Name: 포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 배우세요 포유 동물 세포의 세포주기 위치를 유동세포측정법으로 분석하는 방법을. BRDU와 프로피듐 요오드화물을 사용하여 G1, S, G2/M 단계를 정량화하고 세포 증식 동역학을 연구할 수 있습니다.

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저자는 보건 연구 (CIHR)와 자신의 실험실에서 세포주기의 연구 자금에 대한 캐나다 암 협회의 캐나다 연구소 감사하고 싶습니다. MJC은 CIHR에서 MD / 박사 교제를받는 것입니다. MJC와 석사는 CaRTT 훈련 프로그램의 회원입니다.

1. 라벨링 및 세포의 고정 <ol><li> 세포 증식의 라벨링 시약 (BrdU) 당 ML 세포 배양 매체 (1-1000 희석) 일시간 수확하기 전에 1 μL를 추가합니다. 라벨 기간은 느리게 성장하는 세포를 위해 길어해야 할 수 있습니다. </li><li> 수확 세포하려면, 기음 문화 매체와 인산염과 함께 철저하게 세척은 식염수 (PBS)를 버퍼. 철저히 매체의 흔적을 제거하는 반복합니다. </li><li> 신속 PBS가 3mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함과 함께 세 번째로 문화를 씻고 완전히 기음. </li><li> 각각의 접시에 3mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 PBS의 작은 볼륨을 추가 6cm 요리에 대한 0.5 ML이 이상적입니다. ° C 세포를 분리하기 위해 약 5 분 동안 22 알을 품다. 15 ML 원뿔 튜브로 전송합니다. </li><li> 펠렛 5 분 500 XG에 원심 분리기 세포는 표면에 뜨는 제거하고 PBS 100 μL에 철저 resuspend. </li><li> vortexing 동안 95 % EtOH, dropwise 5 ML을 추가하여 세포를 수정. 이 단계에서 전지 최소한 4 ° C에 저장할 수 있습니다달. </li></ol> 2. Denaturing과 BrdU와 DNA의 염색법 <ol><li> 펠렛 전지 5 분 500 XG에 세포를 원심 분리기와 95 % EtOH를 제거합니다. vortexing하는 동안 드롭 현명한 방식으로 추가하여 2N HCL 1 ML 및 0.5 % TX - 100에 Resuspend. 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> 섹션 2.1로 이전 원심 분리기와 세포가이 단계에서 매우 느슨한 펠렛을 형성 때문에 신중하게 뜨는 기음. 부드럽게 0.1M 잡을 4 O 7 (산도 8.5) 1 ML에 resuspend하고 실온에서 적어도 30 분 동안 incubated. </li><li> 위의 섹션 2.1 마우스 방지 BrdU 항체와 항체 솔루션의 0.5 ML (PBS가 1% BSA 및 0.2 % 십대 초반 - 2​​0을 포함)에 resuspend로 펠렛 전지 50에 1을 희석. 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> 펠렛 세포가 다시와 FITC에 복합 토끼 안티 - 마우스 차 항체를 포함하는 항체 솔루션의 50 ML에 resuspend 25-1을 희석. 30 분 동안 품어benchtop 가벼운으로부터 보호합니다. </li><li> 원심 분리기 세포는 최종 시간과 resuspend propidium의 요오드화물 및 RNase 용액 (1 % BSA와 PI - RNAse 솔루션, PBS, 10 MG / ML propidium의 요오드화물, 0.25 MG / ML RNase A) 0.5 ML에서 37 어둠 속에 품어 ° 30 분 C. 또는 RNA는 4에서 잠을 자면 소화 수 있습니다 ° C는 어둠 속이라서. </li><li> 집계를 제거하고 흐름 cytometer에 샘플 이해에 대한 적절한 튜브 단일 세포를 수집하는 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 전달합니다. 다시, 샘플은 빛에 직접 노출로부터 보호되어야합니다. </li></ol> 3. 유동세포계측법에 의해 분석 <ol><li> 세포는 propidium 요오드화물의 및 FITC에 맞는 검색 기능이있는 doublets (하나의 흐름 셀을 통과 두 개는)에 대한 차별이 가능합니다 표준 흐름 cytometer로 분석해야합니다. 단일 세포는 앞으로 뿌리와 사이드 분산형 팝업을 기반으로 이벤트를 게이팅하여이 유동세포계측법 응용 프로그램에서 감지할 수 있습니다ulations 및 propidium 요오드화물에 의한 DNA의 얼룩의 속성을 사용하여. 이중어 차별 도트 음모의 모양은 흐름 cytometers 및 propidium 요오드화물 얼룩 속성에 의존 사이의 차이, 분석의 이중어의 discriminator 설정에 대한 조언 해당 지역 유동세포계측법 시설을 참조하십시오. 일반적으로 세포의 비동기 proliferating 인구에서 하나의 세포는 일반적으로 이중어 차별 음모 두 가장 풍부한 봉우리 (2N와 4N DNA)이며 게이트는 주위 그려져 있어야합니다. 이것은 아래와 이후의 모든 분석에 사용되는 단일 셀 이벤트를 선택합니다. </li><li> 분석하는 첫 번째 예제는 얼룩과 흐름 cytometer 설정에 대한 긍정적인 제어 역할을 비동기적으로 proliferating 문화하여야한다. 일중 세포에서 2N와 4N 봉우리가 X 축 200 400 (임의 단위)에 중심되는 등 propidium 요오드화물의 얼룩에 대한 photomultiplier 튜브의 감도를 조정합니다. 우리는 종종 풍부한 s를 얼룩흐름 cytometer의 모든 매개 변수가이 샘플을 사용하지 않고 적절하게 조정되었는지 확인하려면 다음과 세포 upply. 새로운 사용자가 흐름 cytometer의 운영보다 친숙해질 수 있도록이 긍정적인 제어도 도움이됩니다. </li><li> G1 및 G2 / M 인구가 배경 이상의 것을 같은 FITC 검출을위한 photomultiplier 관의 감도를 조정합니다. BrdU 양성 세포는 약 10 배 더 밝아 및 Y 축이 로그 스케일로 표시되어야한다. 