는 게이트의 위치를 확인합니다. 이전 그림의 G, 1, s 및 G, 2, M 게이트 각각에 있는 셀의 상대적 비율이 여기에 나와 있습니다. 여기서, 프로피듐, 요오드화물 및 CD 20.

의 혼합물로부터 염색하고, 그 중 일부는 이소성으로 발현된 CD 20 및 PRB를 나타냅니다. 2개의 n과 4개의 NDNA가 있는 셀, 가장 풍부한 모집단은 x축의 200 및 400 마크에 중심을 둡니다. CD 20 양성 보행의 위치는 배경보다 10배 이상 밝게 염색된 세포를 선택합니다.

이 히스토그램은 이전 산점도에서 비동기적으로 증식하는 이전 산점도의 CD 20 음성 세포에 대한 세포 수와 프로피듐 요오드화물 염색을 비교한 것으로, p rrb 발현으로 정지하도록 유도되고 주로 두 개의 NDNA 함량을 가진 세포를 포함하는 이전 CD 20 산점도의 양성 세포 20개를 나타냅니다. 이러한 데이터는 정지된 하위 집단이 이 염색 기술을 사용하여 배양액의 다른 세포와 구별될 수 있음을 보여줍니다. 다음 세 그림에서는 마우스 배아 섬유아세포에서 Cyclin-dependent kinase inhibitor P 27 KIP one의 레트로바이러스 발현에 대한 유세포 분석 데이터가 여기에 나와 있습니다.

Propidium iodide, BRDU 분석은 여기에 표시된 바와 같이 빈 P babe 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 비동기적으로 증식하는 세포 집단에서 세포주기 단계를 측정하는 데 사용되었습니다. P 27에 대한 반응으로 S상 게이트에서 BRDU 양성 반응이 거의 나타나지 않았습니다. 또한 G 1 및 G 2 M 게이트에서 이벤트의 강도가 더 크다는 점에 유의하십시오.

마찬가지로, P27 발현 세포에 대한 S-상의 세포 비율은 이 그림에 도표된 바와 같이 매우 낮습니다. 이러한 유형의 분석은 유전자 표적 마우스의 다양한 균주에서 유래한 세포의 세포주기 조절 결핍을 특성화하는 데 매우 효과적이었습니다. 다음 두 그림에서, 형성되지 않은 기억 상피 세포는 24 시간 동안 성장 억제 cytokine TGF beta one으로 처리되었습니다.

이 첫 번째 그림에서 볼 수 있듯이 S상 세포의 BRDU 라벨링은 TGF 베타 1 신호전달에 의해 크게 감소합니다. 세포가 주로 G에 축적되어 있는 것을 주목하라: 중간 패널에서 볼 수 있듯이 세포주기의 한 단계. 세포주기의 여러 단계를 정량화하면 TGF 베타 1이 주로 세포주기의 G 한 단계에서 증식을 억제하여 이 단계에서 축적을 유도한다는 것을 확인할 수 있습니다.

이 마지막 일련의 실험 분석에서는 PRB가 결핍된 SAS 2개의 세포를 CMV CD 20 발현 벡터와 CMV RB 또는 CMV beta GAL을 대조군으로 하여 transfection했습니다. 이 첫 번째 그림은 PRB 발현 72시간 후 분포와 비교하여 negative control transfection된 세포의 세포주기 분포를 보여줍니다. 참고로, 다중 사이클 소프트웨어에 의한 이 최종 그림 곡선 피팅에서 오른쪽 패널에 거의 배타적으로 존재하는 것은 세포가 PRB 발현 후 G 1기에 주로 축적되었음을 보여주었습니다.

s 및 G 두 M 기의 개체군은 상대적으로 고갈되었습니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 mph 단위의 인산화산 히스톤과 같은 다른 세포주기 마커를 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 집단의 세포주기 분포를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

두 가지 일반 염산은 가성과 프로피듐이라는 것을 잊지 마십시오. 요오드는 잠재적인 발암 물질입니다. 그들은 위험할 수 있습니다.

이러한 화학 물질을 사용하는 동안 항상 예방 조치를 취해야 합니다.