Name: 분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 배우세요 고체 상태 NMR과 원자력 현미경을 사용하여 토마토 과일 표피에서 왁스를 선택적으로 제거하고 생체 고분자의 가교 능력을 평가하는 방법을. 이 기술은 식물 생물학 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 미국 국립 과학 재단 기금 # MCB-0741914 및 MCB-0843627에 의해 지원되었다; 추가 infrastructural 지원은 건강 2의 국립 연구소 연구 자원을위한 국립 센터에서 G12 RR03060-26에 의한 뉴욕시 대학에서 제공했습니다. 우리는 기꺼이 그 JKC는 M82 (야생 유형) 및 CM15 (돌연변이) 토마토 손톱를 제공해 주셔서 코넬 대학 식물 생물학과에서 그룹을 장미 인정합니다. 우리는 AFM 실험과 그의 관대한 도움을위한 교수 알렉산더 Couzis의 CCNY 화학 공학 그룹에서 박사 Spyros Monastiriotis 감사드립니다. 우리는 그래픽 디자인 지원을 위해 양 로렌 Gohara 감사드립니다.

1. 토마토의 효소 고립은 5 손톱 <ol><li> 그릇에 여러 상업적 또는 경지 토마토를 놓습니다. 큰 섹션 과일의 피부 보지, 내부 과피 조직을 버리고. 탈이온수와 토마토 스킨을 씻고 비이커에 물 속에 그들을 보존. </li><li> 200 ML 추가, 나트륨 아세테이트 trihydrate의 1.22 G (M r에. 136.08 g / 몰)와 비커에서 2.34 ML 빙초산 (17.485 M)를 넣어 50 밀리미터 산도 4.0 아세트산 나트륨 버퍼를 (° C 31에서) 준비 31 살에 4.0으로 산도를 조정 후 탈이온수, 그리고 ° C. , 13 밀리그램 할머니 3;, cellulase의 0.2 G (1.3 단위 / MG 고체, 시그마 알드리치 EC 232.734.4); pectinase (10 U ML -1, TCI 미국 EC 3.2.1.15) 4 ML을 포함하는 혼합물을 준비한다 그리고 최종 효소 칵테일 200 ML을 얻기 위해 효소 혼합물에 아세트산 나트륨 버퍼의 196 ML에 추가합니다. 5 완전히 효소 칵테일 벗겨 토마토 껍질을 담가과 부화31 살에 ° 일정한 진동 (G24 환경 보육 흔드는, 뉴 브 런 즈윅 과학 주식 회사)와 24 시간 동안 C #. </li><li> 주방 스트레이너 또는 Büchner 유입 경로 및 탈이온수 그들을 씻어을 사용하여 토마토 스킨을 수집합니다. 이후, 1 시간 동안 실온에서 진공 오븐에서 그들을 넣습니다. 이후 dewaxing 수속 라벨과 공을 병에 말린 토마토 스킨을 보존. </li></ol> 2. Soxhlet 추출 6 시까지 철저한 Dewaxing <ol><li> 철저한 dewaxing에 사용되는 장비는 열원 (가열 맨틀과 Variac 컨트롤러), 용매 저수지에 대한 둥근 바닥 플라스크, Soxhlet 추출기, 소결 유리 골무 또는 일회용 추출 골무, 안티 지원해주 칩 콘덴서 (그림 참조로 구성되어 있습니다. 1). 좁은 사이펀 암 (부품 그림 6 및 7. 1)주의 취급을 필요로하는, 매우 섬세하고 파손하는 경향이있다합니다. </li><li> (에서 얻어진 토마토 피부의 0.5-1 g을 넣고절구 1 단계.), 그리고 샘플 AFM 측정 (5 항)에 사용할 수없는 한 유봉과 거친 분말로 샘플을 갈다. 샘플로 약 절반을 소결 - 유리 또는 일회용 골무를 작성하고 추출 열의 기지에 신중을 배치 핀셋을 사용합니다. </li><li> 콘덴서를 부착하고 알루미늄 호일로 싸서. 몇 반 지원해주 칩의 면전에서 메탄올 용매 (ACS 학년)를 가열 플라스크의 벽에 그것이 부드럽게 종기와 refluxes까지. 글라스 울과 알루미늄 호일을 모두 가진 용매 저수지를 커버. 골무가 가득 차면 Soxhlet 장치 내에 저수지는 초당 약 드롭을 축적하도록 Variac 전압을 조정하고 몰래, 1 시간 동안 프로세스가 발생합니다 확인합니다. </li><li> 12 H의 추출 과정을 계속 다음 가열 맨틀을 절감하고 장치가 식다 수 있습니다. 용매 처분하기위한 하나의 단위로 추출기와 저수지를 제거합니다. 