그것은 분명 긍정적으로 스테인드 세포를 구분하는 BrdU의 얼룩에 대한 부정적인 컨트롤 (단계 위의 2.3가 아닌 특정 IgG와 안티 BrdU 항체를 대체하여)를 포함 때로는 도움이됩니다. </li><li> 아래에서 G1의 흐름 cytometer 양식 마제형 아크에 의해 캡처된 단일 이벤트가 S - 단계까지 왼쪽 아래 G2 / M. 위해 오른쪽 하단에 그러한 propidium 요오드화물의와 FITC 사이의 보상을 조정 깊이 그 안에 더에 대해 다음 참조를 참조하십시오특정 응용 프로그램 2에 도착 유동세포계측법 및 참조의 원리 및 사용 cussion. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> DNA 내용의 원하는 범위 10 000 단세포 이벤트 5 000은 문화에 세포의 인구가 완전히 샘플링되었다는 확신을 가지고하기 위해서는 각 샘플에 대해 수집해야합니다. </li><li> 일단 세포들은 G1, S, 또는 G2 / M 단계에 할당해야합니다 propidium 요오드화물 및 BrdU의 콘텐츠에 대한 측정되었습니다. 200 400 (각각 G1 및 G2 / M)에서 중심 두 BrdU 부정적인 인구 주위에 빌 게이츠를 그림으로써이 작업을 수행합니다. 이 상자는 위의 모든 S - 단계 (그림 1A)를 측정 단일 게이트에 포함되어야합니다. 각 게이트에있는 세포의 비율은 G1, S, 및 G2 / M (그림의 1B)에 세포의 상대적인 수를 나타냅니다. </li></ol> 5. 세포의 혼합 인구에서 세포주기의 분석을위한 대체 프로토콜 <ol><li> 이것은 다른 프로토콜입니다가장 도움이되면 세포의 순수한 인구를 선택하는 약물 치료가 허무는 표현 벡터의 transfection은 정기적으로 관심의 유전자 산물을 표현하는 세포의 낮은 비율 결과, 또는. 많은 인구와 오염되고 관심 세포의 비교적 작은 비율이 결과는 세포를 untransduced. 이 경우, 이러한 CD19 4 등 GFP 3 정박 막으로 유동세포계측법, 또는 외국 세포 표면 마커로 transfected 세포를 검출 마커를 표현하는 플라스미드와 함께 유전자 또는 관심 shRNA을 표현하는 공동 transfect의 plasmids CD20 5. </li><li> 이 프로토콜의 목적을 위해 우리가 예제로 CD20 얼룩를 사용하지만, CD19에 대한 얼룩 것은 근본적으로 동일합니다. CD20과 transfection의 경우, BrdU 레이블 필요가 없습니다, 난에있는 세포를 20 μL FITC 복합 백신 CD20 항체를 추가하여 위의 1.5 단계 1.2에서 설명한 및 얼룩과 같은 단순히 수확 세포어둠에 20 분 CE. 와 같은 단계 1.6에서 설명한 세포를 수정. 전지는 다시 4 적어도 한 달 저장할 수 ° 어둠 속에 C. GFP의 검출을 위해,이 단계 및 수정의 항체 얼룩을 생략하고 설명한대로 세포를 저장합니다. </li><li> 5 분 500 XG에서 원심의 pelleting와 PBS가 1 % BSA를 포함하는 5 ML에 resuspending로 다시 수화물 전지. </li><li> 절 2.5에서 위에서 설명한 propidium 요오드화물 및 RNase 솔루션의 0.5 ML 5 분 resuspend 세포 500 XG에 다시 펠렛은 세포. </li><li> 3.1 및 3.2에서 2.6 및 분석 지침 세포 준비 지침을 따라 계속합니다. </li><li> 흠없는 세포 배경 위의 것을 그러한 FITC 검출을위한 photomultiplier 관의 감도를 조정합니다. 이상적으로, CD20 - FITC 긍정적인 세포가 배경보다 100X 더 강렬한 스테인드에 10X되며이 음모를 Y 축은 로그 스케일 (그림 2A)로 표시되어야합니다. backg보다 10X 밝은 아르 CD20 양성 세포그림과 같이 원형은 (200 400 사이의 propidium 요오드화물 얼룩 포함) 히스토그램 propidium 요오드화물 비해 셀 계산에 표시를 선택합니다. 2C. 쉽게 CD20 양성 컷 - 오프가 10X 배경으로 설정해야합니다 (100X 배경 위에 ie. 10X) 밝게 스테인드되는 표식을 표현하는 세포 라인에. 관심의 유전자도 약하게 이러한 세포로 표현되기 때문에 약한 얼룩 세포의 포함은 아마도이 실험의 다양성을 증가시킵니다. 단 약하게 스테인드 CD20 반응을 (10X 배경 미만 ie.), 항복 세포 라인을위한 컷 오프의 결정은 CD20 스테인드, untransfected 세포로 구성된 부정적인 컨트롤을 사용하여야한다. </li><li> 적어도 1,000 CD20 양성 행사는 각 샘플에 대해 수집해야합니다. 1000 이벤트 적은 그게 실험은 높은 다양성을 생산합니다. 이러한 ModFit LT (진실성 소프트웨어), 멀티 사이클 AV (피닉스 흐름 시스템) 및 흐름 조 (트리 스타)와 같은 소프트웨어 패키지는 수학 견적 사용이러한 그림에 표시된 것과 histograms에서 곡선의 모양에 기여 G1, S, 및 G2 / M 인구. 2B와 C. </li></ol> 6. 대표 결과 : 우리는 우리의 접근 방식을 사용하여 실험 세포주기 분석의 세 가지 예제를 제공합니다. 첫 번째는 마우스 배아 섬유아 세포에서 cyclin 의존 키나제 억제제의 p27KIP1의 retroviral 표현을 사용합니다. 바이러스 감염에 대한 약물 선택이 완료되었습니다 24 시간 후 세포 맥박은 한 시간 BrdU으로 표시되었습니다. 본 실험에서는 억제제 이소성 표현은 세포 (그림 3A와 B)의 확산을 체포하는 데 사용됩니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3B 작은 BrdU 긍정적인 이벤트가 p27에 대한 응답으로 S - 상 게이트에 분명 있습니다. 그림 diagramed로 마찬가지로, p27 표현 세포에 대한 S - 단계에 세포의 비율은 아주 낮습니다. 3C. 분석의이 유형은 g의 다양한 변종에서 파생된 세포의 세포주기 제어 결함을 특성화에 매우 효과적되었습니다마우스 6, 7, 8, 9, 에너지 타겟. 두 번째 실험에서, untransformed mammary 상피 세포 (MCF10A)는 24 시간 동안 성장 인자 베타 하나를 (TGF - β1) 변화, 성장 억제 시토킨로 치료했다. 