Name: LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 배우세요 LRRK2 키나제 활성 분석 방법을 체외에서. 방사성 ATP를 이용한 자가인산화 및 기질 인산화를 통해 파킨슨병 관련 돌연변이의 영향을 연구합니다.

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저자는 파킨슨병의 영국 리서치 연구원 (부여 F1002)입니다. 이 작품은 그의 회원 신경과의 UCL 연구소, 셰필드 대학과 MRC 단백질 인산화 단위에서에서 온 영국 파킨슨병 컨소시엄에 Neurodegeneration 수상의 Wellcome 신뢰 / MRC 공동 통화 (WT089698) (UKPDC)에 의해 부분적으로 지원되었다 던디 대학.

안전 아래에서 설명하는 프로토콜은 ATP가 LRRK2의 키나제 활동을 수행하기 위해 γ 인산 위치에서 방사성 32 P로 표시 사용합니다. 그것은 저희 연구실에서 사용되는 표준 프로토콜을 기반으로, 그래서 같은 젤을 실행으로 프로세스의 단계에 많은 관련하여, 서부는 동부 표준시의 등등을 blotting 자료와 정확한 조건은 장비와 프로토콜로 가이드로 이동해야합니다 이러한 프로세스에 사용은 실험실에서 실험실에 따라 다릅니다. 방사선을 이온화 방출 동위 원소를 포함하는 화합물은 인간의 건강과 기관 및 국가 수준의 컨트롤의 사용에 엄격한 라이센스 및 규정에 잠재적으로 해로운 있습니다. 이 프로토콜의 실험 (지침 에바 대학에서 안전 서비스에서 제공하는 좋은 실험실 연습 지침 칼리지 런던 대학에서 오픈 소스 방사선 사용 훈련 다음과 다음과 같은 진행되었다에서 ilable <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). 오픈 소스 방사선의 사용은 적절한 훈련과 규제 당국의 승인 이전에 시도되지 않습니다. 실험실 연구에 오픈 소스 방사선에 대한 책임 규정 본문은 국가마다 다릅니다. 이들의 예는 다음과 같습니다 : 영국에서, 보건 및 안전 이그 제 큐 티브 ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> 미국의) 원자력 규제위원회 ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http://를 www.nrc.gov / 재료 / miau /, 규정 - 가이드 - comm.html</a> ), 캐나다 캐나다 원자력 안전위원회 (에 <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ), 독일 Bundesamt 잔 FÜR Strahlenschutz에 ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">HTTP : / / www.bfs.de / 드 / BFS</a> ). 다른 국가의 사용자는 방사선 안전 책임자와 현지 법률, 규정 및 라이센스 당국을 확인해야합니다. 이 프로토콜에 관련된 안전 조치는 방사성 개미 자리 기호 (로 강조, 텍스트에 알려져있다 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> ). 1. 키나제 반응 준비 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 모든 반응 혼합물은 방사능의 확산 방지하기 위해 O 링을 포함하는 나사 모자와 1.5ml 샘플 튜브에서 준비했습니다. <ol><li> 얼음 해동 단백질 - LRRK2 야생의 종류, D1994A, G2019S. </li><li> 10X 키나제 버퍼의 5ul 10nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 물이 50μl로 만들어 - 얼음에 반응을합니다. </li></ol> 2. 분석을 실행 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 32 P ATP를 이용하는 모든 단계가 P을 취하지정된 방사선 분야에 레이스. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 적합 개인 보호 장비를 착용한다 - 우리 연구실의 표준 운영 절차에 따라 이들은 실험실 코트, 이중 장갑 및 보호 고글을 포함합니다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 32 P ATP를 포함하는 샘플은 노출을 최소화하기 위해 6mm Perspex 화면에서 사용자로부터 격리되어야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 적용, 개인 감시 장치를 사용해야합니다 어디에 - UCL 이내에 모든 인증 오픈 소스 방사능 사용자가 실험 도중 방사선 노출을 모니터링하는 필름 배지가 있어야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 모든 실험 표면은 Gei를 사용하여 사용 전후의 방사선 오염에 대한 평가되어야합니다GER 카운터. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 모든 잠재적으로 오염된 소모품은 방사성 폐기물 처리를위한 제도적 지침에 엄격한 준수에 폐기되어야합니다. <ol><li> 분석을 시작하기 전에, ° C 100 ° C 각각 30 가열 블록을 설정 </li><li> -20 냉동기 (저장 조건이 서있 32 P ATP가 사용 radionucleotides의 공급자 또는 유형에 따라 달라질 수 있습니다)에서 32 P ATP를 제거합니다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> perspex 화면 뒤에 녹여 사용하기 전에 컨테이너 밖에서 스캔. </li><li> 얼음 반응, 감기 ATP의 10μM과 함께 각 32 P ATP의 1μl를 추가합니다. </li><li> 피펫과 잘 섞는다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 펄스 원심 분리기는 오염의 위험을 최소화, 튜브의 바닥에 액체 가져올 수 있습니다. </li><li> 제로 시점에 대한 15μl 나누어지는을 제거D 100 4X SDS 샘플 버퍼와 변성의 5μl를 추가로 나누어지는에 반응 ° 10 분 C를 종료할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 펄스 원심 분리기는 오염의 위험을 최소화, 튜브의 바닥에 액체 가져올 수 있습니다. </li><li> 남은 샘플 가열 블록에 배치하고 60 분 30 ° C에서 incubated. </li><li> 15μl 10 분 동안 100 4X SDS 샘플 버퍼와 변성의 5μl를 추가하여 종료 60분 시점과 반응 ° C에서 삭제되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 펄스 원심 분리기는 오염의 위험을 최소화, 튜브의 바닥에 액체 가져올 수 있습니다. </li></ol> 3. 샘플을 Immunoblotting 및 결과를 분석 <ol><li> 샘플은 SDS - PAGE에서 실행 <ol><li> 10 잘 4-12% 비스 - 트리스의 polyacrilamide 젤은 맙스 실행 버퍼를 사용하여 전기 영동을위한 준비. </li><li> 각 샘플의 20μl는 sharps의 7μl과 함께 겔에로드주석박 단백질 표준 사다리. </li><li> 젤 90 분 동안 160v에서 실행하거나 염료 앞에는 젤의 끝에 도달 때까지. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> radioisotopes과 접촉의 모든 액체 방사성 폐기물로 취급하고 당 기관 지침 폐기해야합니다. 액체 방사성 폐기물이 풍부한 물로 지정 방사성 폐기 싱크를 흘러내리고으로 폐기되어야한다는 UCL 규정은 상태. </li></ol></li><li> 단백질은 서양 얼룩을 통해 PVDF 막으로 전달. <ol><li> 전송 버퍼, 1X 트리스 글리신 플러스 20 %의 메탄올을 준비했습니다. PVDF 분리막 및 필터 종이 젤에 대한 크기를 해결하기 위해 잘라 멤브레인 또는 필터 종이의 경우 전송 버퍼와 함께 사전 서부 유럽 표준시의 경우에는 빙하 메탄올과 활성화. 막은 방향의 신분을 수 있도록 볼펜 잉크로 미리 표시해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="기호 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="기호 1"> 젤 plast에서 제거IC 케이싱 및 초과 아크릴 아미드는 방사성 폐기물로의 제거 및 처리. </li><li> 젤 더 거품이 막과 젤 사이에 존재하지 않는 보장, 멤브레인 및 필터 종이 샌드위치로 구성된 다음 겔과 양극 사이에 멤브레인와 서부 얼룩 장치에 배치해야합니다. </li><li> 전송은 16 시간 동안 25V에서 실시. </li></ol></li><li> PVDF에 단백질 전송 따라 멤브레인는 실온에서 건조해야합니다. 마지막으로, 건조 막은 셀룰로오스 아세테이트 시트 사이의 절연 및 형광체 화면 또는 radiolabelled 단백질의 검출을 허용하는 X - 선 필름 중 하나에 노출되어야합니다. 