핀셋을 사용RS는 불과 추출 열의 목 아래 골무를 높이 그것의 용매 초과 드레인, 그리고 깨끗한 표면에 골무을 배치합니다. 아래 플라스크에 몰래 있도록 추출 컬럼을 기울이십시오. 술병을 분리하고 분류 폐기물 용매 콘센트에 폐기물을 붓는다. </li><li> 점차적으로 감소 극성, 각각의 경우 12 H에 대한 예, 클로로포름과 헥산의 연속 용매에 대한 단계 2.3 및 2.4를 반복합니다. </li><li> 토마토 cutin 예제 골무 내부 역시 그 위에 질소 가스의 흐름을 폭파하거나 실온에서 진공 오븐에 넣어 의한 건조하도록 허용합니다. 마지막으로, 건조한 시료의 질량을 측정하고 parafilm으로 봉인 나사 최고 항아리에 실온에서 보관. </li></ol> 3. Epicuticular 및 Intracuticular 왁스 3,4의 선택적 분리 <ol><li> 첫째, 증류수로 전체 토마토 (1에서 설명과는 토마토 별도의 배치.) 씻는다. 아빠와 함께 그들을 말리어 수건과 Kimwipes, 장소 그들을 알루미늄 호일의 조각을 아래로 줄기. </li><li> 1백20퍼센트 (W / W, 대량 비율) 패션 아래 상단에있는 아라비아 고무 수용액으로 전체 토마토를 바르고 얇은 필름을 떠나는 과일의 피부에 건조를 아랍어 껌를위한 한 시간 정도 허용합니다. 하지 찔린 토마토 피부에 신중하다고, 족집게를 사용하여이 필름을 제거합니다. 한 번 더 절차를 반복합니다. </li><li> 3 분 1시 1분 (V / V) 클로로포름 - 물과 혼합을 포함하는 튜브에 필름을 추가합니다. 격렬한 교반 및 위상 분리 후, 클로로포름 분수를 피펫과 epicuticular 왁스를 떠나, 별도의 덮개가 튜브 안에 그들을 증발. 토마토는 물리적으로 그대로 유지됩니다. 상온에서 2 분 동안 클로로포름으로 그들을 찍어와 용매를 증발 후 intracuticular 왁스를 수집합니다. 이제 토마토 껍질과 (와 같은 설명에 각각 셀룰로오스 및 펙틴을 제거 (아세트산 나트륨 완충액의 cellulase와 pectinase 포함) 효소를 취급 <str><li> 원하는 경우 다양한 극성 세 용제를 (각각 메탄올, 클로로포름과 헥산,)를 사용하여, (단계 2 참조) Soxhlet 추출하여 이러한 효소 격리된 손톱에 든다 dewaxing을 수행합니다. </li></str></li></ol> 4. 교차 편광에 의한 토마토 과일 Cutin의 분자 특성화 매직 앵글 회전 고체 핵 자기 공명 (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> 공급 업체 제공 포장 도구를 사용하여 1.6 mm fastMAS 지르코니아 로터의 완전 dewaxed 토마토 손톱 (cutins) 장소 4-6 밀리그램. (지상 dewaxed 토마토 손톱 또는 일부 dewaxed 손톱의 아주 작은 조각 하나에 적합합니다.) 로터에 너무 밀접하게 샘플이 균일하게 포장되었는지 확인하지만. 상단 모자를 씌우고 후, 스핀 속도의 측정을 용이하게하기 위해 검정색 잉크 마커 펜으로 캡의 절반을 그리다. </li><li> 절반 높이에서 최소 스펙트럼 선폭을위한 NMR 분광계의 shimming 조정ND는 양성자 (1 H)을 교정하고 탄소 (13 C) 90 같은 adamantane 같은 표준 화합물을 사용 ° 펄스 폭을. </li><li> 모델 화합물로 글리신이나 글루타민을 사용 (하트만-돼야 해 한이 일치하는 전력 레벨, 1 H - 13 C 접촉 시간, 헤테로핵 1 H 감결합 강도) 모든 매개 변수를 최적화하여 최대 신호 강도를 얻을 교차 편광 마술 - 각도 회전의 (CPMAS) 실험. 600 MHz의의 1 H 주파수에서 얻은 스펙트럼을 권장 조건은 10 kHz에서 15 kHz에서 회전 주파수, 인수 사이에 3 초 지연, 그리고 185 kHz에서의 주파수에 상응하는 자기장 강도에서 7 감결합 척추 헤테로핵 양성자를 포함합니다. </li><li> probe에 cutin - 팩킹된 로터를 삽입합니다. 그런 다음 자석으로 프로브를 놓습니다. 점차적으로 좋은 샘플 포장 및 로터의 안정성을 확인하기 위해 최대 10 kHz에서까지 회전 속도를 높이십시오. 