전지는 즉시 수확하기 전에 네 시간 동안 BrdU으로 표시되었습니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. S - 상 세포 4 BrdU 라벨이 크게 TGF - β1 신호가 감소되어 우리의 얼룩의 특이성은 또한 IgG 대조군 (그림 4C)으로 검증됩니다. 세포주기의 다른 단계의 부량는 TGF - β1은 주로이 단계에서 축적에 이르는, 세포주기의 G1 단계에서 확산을 억제되었음을 알려 드리기위한 것입니다. 마지막 예제에서는 PRB 결함 미친 - 2 세포는 CMV - CD20 발현 벡터 및 CMV - RB ​​또는 컨트롤과 같은 CMV - β - 걸 중과 transfected 있습니다. transfection 전지 다음 사흘은 수확 스테인드 및 수정되었습니다. 이러한 세포의 유동세포계측법 분석들 그림에 표시됩니다. 5. 이것은 PRB 표현 72 시간 다음과 같은 분포 (그림의 5B)과 비교 대조군 transfected 세포 (그림의 5A)의 세포주기 분포를 보여줍니다. 멀티 사이클 소프트웨어에 의해 커브 피팅 다음, 세포주기 단계의 비율의 직접적인 비교는 그림에 표시됩니다. 5C. 이것은 G1 다음 PRB 표현에서 세포의 축적과 S와 G2 / M 단계에서 세포의 상대적 고갈을 보여줍니다. 우리는 G1의 체포 메커니즘을 광범위하게 9, 10, 11, 12, 13을 알아내기 위해이 분석에 유사 콘텐츠를 사용했습니다. 이 예제는 세포주기 제어가 자극이나 세포 조작의 다양한 대응 측정할 수 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 따라서 문화 형식 실험에서 세포주기의 위치 측정을 필요로 많은 응용 프로그램에 적용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg"> 그림 1. Quantit결합 propidium 요오드화물의 및 BrdU의 얼룩 (PI - BrdU)에 의해 세포주기 단계의 ation. (A)이 패널은 propidium 요오드화물과 BrdU의 스테인드 세포의 입체 유동세포계측법를 표시합니다. 2N와 4N DNA 내용과 함께 세포의 propidium 요오드화물 얼룩 강도에 대한 X - 축 규모에 200 400마르크 이상을 중심으로됩니다. BrdU의 얼룩 강도는 Y 축에서 로그 스케일에서 측정됩니다. 세포주기의 G1, S, 및 G2 / M 단계에서 세포를 quantitate하는 데 사용되는 게이트의 위치를​​ 적어 둡니다. (B)에서 G1, S, 및 G2 / M 게이츠의 각 세포의 상대적인 비율이 그래프에 표시됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg"> 그림 2. propidium 요오드화물과 세포 표면 마커의 CD20을 사용하여 선택한 셀에 셀주기 단계의 Quantitation. (A)이 패널은 propidium 요오드화물과 세포의 혼합물에 대한 CD20 얼룩을 보여줍니다, 어떤 것들의 대부분은 ectopically CD20과 PRB을 표현. 참고로 세포2N와 4N의 DNA (가장 풍부한 인구)은 X 축에있는 200 400마르크 이상의 중심입니다. CD20 + 게이트의 위치는 배경보다 적어도 10X 더 밝게 묻은 게있다 셀을 선택합니다. (B)의 propidium 요오드화물 얼룩 대 셀 카운트의 그래프는 비동기 proliferating 아르 패널에서 CD20 음성 세포에 대해 표시됩니다. (C)와 유사한 그래프 패널에서 CD20 양성 세포에 대한 표시됩니다 PRB 표현과 함께 체포 주로 2N DNA 컨텐츠와 세포를 포함하는 유도되었는지. 이것은 체포 하위 인구이 얼룩 기술을 사용하여이 문화의 다른 세포에서 구분할 수 있습니다 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg"> p27KIP1에 의한 세포 증식의 그림 3. 억제. (A) PI - BrdU 분석은 빈 pBABE retroviral vecto와 transduced되었습니다 세포의 비동기 proliferating 인구의 세포주기의 단계를 측정하는 데 사용됩니다R. (B) 세포의 유사한 분석 pBABE - p27와 transduced. S - 위상 및 G1 및 G2 / M 게이트 사건보다 강도 세포의 부재를 적어 둡니다. 비동기 제어 및 p27 표현 세포 proliferating에서 세포주기의 각 단계에서 세포의 (C) Quantitation. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg"> 그림 4. TGF - β1에 의한 세포 증식의 억제 비동기 MCF10A 세포를 proliferating의 (A) PI - BrdU 분석. 24 시간 동안 TGF - β1의 100 PM 취급 세포 (B) 분석. 주로 세포주기의 G1 단계에서 세포의 축적을 확인합니다. 비동기 proliferating 세포가 아닌 특정 IgG 컨트롤과 함께 안티 BrdU 기본 항체를 교체하여 BrdU의 얼룩의 (C) 확인. (D) 그래픽에서 각각의 세포주기의 단계의 quantitation와 B. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg"> 그림 5. PRB에 의한 세포 증식의 억제. (A) CD20의 propidium 요오드화물 얼룩 및 SS - 여자 transfected 세포 대 세포 카운트가 표시됩니다. 하위 인구 transfected에 대한 부적 절한 관리로 - transfection 부분적으로 untransfected 인구 (CD20 세포)를 렌더링, 세포를 동기화할 수있는이 중요한 컨트롤입니다. Transfected 세포는 다른 analogously transfected 세포와 비교해야합니다. (B) 셀 카운트 대 CD20 및 PRB의 propidium 요오드화물 그래프 세포를 transfected. 2N 피크의 거의 독점적인 존재를합니다. (C) 세포주기의 위상 비율의 그래픽 표현은 멀티 사이클 소프트웨어에서 곡선 피팅 방법을 이용하여 A와 B에서 결정됩니다.