노출 시간은 사용되는 방사성 동위 원소와 반응의 효소 반응 속도론의 특정 활동에 따라 일주일에 몇 시간에서 실행할 수 있습니다. </li><li> Phosphoscreen는 / 필름 스캔 처리. 형광체 스크린을 사용하는 경우 이미지가 필름을 사용하는 경우 다음 결과 트란, 고해상도 TIFF 또는 비트맵 파일로 저장해야합니다sparency은 데스크탑 스캐너를 사용하여 스캔하고 고해상도 TIFF 또는 비트맵 파일로 저장해야합니다. 이미지가 ImageJ, 건강 웹사이트의 국립 연구소 (에서 사용할 수있는 프리웨어 프로그램에서 분석할 수 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. 대표 결과 그림 1은 일반적인 분석 인산염 수용체 기판으로 Myelin 기본 단백질과 야생 유형, G2019S 및 D1994A LRRK2를 사용하여 수행을위한 대표적인 결과를 보여줍니다. LRRK2의 Autophosphorylation 20 - 40kDa에서 볼 수 phosphorylated MBP를 대표하는 여러 밴드와 함께 ≈ 200kDa에서 볼 수 있습니다. D1994A (키나제 죽음) 차선 autophosphorylation의 부재를 참고로 인해 G2019S 돌연변이에 인산화 증가. 키나제 죽은 차선 MBP 또한 잔류 인산화를 적어 둡니다. 이것은 돌연변이에 의해 D1994A LRRK2의 키나제 활동의 불완전 절제로 인해하거나 존재 O이 반영될 수 있습니다F는 반응 kinases를 오염 흔적. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 논문은 체외 시스템을 사용하여 LRRK2의 키나제 활동을 시금위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 짧음의 관심에서, 이것은 일반적인 기판을 사용하여 한 시간 동안 엔드 포인트 템플릿 제한하지만, 일반적인 프로토콜은 잠재적인 기판의 다양한 적용과 LRRK2의 키나제 활동의 속도론을 조사보다 정교한 분석 의무가 있습니다되었습니다 . 이것은이 같은 단백질 키나제의 행동을 조사하기 위해 체외 시스템을 사용하여의 주요 장점 중 하나를 강조 : 효소와 기판의 농도를 완벽하게 제어가 있기 때문에, 그것은 운동 데이터를 생성하고 K m을 계산 할 수 있습니다 반응 및 V 최대 값. 자세한 운동 평가 또는 putative 억제제의 영향을 평가, 높은 처리량 시스템은 (예 : Invitrogen에서 사용할 수있는 LRRKtide 기판을 사용하여 여유되는 등) 뛰어난 alternati입니다여기에서 설명한 접근했습니다. 그것은 중요하지만, 체외의 키나제의 assays에 의해 제공 reductionist 모델 시스템이 인식하는 하나의 도구는 키나제 및 잠재적인 기판과의 관계의 생물학을 검사합니다. 이와 같은 assays에서 데이터는 키나제는 체외에서 세포 맥락에서 작동하는 방법의 포괄적인 그림을 얻기 위해 다른 접근법과 함께 사용해야합니다. 예를 들어, 체외에서 phosphorylated putative 기판은 다음 기능을 검사를 타겟으로 돌연변이 유발 (예. 변환할 세린이나 알라닌과 같은 ​​없음 - phosphorylatable 잔류물에 트레오닌 인산염 수용체의 잔류물)로 조정할 수있어 가능한 phosphosites를 식별하는 질량 분석계로 분석 가능 인산화의 전의 생체내의 결과. 이와 같은의 시험 관내 분석 시스템에서 데이터를 해석에서 중요한 고려 eithe 가능성있다R 타입 I 또는 유형 II (거짓 양성 또는 거짓 부정적인) 오류. 이 시스템의 reductionist의 자연 안타깝게도 모두 그것을 disposes - 전직의 경우 (휴대폰 환경에 비해) 정화 putative 기판을 앓고 있고 인위적으로 가까이에있는 높은 농도에서 키나제를 정화하는 것은 artefactual 인산화 이벤트를 발생할 수 있습니다. 반대로, 많은 kinases는 세포의 컨텍스트 내에서 복합의 일환으로 기능하고, 발생할 주어진 기판의 인산화 공동 요소를 필요로합니다. 위에서 명시한대로, putative 기판의 인산화에서 긍정적인 결과가 시험 관내 분석 시스템을 사용하여 그 다음 결과를 확인하기 위해 셀룰러 시스템에서 테스트해야하고, 부정적인 결과를주의해서 해석해야합니다. 이걸로 미루어 보아, 그것은 관심의 키나제의 활동의 비교 연구를 허용하는 긍정과 부정 모두 컨트롤이 가능합니다 어디에 중요합니다. 