회전자의 최종 회전 안정성 내에서 확인± 20 Hz에서. </li><li> 튜닝 조정과 프로브의 콘덴서와 일치하는 것은 iteratively 1 H와 13 C NMR 주파수 모두에서 최소 전력 반사를 얻을 수 있습니다. 25 실험 온도를 설정합니다 ° C (또는 상온). </li><li> 10 kHz에서 회전 주파수에서 결정 하트만-돼야 해 한이 검색 조건에 해당하는 미리 최적화된 CPMAS 실험을 시작합니다. </li><li> 지수 (Lorentzian) 라인 50-100 Hz의 확대와 함께 4096 과도, 조건 스펙트럼을 습득하고, 푸리에는 신호 강도 대 화학 차폐 (PPM)의 NMR 스펙트럼을 생성하기 위해 변환하지. </li><li> 표준으로 8 - 13 C 화학은 외부에서 38.4 PPM (-CH 그룹 2)에서 adamantane 세트를 사용하여 교대 참조. </li><li> 15 kHz에서로 로터 회전 주파수를 증가하고이 후자의 회전 주파수에서 결정 하트만-돼야 해 한이 검색 조건에 해당하는 CPMAS 측정 (단계 4.6-4.8) 반복합니다. </li><li> Repe자연 (밀랍)과 부분적으로 dewaxed 과일 표피 샘플로 CPMAS 실험 (단계 4.1-4.9)에서. </li></ol> 5. 원자 힘 현미경과 토마토 표피 표면 프로빙 (디지털 인스 트루먼 트의 Nanoscope IIIa을; 절차 현미경 사이에 약간 다릅니다) 6 <ol><li> 스캐닝 프로브 현미경 (SPM)를 켭니다 (그림 2)와 현미경 모드 토글 스위치가 접촉 원자 힘 현미경 (AFM) 모드로 설정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 수동으로 두개의 사용자가 조절 가능한 전면 단자를 설정하여 SPM 헤드를 올립니다. 머리 뒤쪽에서 클램핑 스크류를 회전하여 SPM 헤드에서 AFM의 tipholder를 분리합니다. </li><li> tipholder에서 기존의 AFM의 캔틸레버를 제거하려면 족집게를 사용하여 다음 조심스럽게의 패키지에서 새로운 실리콘 질화물 캔틸레버 (AFM 탐침)을 잡고 옛 캔틸레버의 장소에 설치하십시오. 새로 설치된 AFM의 캔틸레버가 깨진되지 않았는지 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용합니다. </li><li> 일 첨부전자 토마​​토 표피 샘플 양면 테이프와 스테인레스 스틸 디스크 (샘플 퍽을)까지 (일부 dewaxed 토마토 표피의 섹션 ~ 10mm × 10 밀리). 표피 표면이 평평하고 퍽을에 대한 샘플의 배치 이후 원활한 유지하는지 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용합니다. </li><li> SPM 스캐너 상단의 자기 지역쪽으로 토마토 표피 샘플로 퍽을를 놓습니다. </li><li> 손잡이를 회전하여 높은 스캐너의 전면이 수동 조절 나사를 설정하고, 다른 두 전면 나사 등 거의 동일한 수준으로 동력 다시 조정 나사를 설정합니다. 세 개의 나사가 SPM 헤드에 tipholder를 삽입했을 때 AFM 팁을 깨는 피하기 위해 충분히 높게 설정되어 있는지 확인합니다. </li><li> SPM 헤드에 tipholder를 꽂아과 머리 뒤쪽에 클램핑 스크류를 강화하여 고정하십시오. </li><li> 레이저 켠 후, 머리 꼭대기에 중앙 (Y)과 오른쪽 (X) 레이저 조정 단자를 사용하여 AFM의 캔틸레버에서 레이저 자리를 맞춥니다.정확히 AFM의 캔틸레버의 끝에 레이저 스폿을 배치하기 위해 종이에 비치는 레이저 광선을 모니터링합니다. </li><li> 이동식 미러 iteratively 따라서 반사 레이저 빔을는 광검출기의 네 quadrants에 의해 균일하게 수신되고 있도록, 최대 신호 (SUM 신호)를 달성하기 위해 광검출기 조정 단자를 사용하는 위치를 조정합니다. </li><li> 시각적으로 거꾸로 현미경으로 시료 표면에 대한 AFM 팁의 접근을 모니터링, retracting 수동 조정 전면 나사에 의해 AFM 팁 및 SPM 스캐너의 동력 다시 조정 나사를 낮춥니다. 세 개의 나사가 이미징 기울어진 샘플에서 유물을 피하기 위해 동일한 수준에 있는지 확인합니다. 