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리의 경험에서이 기술을 성공 몇 가지 주요 컨트롤과 실험 조건에 따라 달라집니다. 하나는이 실험에 사용하기 위해 비동기 proliferating 컨트롤을 구축합니다. 이 컨트롤은 세 중요한 목적을 수행합니다. 첫째, 모든 실험 샘플에 사용되는 문화 조건이 치료의 부재로 지속적인 확산을 지원하기 위해 충분한 것을 보장합니다. 이 예제에서는 또한 존재하는 경우 BrdU 또는 CD20 양성 세포가 발견 될 수 있도록하기 위해 얼룩 방법론에 대한 긍정적인 컨트롤의 용도를 제공합니다. 마지막으로,이 예제는 흐름 cytometer를 보정하는 데 사용됩니다. 이 컨트롤 예제는 각각 200 400 2N와 4N 세포를 감지하는 propidium 요오드화물 얼룩 강도를 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 부정과 긍정적인 신호로 그림 1A와 2A에 표시된 중심되도록 또한, BrdU 또는 CD20의 검출 감도를 조정할 수 있습니다. 모든 샘플은 PI - R의 세포와 비슷한 농도있을 때이후 샘플이 실행되면서 Nase 솔루션은 다음 cytometer에 몇 가지 조정이 필요합니다. 이것은 그림에 표시된 이유로 중요합니다. 강력한 G1 축적은 본질적으로 G2 / M. 것으로 잘못 이해할 수있는 하나의 G1 피크를 생성 4B와 5B 대표 실험은 또한 다른 중요한 포인트를 확인하십시오. 첫째, 그들은 BrdU의 이해와 라벨이 세포 유형 간의 다를 수있다는 것을 보여준다. 이런 이유로 그것은 경험적으로 맥박과 적절하게 S - 단계에서 세포를 감지하는 데 필요한 얼룩 조건의 길​​이를 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 적은 24 시간의 문화에서 더블 휴대 타입은 시간에 BrdU로 표시하실 수 있습니다. 느린 성장 세포 유형 항체 얼룩 조건과 기간에 더 이상 펄스 및 변경을 요구할 수 있습니다. 그들이 네 번 한에 대한 항체의 두 표준 농도로 4 시간 스테인드 위해 BrdU와 라벨이 붙지만 같은 MCF10A 전지는이 점에서 훌륭한 예제입니다. 수사이것이 잘못 S - 상 인구 G2 / M 세포의 포함으로 이어질 수도 매우 느리게 성장하는 세포와 라벨링 BrdU 6 시간을 초과하지 않도록주의하여야한다. 둘째, TGF - β1의 기능과 p27KIP1 표현의 효과를 비교에서, 그것은 TGF - β1 신호는 G1의 체포를 유도하면서 p27은 G1 또는 G2 / M 단계 중 하나의 축적을 일으킬 수 분명하다. 이러한 3 H - Thymidine의 설립 및 섬광 계수로 확산을 감지 전통 수단이 가능성을 구별할 수 없습니다. 우리가 다른 프로토콜에서 우리는 큰 untransfected 인구 세포의 하위 인구의 감지를 보여줍니다. 경험적으로 transfected 세포를 검출을위한 가장 적합한 기자를 결정하는 것이 중요합니다. 우리의 경험의 일부 세포 유형의 표현 세포 표면 중 하나는 제대로 마커, 또는 플라즈마 막 제대로 트래픽을, transfected 세포를 감지하지 못할 그 결과 수 없습니다. Likewise, 모든 세포가 GFP의 멤브레인 바운드 양식을 용납하지 않습니다. 가장 적합한 기자의 선택은 transfection의 기자의 효율성뿐만 아니라 untransfected 컨트롤에 비해 표현의 상대적 강도를 평가하여하여야한다. 이상적으로, 이러한 분자의 heterologous 표현이 잘 용납이이 마커는 세포주기 분포에 영향 거의있다는 암시이다 것입니다. 유동세포계측법 접근 방식의 이러한 유형 중 하나는 제한 그들은 서로 비교하여 세포주기의 단계의 상대 abundances을 설정할 수있는 것입니다. 그냥 S - 단계에 상대적으로 이러한 단계를 통해 진행을 느리게하는 경우 그림 3에서 p27의 표현이 진정으로 G1 및 G2 / M에 체포를 유도하거나 경우에 이런 이유로 그것은 모호한 것입니다. 이러한 가능성은 mitotic와 같은 nocodazole 같은 억제제 또는 aphidicolin 같은 G1 / S 억제제와 세포의 병렬 샘플을 처리하여 더 이상 조사 수 있습니다. 이러한 약물은 마님을 만들므로NT의 M - 단계에서 체포 또는 각각 S - 단계 초기는 천천히 proliferating 세포는 약물 유도 체포 지점에 축적됩니다. 제어 세포가 M - 단계 13 축적 반면 때문에 PRB 표현의 G1에 체포 예를 들어 세포는 nocodazole 치료에도 불구하고 G1에 남아있는 것이다. 합쳐 놓으면,이 실험 방법은 포유 동물 세포주기 연구 질문의 다양한 적용할 수있는 유연한 방법을 제공합니다. 그들은 쉽게 세포주기 진행의 변경을 감지하고 제어와 비교하여 차이점을 계량하실 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 세포 증식의 라벨링 시약 </td><td> GE Amersham </td><td> RPN201 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 BrdU 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347,580 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 마우스 FITC 항체 복합 </td><td> 벡터 실험실 </td><td> FI - 2000 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 스트레인 필터 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352,235 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 CD20 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 347,673 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 사이클 소프트웨어 </td><td> 피닉스 흐름 시스템 </td><td> N / A </td><td></td></tr></tbody></table>