긍정적인 contro주의 선택귀하의 putative 기판 phosphorylate하지 않을 수 있습니다 부정적인 컨트롤과 함께 관심의 단백질을 향해 알려진 활동이 난 매우 중요합니다. LRRK2 하나의 후보 제어 LRRK2의 키나제 도메인에 밀접하게 관련 기본 순서를 가지고 있지만 매우 다른 전체 도메인 구조 18가 키나제 3, 상호 작용 수용체이다. 이것은 Invitrogen에서 재조합 단백질로 사용할 수 있으며 저희 연구실에 표준 컨트롤로 사용됩니다. 이것은, LRRK2의 상용 양식이 단백질의 N - 말단이 부족하고 글루타티온 - S - transferase이 단백질과 키나제 assays을 수행하면 이것은 잠재적인 혼란함을 주죠 요소로 고려되어야 태그가 있는지 또한 지적해야 그것이 알려진이 아니므로 LRRK2의 N - 터미널이 단백질의 정상적인 기능에서 어떤 역할을 수 있습니다. 예를 들어, 단백질에 결석 LRRK2의 N - 터미널 부분은이 프로토콜에 사용되는 경우,그러면이의 관찰 인산화에 큰 영향을 미칠 것입니다 LRRK2의 키나제 도메인에 특정 기판의 채용에 중요 체외 시스템에의 기판 위에서 설명한했다. 도 이러한 경고와 함께, 그러나 파킨슨병의 연구에 LRRK2의 생물에 부착된의 중요성은 체외 설정에서이 단백질의 동작을 조사하는 귀중한 도구로이 프로토콜의 유틸리티를 강조 표시합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> LRRK2 야생 유형 </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2의 G2019S </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> 키나제 버퍼 </td><td> 세포 Signalling </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> 시그마 </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32P g ATP </td><td> Perkin 엘머 </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mMole </td></tr><tr><td> 4X 신분증 샘플 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 시그마 </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 기준 </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> 맙스 버퍼를 실행 </td><td> Invitrogen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> 비스 - 트리스의 아크릴 아미드 젤 </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 4-12% 1mm 10well </td></tr><tr><td> PVDF 막 </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> 전송 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 시약 소주 및 취소 이온화 물을 희석 모든 단계에 사용되었다 <table border="1"><tbody><tr><td> 장비 유형 </td><td> 회사 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> 가이거 계수관 </td><td> 미니 악기 </td><td></td></tr><tr><td> SDS PAGE 탱크 </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> 전송 탱크 </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> 열 차단 (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> 형광체 스크린 </td><td> GE </td><td> X - 선 필름 대체 수 </td></tr><tr><td> 형광체 전mager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> 노출 카세트 </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Perspex 차폐 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5ml 튜브 </td><td> VWR </td><td> O 링과 나사 가기 </td></tr></tbody></table> 표 2. 장비