샘플 대한 팁을 제공하지만, 너무 가까이 그렇지 팁 처리 또는 시료 표면을 뚫고 나옵니다. </li><li> 이때 레이저 빛이 AFM의 캔틸레버가 광검출기에 이동식 거울에서 반사됩니다 오프 반영. sili와 접촉 AFM 모드죄수 질화 AFM 팁을은 0 V 설정 값과 비교 신호 (수평 / 수직 변화)에 미러의 위치를​​ 조정하여 0 V에 대해 -2 V로 출력 신호 (수직 편향) 전압을 설정합니다. </li><li> Nanoscope 소프트웨어를 사용하여 현미경 아이콘을 클릭하여 해당 프로필 (접촉 모드 AFM)을 선택합니다. </li><li> "스캔 컨트롤 설정"패널을 사용하여 스캔 속도와 스캔 크기 예를 들어, 10 미크론 스캔 크기와 2 Hz에서 스캔 속도를 설정합니다. </li><li> AFM 팁이 관여 - 팁 아이콘을 클릭하여 샘플 표면을 참여하도록 허용합니다. 이것은 샘플 표면을 종사 때까지 SPM 기지 동력 뒤쪽 나사를 조절함으로써, 프로그램은 이제 끝을 낮출 것이다. 제보가 성공적으로 종사되면 검색 프로세스가 자동으로 시작됩니다. </li><li> iteratively 최고를 달성하는 등 설정점, 적분 게인, 비례 게인, 스캔 크기, 스캔 속도, 선 및 샘플 / 라인과 같은 매개 변수를 조정 소프트웨어의 이미지와 범위 모드를 사용하여 스캔 과정을 모니터링해상도 이미지. 대형 Z 축 범위 (데이터 규모)로 스캔 시작, 다음 조심스럽게 이미지 표면 기능의 최고의 대비를 관찰하는 데이터 스케일 값을 줄일 수 있습니다. 표면 기능의 높이가 가능한 Z 축 범위를 초과하는 것으로 나타났습니다 스캔한 이미지의 흰색 영역의 발생을 최소화합니다. </li><li> 데이터 파일을 저장하는 이미지를 캡처, 다음 스캔 라인 사이의 오프셋 수직 (Z) 스캐너 드리프트, 이미지 리본, 그리고 수직으로 인해 이미지 아티팩트를 제거하려면 납작 함수를 사용하여 데이터를 처리, 9 결국 평균 거칠기를 계산. 데이터를 저장 후, 그것을 작동하는 데 사용된 컴퓨터 제어 스크류 모터의 동작을 반대하여 AFM 팁을 접어야합니다. 이미지 처리는 오프라인 이미지 분석 모드 및 / 출연하거나 다른 컴퓨터를 사용하는 경우가 있습니다. </li><li> 스캔 영역의 x와 y 위치를 변경하는 팁 홀더의 전면 하단에 회색의 금속 단자를 사용하여, 그리고 5 샘플 로카에서 측정을 반복tions은 이미지 품질이 세게 나오시면 AFM의 캔틸레버를 교체, 재현성을 확인합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 CPMAS 13 C NMR 스펙트럼의 화학 변화 분석 (그림 3)는 철저하게 dewaxed 토마토 표피 (cutin)에있는 주요 기능 그룹을 식별. cutin biopolyester의 주요 탄소 moieties은 긴 사슬 aliphatics (0-45 PPM), 산소 aliphatics (45-110 PPM), 곱하기 - 보세 및 방향족 (110-160 PPM) 및 carbonyls (160-220 것으로 발견되었습니다 PPM). 산소 알킬 moieties은 (CHO + CH 2 O)함으로써 cutin 모체의 분자 구조를 형성 cutin의 생체 고분자의 monomeric 단위 사이에 공유 결합 관계를 확립에 중요한 역할을한다. 45과 100 PPM 사이의 스펙트럼 영역에서 관찰 상대적인 피크 영역의 차이는 돌연변 cutin 교차 링크 성형 CHO structura의 비교적 큰 비중을 가지고하는 것이 좋습니다 난 moieties가에 비해 야생 형 cutin; 직접적인 분극 (DPMAS) NMR 다섯 가지 방법을 사용하여주의 정량 측정이 추론을 지원 (데이터가 표시되지 않음). CPMAS 13 C NMR 스펙트럼은 또한 cutin 생체 고분자의 주요 화학 구조를 유지하면서 cutin-왁스 복합체에서 에피와 intracuticular 왁스의 순차적인 제거를 나타내는, 31 PPM (그림 4)에서 점차적으로 감소 왁스 피크를 보여주었다. 병렬 AFM 이미지 분석 (그림 5) cuticular 어셈블리의 조직 변경을 나타내는, 과일 표피로부터 에피와 intracuticular 왁스의 stepwise 추출에 의한 표면 부정을 공개했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg"> . 그림 1 Soxhlet 추출기 (이미지 출처 : 위키백과). "/&gt; 그림 2.) 