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

세포 증식의 조절은 다세포 생물의 개발 기간 동안 조직 morphogenesis 데있어서 중심이되는 부분입니다. 또한, 세포 증식의 조절의 손실이 암 같은 질병의 병리를 underlies. 같은 세포 증식을 조사하고 세포주기의 각 단계에서 세포의 비율을 quantitate 수 있도록 큰 필요가있다. 그것은 indistinguishably 큰 인구 내에서 DNA를 복제 아르 세포를 식별하는 데 필수적인 중요성 또한이다. 분아 따위에 의해 번식하는 세포의 결정은 DNA 합성을 시작하고 세포주기의 나머지 부분을 통해 진행하기 전에 바로 G1 단계에서 만들어진 것이므로,이 단계에서 DNA 합성의 감지 세포 배양 성장 조절의 상태를 모호하지 않은 결정을 허용 실험. 세포에서 DNA의 내용은 쉽게 propidium 요오드화물의, 형광 DNA intercalating 염색 물들일 세포의 유동세포계측법에 의해 quantitated 수 있습니다.마찬가지로, 적극적인 DNA 합성은 세포를 수확하고, 산성 불용성 분획에 방사능의 결합을 측정, 방사성 thymidine의 면전에서 culturing 세포에 의해 quantitated 수 있습니다. 우리는 세포주기 분석 상당한 전문 지식을 가지고 다른 접근 방식을 권장합니다. 우리는 bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (BrdU로 간단히 축약) 최근 DNA 합성 이러한 thymine analogs의 결합을 감지 염색법을 사용하여 세포 증식을 조사합니다. 라벨 및 유동세포계측법 1 propidium 요오드화물 및 분석하여 총 DNA의 얼룩과 함께 BrdU와 세포를 얼룩하면 세포주기의 다양한 단계에서 세포의 가장 정확한 측정을 제공합니다. 그것이 propidium 요오드화물의 전체 DNA의 내용과 BrdU의 항체 기반의 얼룩을 통해 적극적인 DNA 합성의 검출을 결합하기 때문에 우리가 선호하는 방법입니다. 이것은 초기 단계에서 S G1에서 세포의 명확한 분리, 또는 늦은 S G2 / M.의 위상을 허용또한,이 방식이 서로 다른 세포주기의 단계를 통해 진행의 규정에 다양한 세포 자극 및 pharmacologic 대리인의 효과를 조사하기 위해 이용하실 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 교양 세포뿐만 아니라 유동세포계측법하여 분석을 라벨과 얼룩에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한이 방법은 성장 등 TGF - β1으로 크린 시토킨에서 억제 신호와 같은 cyclin 의존 키나제 억제제, p27KIP1로 proliferative 억제제의 효과를 측정하는 데 사용할 수있는 방법을 실험 예제를 포함합니다. 우리는 또한 큰 문화의 5 이내 세포의 하위 인구의 세포주기의 위치 분석을 허용 다른 프로토콜을 포함합니다. 이 경우, 우리는 크게 같은 문화에 untransfected 세포 열세에도 retinoblastoma 유전자와 transfected 세포의 세포주기 정지를 감지하는 방법을 보여줍니다. 이 예제는 DNA의 얼룩 많은 방법을 설명하고유동세포계측법은 활용 및 포유 동물 세포주기 조절의 근본적인 문제를 조사하기 위해 적용할 수 있습니다.