lrrk2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

류신 리치 반복 키나제 2 (LRRK2)는 GTPase 도메인 (단지 단백질의 RAS를 위해, ROC를 칭했다)과 키나제 도메인을 하나 포함하여 복잡 multidomain 구조를 보유하고 단백질의 ROCO 제품군의 2527 아미노산 회원입니다. 파킨슨병 (PD)를 일으킬 LRRK2의 돌연변이 2004 년 발견은 정상적인 기능에 연구의 거대한 볼륨의 초점이되고 LRRK2 결과와 단백질이 질병 상태 2,3에서 틀려서 어떻게되는지. LRRK2의 기능에 초기 조사는 효소 활동을 4-6에 주력. 명확한 사진으로 인해 돌연변이 이러한 일관성의 변경의 등장은 아직 있지만, 그룹의 숫자 데이터가 변이 7,8에 연결된 세포 죽음을 LRRK2의 키나제 활동의 중요성을 강조했다. 최근 출판물은 핵심 실험 도구 9-11를 제공 LRRK2의 키나제 활동을 대상으로 억제제를보고있다. 이러한 데이터의 불빛에,그들은 파킨슨병에 대한 잠재적인 약물 표적 여부를 논의하기 위해 열린 있지만 LRRK2의 효소 속성이 단백질의 생물로 우리에게 중요한 창문을 살 가능성이 높습니다. 다른 방식의 숫자는 분석 LRRK2의 키나제 활동을하는 데 사용되었습니다. 처음 assays는 포유 동물 세포 라인에 overexpressed 에피토프 태그 단백질을 사용하여 수행되었으며 assays는 아가로 오스 비즈 4,5,7에 고정이 단백질을 사용하여 실시와 함께, immunoprecipitated. 이후, 솔루션에 LRRK2의 재조합 조각을 정화하는 것은 또한 LRRK2 12 2527에 잔류물 970를 포함한 곤충 세포에서 정화 GST 태그 조각은 예를 들어, 사용되었습니다. 최근 다니엘스 외가. 인간의 배아 신장 세포에서 솔루션에 전체 길이 LRRK2의 고립을보고, 그러나이 단백질은 13 널리 사용할 수 없습니다. 반면, GST 융합은 LRRK2의 양식 상업 availabl는 잘립니다E (Invitrogen에서 자세한 내용은 표 1 참조)하고 LRRK2 키나제 활동에 대한 분석을 보여주는 편리한 도구를 제공합니다. LRRK2 키나제 활동에 대한 몇 가지 출력이보고되었습니다. Moesin에서 트레오닌 558의 인산화에 따라 불리는 LRRKtide - - LRRK2 자체 인공 기판의 일반적인 키나제 기판 및 인산화 등 Myelin 기본 단백질 (MBP)의 인산화의 Autophosphorylation 모두 사용되었습니다 등 putative 생리 기판의 일련을 가지고 α - synuclein, Moesin 및 4 ebp를 14-17을 포함합니다. LRRK2을위한 기판 이러한 단백질의 상태가 불분명 남아 있으며, 아래에 설명된 같은 프로토콜이 잠재적인 기판의 범위에 대한 감독 분석 LRRK2 키나제 활동이 시스템의 유틸리티를 지적, 일반적인 기판으로 MBP를 사용하여 초점을 맞출 것이다대로.

류신 리치 반복 키나제 2 큰 multidomain의 키나제이며, 돌연변이가있는 파킨슨병의 가​​장 흔한 유전적 원인이됩니다. 이 단백질 키나제의 활동 분석은이 단백질의 생물학과 장애를 이해하는 중요한 도구로 입증되었습니다. 본 논문에서는<em&gt; 체외에서</em&gt; LRRK2의 키나제 활동의 시금 및 돌연변이의 선택은 putative 기판과 질병에 LRRK2의 잠재적인 장애의 인산화를 조사하는 실험 시스템을 제공 설명되어 있습니다.