스캐닝 프로브 현미경. B) SPM 헤드 (디지털 인스 트루먼 트에서 제공 AFM 훈련 설명서에서 적응). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg"> 그림 3. 야생 - 타입 (M82) 및 돌연변이로부터 철저하게 dewaxed 빨간색으로 익은 토마토 과일 손톱 (cutins)의 150 MHz의 CPMAS 13 C NMR의 스펙트럼은 (CM15) 화학적으로 resonances을 보여주는 교차 연결된 hydroxyfatty 산의 기능 그룹에 해당 옮겨 보겠습니다 기반은 폴리 에스테르와 일부 증식 접착 moieties. 모든 스펙트럼는 10 kHz에서 회전 주파수와 함께 인수했다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg"> 그림 4. 상업 빨간색 익은 토마토 과일 손톱의 150 MHz의 13 CCPMAS NMR의 스펙트럼은 순서대로 아라비아 고무 기계 추출하여 epicuticular 및 intracuticular 왁스의 제거 및 TW시 작곡 변화를 전시O 분 클로로포름 물놀이, 각각. 모든 스펙트럼는 15 kHz에서 회전 주파수와 함께 인수했다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg"> 그림 5. AFM 이미지 및 부분적으로 dewaxed 상업 토마토에 대한 거칠기 견적 epicuticular (왼쪽)와 intracuticular (오른쪽) 왁스의 stepwise 제거 후 그림 4에 설명되어 손톱.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

프로토콜은 본 파괴적인 화학 분석없이도 복잡한 가공하기 어려운 식물 소재의 상세한 분자와 microscale 특성화 수 있도록 설명했다. 우리는 이기종 cuticular 조화에서 epicuticular 및 intracuticular 왁스의 선택적 제거 절차를 실시하고 모니터링 cuticular 어셈블리의 구조적 조직, 10을 제어 다양한 lipids (왁스)로 cutin의 biopolyester의 블렌딩을 조사합니다. 고체 13 C NMR은 경지 야생 - 타입과 단일 유전자로부터 cutins의 상호 연결 기능을 비교하려면 왁스 분자 구성 요소의 추출을 측정하는 데 사용하고, 원자 힘 현미경은 표면 거칠기에 수반하는 변화를 검토 하였다. 6,11되었다 돌연변이 토마토 과일은 고체 13 C NMR도 CHO과 CH 2 O 화학 moieties의 상대적 숫자를 추정하는 데 사용되었다. 디자인 기능의 개수이 프로토콜의 S는 주목할 수 있습니다. 왁스 자료가 분기하는 극성을 가진 용매의 일련의 과일 표피를 치료, lipids의 넓은 범위를 망라적으로 완전한 dewaxing를 달성하는 것이 필수적이다. 또한, dewaxing 시간은 8 시간 동안의 표피 샘플의 특성에 따라 24 시간이 다를 수 있습니다. 그대로 과일 표피로부터 지속 epicuticular 왁스를 추출하기 위해서는 표면에 균일하게 접착 코팅을 적용하는 필수적입니다. 고체 CPMAS 13 C NMR 12 그들 나라의 물리적 특성을 유지하면서 고도의 이기종 및 불용성 식물 biopolymers의 다양한 구조적 구성 요소를 식별을위한 신속한 질적 방법으로, 13 전통적인 솔루션 상태 NMR 또한 추출된 왁스 섞어 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 기능성 그룹의 양적 추정은 그대로 식물 폴리머, 5 고충 실도 직접 편광 마술 - 각도 회전 (D 대해 원하는 경우PMAS) 13 C NMR 5,14가 상호 보완적인 방법으로 사용해야합니다. 기능성 그룹의 정확한 quantitation는 재활용 시간, 여기 펄스 길이 및 헤테로핵 감결합의 강도주의 최적화가 필요합니다. 15 헤테로핵 감결합가 TPPM 16 또는를 사용하여 50 kHz에서에서 185 kHz에서까지 1 H 필드 강도 설정을 지정할 수도 있습니다 척수 7 방법론. 이러한 매개 변수 외에도 CPMAS 측정의 감도가 스핀 잠금 시간 및 하트만-돼야 해 한이 매칭 조건에 따라 다릅니다. 