세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

세포 증식의 조절은 다세포 생물의 발달 과정 중 조직 형태 형성의 핵심입니다. 나아가, ...의 제어 상실은

이 절차의 목적은 세포 주기의 각 단계에 있는 세포의 비율을 결정하는 것입니다. 우선, 새로 합성된 DNA에 통합될 수 있도록 생존 세포 배양액에 세포 증식 표지 시약인 BRDU를 첨가하고, 시약이 통합된 세포 내의 BRDU를 염색한 다음, DNA를 propidium iodide로 염색함으로써 이를 수행합니다. 마지막 단계는 유세포 분석법을 통해 세포 주기의 서로 다른 단계에 있는 세포의 비율을 평가하는 것입니다.결과적으로, 실험 세포 집단의 세포 주기 분포는 BrDU 표지된 세포의 유세포 분석을 통해 시각화할 수 있습니다. 트리튬(tritium) 통합 및 신틸레이션 계수와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 BrDU 표지를 통해 각 세포 주기 단계에 있는 세포의 비율을 결정할 수 있다는 점입니다. 유세포 분석 설정은 조정해야 할 다양한 파라미터의 이미지 없이는 설명하기 어렵기 때문에, 이를 시각적으로 보여주는 것이 매우 중요합니다.본 실험 절차는 저희 연구실의 대학원생인 Matt Chii와 저 Miri가 시연하겠습니다. 실험 세포 배양액에 BrdU를 1:1000 비율로 희석하여 첨가하고, 1시간 동안 배양한 후 세포를 수확하기 위해 배양액을 흡입합니다. 그 다음 PBS로 세포를 2회 충분히 세척하여 배양액의 잔여물을 모두 제거합니다. 이번에는 3mM EDTA가 첨가된 PBS를 사용하여 배양액을 빠르게 한 번 더 헹군 후, 세포를 분리하기 위해 PBS-EDTA 용액을 완전히 흡입합니다.각 6 cm 배양 접시에 P-B-S-E-D-T-A 약 0.5 mL를 넣고 22 °C에서 약 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 플레이트의 세포 배양물을 개별 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 이제 세포를 상온에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거하고, 세포를 100 µL의 PBS에 재현탁합니다.마지막으로, 볼텍싱을 하면서 95% ethanol 5 mL를 한 방울씩 첨가하여 세포를 고정한 후, 상온에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 다시 한번 ethanol을 제거하고, 볼텍싱을 하면서 0.5% Triton X 100이 포함된 2 N HCl 1 mL를 한 방울씩 첨가하여 펠릿을 재현탁한 다음, 상온에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 세포를 다시 펠릿화한 후 상층액을 흡입하여 제거하는데, 이 단계에서는 세포 펠릿이 매우 느슨하게 형성되므로 각별히 주의하십시오.그런 다음 펠렛을 1 mL의 0.1 M 붕산나트륨(sodium tetraborate) 용액에 부드럽게 재현탁하고 세포를 다시 인큐베이트합니다. 이제 세포를 다시 한번 펠렛화하고, 이번에는 1:50으로 희석한 마우스 anti-BRDU 항체가 포함된 항체 용액 0.5 mL에서 인큐베이트합니다. 세포를 다시 펠렛화한 후, 이 펠렛을 1:25로 희석한 토끼 anti-US ZI 접합 2차 항체가 포함된 항체 용액 50 µL에 재현탁합니다.그 다음, 세포를 상온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 세포를 마지막으로 원심분리한 후, 0.5 milliliters의 propidium iodide 및 RNA 용액에 넣어 37 °C의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로, 응집물을 제거하기 위해 소화된 세포 용액을 세포 스트레이너(cell strainer)에 통과시킵니다.그 다음, 제시된 것과 같이 비동기적으로 증식하는 세포군을 분석하기 위해 유세포 분석기의 샘플 흡입에 적합한 튜브로 단일 세포들을 옮깁니다. 이 예시에서는 더블렛 판별 플롯(doublet discriminating plot)에서 가장 풍부한 두 개의 피크 주변에 게이트를 설정하여 이후의 모든 분석에 사용할 단일 세포 이벤트를 선택합니다. 그런 다음, 염색 및 유세포 분석기 파라미터 설정의 양성 대조군으로 사용할 비동기 증식 배양 샘플을 분석합니다.단일 세포의 2N 및 4N 피크가 x축의 임의 단위 200과 400에 중심이 오도록 프로피듐 요오드(propidium iodide) 염색을 위한 광증배관의 감도를 조절하십시오. 다음으로, FXI 음성 세포가 배경 수준보다 높게 나타나도록 FXI 검출 광증배관의 감도를 조절하십시오. BRDU 양성 세포는 약 10배 더 밝게 나타나야 하며, x축은 로그 스케일로 표시되어야 합니다.유세포 분석기(flow cytometer)로 캡처한 단일 이벤트들은 왼쪽 하단의 G1기부터 S기를 거쳐 다시 오른쪽 하단의 G2/M기로 이어지는 말편자 모양의 호를 형성합니다. 이 대표 도표에서 볼 수 있듯이, 원하는 범위의 DNA 함량을 얻기 위해 5,000개에서 10,000개의 단일 세포 이벤트를 수집하십시오. propidium iodide와 BRDU 함량을 측정한 후, G1기의 경우 200, G2/M기의 경우 400을 중심으로 하는 두 개의 BRDU 음성 집단 주변에 게이트를 설정하여 세포를 G1, S 또는 G2/M기로 할당합니다. 이 두 박스 위에 있는 모든 이벤트를 S기 측정을 위한 단일 게이트에 포함시키십시오. 각 게이트에 있는 세포의 백분율은 이전 산점도 도표에 대한 이 막대그래프에서 보여주는 것처럼 G1, S 및 G2/M기에 있는 세포의 상대적 수를 나타냅니다.본 예시의 관심 세포 마커인 CD 20으로 염색한 후, 세포를 22°C에서 500 ×g로 10분 동안 원심 분리하고, 1% BSA가 첨가된 PBS 5 mL에 펠릿을 재현탁합니다. 