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)는 2,527개의 아미노산으로 구성된 ROCO 단백질 가족의 구성원으로, ...를 포함하는 복잡한 다중 도메인 구조를 가지고 있습니다.

이 절차의 전체적인 목적은 leucine rich repeat kinase two의 키나아제 활성을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 recombinant LA two와 myelin basic protein 기질을 포함한 키나아제 분석 혼합물을 준비함으로써 수행됩니다. 그 다음으로 방사성 표지된 a TP를 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 단백질을 변성시키고 폴리아크릴아마이드 젤에서 분리한 후 웨스턴 블롯을 수행합니다. 마지막으로, 멤브레인을 포스포 스크린에 노출시켜 활성을 측정합니다. 궁극적으로, LA two가 활성화되어 있는지와 돌연변이가 자가 인산화 및 MBP 인산화를 통해 그 활성을 어떻게 변화시키는지 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.방사성 물질 취급 시 준수해야 하는 안전 예방 조치로 인해 해당 단계들을 학습하기가 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 절차를 시작하기 전, 방사능 확산을 방지하기 위한 방사성 동위원소의 적절한 사용 및 폐기에 관한 서면 프로토콜을 참조하십시오. 모든 반응 혼합물은 O-링이 포함된 스크류 캡 형태의 1.5 milliliter 샘플 튜브에 준비하십시오.먼저 얼음 위에서 야생형 LA two 단백질과 변이체들을 해동하여 분석을 시작합니다. 그런 다음 얼음 위에서 kinase 10 nM, myelin basic protein 0.5 µg/mL, 10배 농도의 kinase buffer 0.5 µL를 혼합하고, 최종 부피가 50 µL가 되도록 증류수를 추가합니다.작업 영역과 방사성 물질 취급 인원에 대한 준비를 마친 후, 가열 블록을 각각 30 °C와 100 °C로 설정하십시오. -20 °C 냉동고에서 32 PATP를 꺼내십시오. 사용 전 용기 외부를 스캔하고 퍼스펙스(perspex) 차폐막 뒤에 배치하십시오.가이거 계수기를 사용하여 얼음 위에서 각 반응에 첨가할 32 PATP의 방사능을 평가하십시오. 1 µL의 32 PATP와 10 µM의 cold ATP를 첨가하십시오. 피펫을 사용하여 잘 혼합하십시오.그런 다음 반응액을 펄스 원심분리하여 액체를 튜브 바닥으로 모음으로써 오염 위험을 최소화합니다. 다음으로, 0시간 시점의 샘플로 15 µL의 분취액을 취하고, 4배 농도의 SDS 샘플 버퍼 5 µL를 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 이후 해당 분취액을 100 °C에서 10분 동안 변성시킵니다.남은 샘플을 30 °C에서 60분 동안 배양합니다. 그 후 두 번째로 50 µL의 분주액을 취합니다. 4x 샘플 버퍼를 첨가하고 100 °C에서 10분 동안 배양합니다.SDS-PAGE로 반응물을 분리하기 위해, 각 시료 20 µL를 단백질 표준 시료가 포함된 10-well, 4-12% Bis polyacrylamide 젤에 로딩합니다. MOPS 러닝 버퍼를 사용하여 160 V에서 90분 동안 또는 염료 전선(dye front)이 젤 끝에 도달할 때까지 전기영동을 수행합니다.서면 프로토콜에 기술된 단계에 따라 25 volts에서 16시간 동안 단백질을 PVDF membrane으로 전이시킵니다. membrane이 건조되면, 이를 두 장의 cellulose acetate sheet 사이에 넣고 phosphorous screen 또는 x-ray film에 노출시켜 방사성 표지 단백질의 노출을 검출합니다. 노출 시간은 사용된 방사성 동위원소의 비방사능 및 반응의 효소 반응 속도론에 따라 수 시간에서 일주일 이상까지 소요될 수 있습니다.인광 스크린을 사용하는 경우, 이미지를 고해상도 TIFF 또는 필름용 비트맵 파일로 저장하십시오. 먼저 데스크톱 스캐너를 사용하여 필름을 스캔합니다. 여기서는 이미지 분석을 위해 Image J를 사용하십시오.와일드 타입 Lark two 및 G 2 0 1 9 S 과활성 키나아제, D 1 99 4 A 키나아제 결핍 변이체를 사용하여 myelin basic protein을 인산화 수용체로 하여 수행한 분석 결과는 다음과 같습니다. 보시는 바와 같이 Lark two의 자가 인산화가 약 200 kilodaltons에서 관찰되며, 인산화된 MBP를 나타내는 여러 밴드가 20에서 40 kilodaltons 사이에 나타납니다. D 1 90 94 a 레인에서는 자가 인산화가 나타나지 않으며, G 2 0 1 9 s 돌연변이로 인해 인산화가 증가한 점에 유의하십시오. 키나아제 결핍 레인에서 관찰되는 MBP의 잔류 인산화는 D 1 99 4 A 돌연변이에 의한 Lark two의 키나아제 활성 제거가 불완전했거나, 반응액 내에 미량의 오염된 키나아제가 존재하기 때문일 수 있습니다.방사선을 이용한 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이러한 절차를 수행할 때는 항상 차폐와 같은 보호 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