전통 CPMAS 대신에 15, ramped-진폭 CP (진입로-CP) 기술은 십자가를 최대화하기 위해 구현할 수 스핀 잠금 기간 (또는 그 반대) 동안 지속 13 C 필드 강도의 진폭을 유지하면서 선형적으로 한 H 진폭을 변화 (~ 20-50%) 또는 tangentially별로 편광 효율.에서 CPMAS 측정을 수행 17,18 두 가지 RO 최소토르 - 스피닝 주파수 메인 스펙트럼 봉우리에서 회전 sidebands을 구분하는 필수적입니다. 접촉 모드에서 실시한 동시 AFM 측정 밀랍 성분의 연속 제거하는 동안 인스턴스에 대한 높은 스캔 속도와 고해상도, 19와 표피 표면 상태를 직접 영상을 가능하게합니다. 각각의 경우에 (비 접촉) 모드가 가로 (전단) 세력에 의한 손상을 피할 수 있고 샘플 표면의 부서, 섬세하고 &quot;소프트&quot;식물 재료의 표면 특성에 대한 대안으로 사용될 수 있습니다. 5,20 도청에서 AFM 운영 , 표면에 같은 위치의 여러 이미지의 연속적인 인수 AFM 측정에서 &quot;탐침 - 표면 상호 작용&quot;으로 인한 표면 손상을 식별하기 위해 제공하고 있습니다. 6,21 최적의 재현성을 보려면 소프트 cuticular 표면에 적합한 스프링 상수와 AFM 프로브가 있어야 온도와 습도의 사용, 그리고 비극적가 유지되어야합니다. 6,15,20 </s최대 고체 NMR 반면&gt;는 앙상블 평균 (벌크) 토마토 과일 손톱에있는 속성의 분자 프로파일을 제공하며, 원자 힘 이미징이 정교하게 복잡한 macromolecular 어셈블리의 표면 지형을 추적하기위한 보완적인 비침 투 프로브 22,23을 제공합니다. 1,2은

<table><tbody><tr><td>아세트산 나트륨 삼수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>펙티나아제</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, 냉장 보관</td></tr><tr><td>셀룰라아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, 냉장 보관</td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>매우 위험함</td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model No.G24</td><td>MFG No.M1036-000G</td></tr><tr><td>진공 오븐</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>바리액 컨트롤러</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소결 유리 딤블 (85 mm/25mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>일회용 추출 딤블 (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>글라스 울</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>헥산</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>질소 가스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>킴와이프스</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>아라비아검</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>1.6 mm fastMAS 지르코니아 로터</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR 분광계</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>standard bore magnet</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>CPMAS용 모델 화합물</td></tr><tr><td>글루타민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>CPMAS용 모델 