상온에서 500 ×g로 5분 동안 세포를 다시 펠릿화한 후, 0.5 mL의 propidium iodide 및 RNA 용액을 사용하여 세포를 재수화합니다. 그런 다음 세포를 염색 및 소화시키고, 방금 보여드린 것처럼 2n 및 4n 단일 세포 피크를 게이팅합니다. 이후 염색되지 않은 세포가 배경 수준 위에 오도록 FXI 검출을 위한 광증배관의 민감도를 조절합니다.이상적으로는, CD 20 FXI 양성 세포가 배경보다 10배에서 100배 더 강하게 염색되어야 합니다. 마찬가지로, x축은 로그 스케일로 표시되어야 합니다. 마지막으로, 배경 수준보다 10배 더 밝고 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색 강도가 200에서 400 사이인 CD 20 양성 세포를 선택하여, 여기 샘플 그림에 표시된 것과 같이 프로피듐 아이오다이드 대 세포 수 히스토그램으로 표시하십시오. 이 그림의 변동성을 제한하기 위해 각 샘플당 최소 1000개의 CD 20 양성 이벤트를 수집하십시오.propidium iodide와 BRDU로 염색된 세포의 3차원 유세포 분석 결과가 표시되어 있습니다. 2n 및 4n DNA 함량을 가진 세포들이 X축 눈금의 200과 400 표시 위에 중심을 두고 있음에 유의하십시오. propidium iodide 염색 강도에 대해 BRDU 염색 강도는 로그 스케일로 측정됩니다.Y축에서 세포 주기 중 G1기와 G2/M기에 있는 세포를 정량화하는 데 사용된 게이트의 위치를 확인하십시오. 이전 그림의 G1 및 G2/M 게이트 내 세포의 상대적 비율이 여기에 표시되어 있습니다. 여기서는 propidium iodide 및 CD 20을 사용하였습니다.CD 20 및 PRB를 이소성으로 발현하는 일부 세포가 포함된 세포 혼합물의 염색 결과가 나타나 있습니다. 두 개의 n 및 네 개의 NDNA를 가진 세포가 가장 풍부한 집단이며, x축의 200 및 400 표시 위에 중심이 위치함에 유의하십시오. 배경보다 최소 10배 더 밝게 염색된 CD 20 양성 게이트 선택 세포의 위치입니다.이 히스토그램은 이전 산점도의 CD 20 음성 세포에 대한 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색 대비 세포 수를 나타내며, 해당 세포들은 비동기적으로 증식하고 있습니다. 이 히스토그램에는 이전 CD 20 산점도의 CD 20 양성 세포 중 p rrb 발현으로 인해 정지가 유도되어 주로 2N DNA 함량을 가진 세포들이 표시되어 있습니다. 이 데이터는 이러한 염색 기법을 사용하여 배양액 내의 다른 세포들로부터 정지된 하위 집단을 구별할 수 있음을 보여줍니다. 다음 세 개의 그림에서는 마우스 배아 섬유아세포에서 사이클린 의존성 키나아제 억제제 P 27 KIP 1의 레트로바이러스 발현에 대한 유세포 분석 데이터가 제시됩니다.여기에서 보는 바와 같이, 빈 P babe 레트로바이러스 벡터가 형질전환된 비동기적으로 증식하는 세포군에서 세포 주기 단계를 측정하기 위해 Propidium iodide 및 BRDU 분석을 사용하였습니다. P 27에 반응하여 S-phase 게이트에서 BRDU 양성 이벤트가 거의 나타나지 않았습니다. 또한 G one 및 G two M 게이트에서 이벤트의 강도가 더 높게 나타남에 유의하십시오.마찬가지로, 이 그림에 도식화된 바와 같이 P 27을 발현하는 세포의 S-기 세포 비율은 상당히 낮습니다. 이러한 유형의 분석은 다양한 유전자 표적 마우스 계통에서 유래한 세포의 세포 주기 조절 결함을 특성화하는 데 매우 효과적이었습니다. 다음 두 그림에서는 형성되지 않은 기억 상피 세포를 성장 억제 사이토카인인 TGF beta one으로 24시간 동안 처리하였습니다.첫 번째 그림에서 보시는 바와 같이, S기 세포의 BrDU 표지는 TGF beta one 신호 전달에 의해 크게 감소합니다. 가운데 패널에서 확인할 수 있듯이, 세포들이 주로 세포 주기의 G1기에 축적됨에 유의하십시오. 세포 주기의 각 단계에 대한 정량 분석 결과, TGF beta one이 주로 세포 주기의 G1기에서 증식을 억제하여 이 단계에서의 세포 축적을 유도한다는 것이 확인되었습니다.마지막 실험 분석 시리즈에서, PRB 결핍 SAS two 세포에 CMV CD 20 발현 벡터와 함께 CMV RB 또는 대조군인 CMV beta GAL을 형질전환하였습니다. 첫 번째 그림은 음성 대조군 형질전환 세포의 세포 주기 분포를 72시간 동안 PRB를 발현시킨 후의 분포와 비교하여 보여줍니다. 마지막 그림의 오른쪽 패널에서 2N 피크가 거의 독점적으로 나타남에 유의하십시오. 멀티 사이클 소프트웨어를 이용한 커브 피팅 결과, PRB 발현 후 세포들이 주로 G1기에 축적되었음을 확인하였습니다.반면 s기와 G2/M기의 세포군은 상대적으로 감소했습니다. 이 기술을 숙달하면 mph의 인산화 히스톤과 같은 다른 세포 주기 마커를 연구하는 데 응용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 세포군의 세포 주기 분포를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.염산은 부식성이 있으며 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide)는 잠재적 발암물질이라는 점에 유의하십시오. 이들은 위험할 수 있습니다.이러한 화학 물질을 사용할 때는 항상 주의를 기울여야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포주기 단계의 진행과 속도론의 추적 미묘한 변화는 Propidium 요오드화물의를 통해 BrdU 및 전체 게놈의 DNA의 염색법과 핵산의 대사 라벨링의 조합을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 방법은이를 차례로 세포주기의 진행에 영향을 미치는가 아닌 특정의 DNA 손상의 도입을 방지, 자전거 전지의 화학 동기화의 필요성을 방지합니다.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