류신이 풍부한 반복 키나아제 1 및 2 (LRRK1 및 LRRK2는) GTPase의 키나제 도메인을 모두 인코딩 세포에서 인산화되는 멀티 도메인 단백질입니다. 여기, 우리는 따라서 전반적인 휴대 phophorylation 수준을 측정 할 수있는 수단을 제공, 32 P 오르토와 세포 LRRK1 및 LRRK2 레이블을하는 프로토콜을 제시한다.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

단백질 키나아제는 고도의 진화 된 신호 효소 및 세포 내 및 세포 내 신호 전달에 중요한 발판이다. 우리는 세포 표지 조절의 해명에 도움이되는 신뢰할 수있는 방법 인 방사성 표지 된 아데노신 3 인산염 ([γ- 32 P] ATP)의 사용을 통해 키나아제 활성을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

현재 연구 신 부유한 반복 키 2 Rab10 인 산화의 내 생 레벨을 탐지 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

류신이 풍부한 반복 키나아제 2 유전자(LRRK2)의 돌연변이는 유전성 파킨슨병을 일으킨다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에서 Rab10의 LRRK2 대조 인산화를 평가하기위한 쉽고 강력한 방법을 개발했습니다. 이 증가 LRRK2 키 나 제 통로 활동을 가진 개인을 식별 하는 데 도움이 수 있습니다.

Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리

이 프로토콜의 목적은 레이블, 풍부, 및 단백질 키 니 아 CK2 세포 lysate 또는 조직 homogenate 같은 복잡 한 생물학 견본에서의 기판 확인 하는 것 이다. 이 메서드는이 목적을 위해 CK2 생물학의 독특한 측면을 활용합니다.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

이 분석은 commissural axons를 방향에 대한 신호 분자의 능력, 여기에 본 Morphogenetic의 단백질 7 (BMP7)을 평가합니다. 배아 등의 척수의 explant는 COS 세포의 secreting 후보 성장 요인의 집계에 인접한 양식입니다. explant 내에서 성장 Reoriented commissural axons은 immunohistochemistry에 의해 시각입니다.

배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금

배우세요 LRRK2 키나제 활성 분석 방법을 체외에서. 방사성 ATP를 이용한 자가인산화 및 기질 인산화를 통해 파킨슨병 관련 돌연변이의 영향을 연구합니다.

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서

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