화합물</td></tr><tr><td>아다만탄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>NMR의 90&amp;#x00B0; 펄스 교정용</td></tr><tr><td>다중 모드 주사 프로브 현미경 (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope 소프트웨어</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>AFM 프로브 (비전도성 질화규소 팁)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Model NP-20</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 퍽</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>과일 껍질 제거기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#252;chner 깔때기</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

분리 및 과일 손톱의 biophysical 연구

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

표피, 지상파 식물의 공중 부분에 소수성 보호 계층, 다양한 biotic 및 비생물적 스트레스에 대한 다양한 방어 장벽으로서 기능과 또한 외부 환경으로부터 물의 흐름을 조절 1. biopolyester (cutin)와 긴 사슬 지방산 ( 왁스)은 표피의 주요 구조적 프레임 워크를 형성;. cuticular 레이어의 기능성 무결성 cutin 생체 고분자와 &#39;intracuticular&#39;왁스 2 언급된 구성된 혼합, 우리는 포괄적인 프로토콜을 설명하는 바깥 &#39;epicuticular&#39;계층뿐만 아니라 의존 상업 토마토 (Solanum lycopersicum) 과일 손톱에서 철저하게 왁스를 추출하거나 표피의 합성부터 순차적으로 선택적으로 epicuticular 및 intracuticular 왁스를 제거합니다. Jetter 및 Schäffer (2001)의 방법은 과일 표피로부터 epicuticular 및 intracuticular 왁스의 stepwise 추출을 위해 적응되었다. 3,4가를 모니터링하려면순차 왁스 제거, 고체 교차 편광 마술 앵글 - 방적 과정 (CPMAS) 13 C NMR 분광법이에 대한 정보에 의해 보완 벌크 재료의 분자 수준의 구조 프로파일을 제공 원자 힘 현미경 (AFM)과 병렬로 사용되었다 microscale 지형과 cuticular 표면의 거칠기. 경지 야생 - 타입과 단일 유전자 돌연변이 토마토 열매로부터 dewaxed 손톱의 상호 연결 기능을 평가하기 위해 MAS 13 C NMR은 산소 지방족 (CHO 및 CH 2 O) 화학 moieties의 상대적 비율을 비교하는 데 사용되었다. cutin의 biopolyester의 화학 구조를 보존하면서 극성 변화의 용매의 패널과 stepwise Soxhlet 추출에 의한 철저한 dewaxing은 그들의 지방족 및 방향족의 성분 중 소수성 특성에 따라 왁스 moieties를 분리하는 효율적인 수단을 제공합니다. epicuticular 왁스와 sele의 기계적 추출보완 물리적인 방법론에 의해 모니터링 intracuticular 왁스의 ctive 제거, 표피 어셈블리를 조사하기 위해 전례없는 수단을 제공 :이 접근법은 supramolecular 조직과 왁스의 다양한 유형의 구조적 통합, cutin - 왁스 모체의 아키텍처, 그리고 화학 물질을 드러내 각 성분의 조성. 또한, 고체 13 C NMR은 야생 형 및 돌연변이 빨간색으로 익은 토마토 과일에 대한 CHO 및 CH 2 O 화학 moieties의 상대적 숫자의 차이를 보여준다. NMR 기법은 지문, 불용성 비정질 및 화학적으로 이기종 있습니다 cuticular 물질의 분자 구조에 뛰어난 도구를 제공합니다. 비침 투 표면 선택적 이미징 기법으로서, AFM은 NM-μm의 길이 규모 cuticular 어셈블리의 구조 조직을 알아내기 위해 효과적이고 직접적인 수단을 furnishes.