전환이 anaphase-추진 단지 (APC / C)에 의존 ubiquitination과 여기 cyclin B.의 후속 파괴를, 우리는, 펄스 - 체이스 라벨에 따라, 시스템을 설립 전체 세포 인구에서 cyclin B의 proteolysis를 모니터링 할 수 있으며를 통해 실행됩니다 anaphase에 Metaphase mitotic 검문소에 의한 간섭의 검색을 용이하게한다.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

miRNA 또는 microRNA는 세포주기 진행의 핵심 조절자입니다. 이 동영상은 miRNA가 세포주기 조절에 미치는 영향을 연구하기 위해 miRNA로 transfection된 폐암 세포의 유세포 분석 기반 세포주기 분석을 설명합니다. 세포주기 진행을 중단시킴으로써 증식을 억제하는 것은 암 치료를 위한 유망한 접근법이 될 수 있는 잠재력을 보여주었습니다.

세포주기 분석: miRNA transfected 폐암 세포의 세포주기 조절을 연구하기 위한 접근법

이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

이미징 기반 메서드를 설명 하는 S 단계를 식별 하 고 사용 하는 티 미 딘 C. 선 충 자웅 동체 생식 세포 주기 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있는 아날로그 듀. 이 메서드와 필요 없는 transgenes immunofluorescent 얼룩과 호환 됩니다.

티 미 딘 아날로그 듀와 선 충 C. 생식에 세포 주기 분석

이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

배우세요 포유 동물 세포의 세포주기 위치를 유동세포측정법으로 분석하는 방법을. BRDU와 프로피듐 요오드화물을 사용하여 G1, S, G2/M 단계를 정량화하고 세포 증식 동역학을 연구할 수 있습니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

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