공중 식물 장기는 표피, supramolecular biopolyester - 왁스 어셈블리의 보호를받습니다. 우리는 고체 NMR 및 원자 힘 현미경에 의한 분자와 마이크로 저울에 토마토 과일 손톱에서의 선택적 제거 에피와 intracuticular 왁스, 각각을 모니터링하고, 공학 cuticular biopolyesters의 가교 능력을 평가하기 위해 프로토콜을 소개합니다.

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

육상 식물의 지상부에 존재하는 소수성 보호층인 큐티클은 다양한 생물적 및...

본 실험에서는 생물물리학적 기술을 사용하여 토마토의 큐티클 및 보호 폴리머의 가교 능력을 평가하고, 과일 큐티클에서 표피 및 내표피 왁스의 선택적 제거를 모니터링합니다. 전체 과일에서 큐티클을 분리하는 것은 토마토 껍질과 부착된 세포벽을 효소 처리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 추출 과정을 통해 과일 큐티클의 왁스를 철저히 제거하여 분리된 큐틴의 분자적 특성 분석을 위한 큐틴을 얻습니다.바이오 폴리에스테르 분석은 고체 상태 핵자기공명법을 통해 수행됩니다. 고체 상태 NMR 스펙트럼 분석 결과, 야생형 및 형질전환 토마토 열매 큐티클의 큐틴에서 가교 결합이 가능한 산소화된 알로파틱 잔기의 상대적 비율에 차이가 있음이 밝혀졌습니다. 또는, 아라비아 고무를 칠하고 벗겨내어 에피큐티클 왁스를 제거한 후, 클로로포름에 담가 열매 큐티클에서 인트라큐티클 왁스를 제거합니다.그 후, 토마토 껍질과 동일한 효소 처리로 분리된 부분적으로 왁스가 제거된 큐티클을 고체 NMR 및 원자간력 현미경을 사용하여 분석합니다. 궁극적으로, NMR 스펙트럼에서 점진적으로 감소하는 왁스 피크와 AFM 이미징으로 관찰되는 과일 큐티클의 표면 프로파일 변화를 통해 에피큐티큘러 및 인트라큐티큘러 왁스가 순차적으로 제거됨을 확인할 수 있습니다. 식물의 지상부 기관은 큐티클이라고 불리는 바이오 폴리에스터 왁스 조립체에 의해 보호됩니다. 본 영상에서는 고체 핵자기 공명과 원자간력 현미경을 사용하여 토마토 과일 큐티클에서 내부 및 외부 왁스의 선택적 제거를 평가하는 프로토콜을 제시하겠습니다.이 방법들은 또한 엔지니어링된 큐티클 재료의 가교 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시연할 사람은 세 명의 Stark 그룹 구성원인 Ishish Chatterjee 박사, 박사 과정 후보생 Shantani Sarkar, 그리고 전 고등학생 Julia Tik입니다. 추가 시연자는 화학 공학 동료인 Alexander 박사 연구실의 박사후 연구원 Olivia Nisau 박사입니다. 토마토 껍질의 효소적 분리를 시작하려면, 상업용 또는 재배된 과일 세 개를 볼에 담고, 껍질을 크게 벗겨낸 뒤 내부 과피 조직은 버립니다.그런 다음 토마토 껍질을 탈이온수로 세척하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 준비한 효소 칵테일에 껍질을 벗긴 토마토 껍질이 완전히 잠기도록 비커에 넣어 보관합니다. 31°C에서 24시간 동안 지속적으로 흔들어주며 배양합니다. 뷰너 funnel 또는 주방용 체를 사용하여 토마토 껍질을 수거하고 탈이온수로 세척합니다.껍질을 상온의 진공 오븐에 1시간 동안 둔 후, 건조된 껍질은 라벨이 부착되고 뚜껑이 닫힌 병에 보관할 수 있습니다. 후속 왁스 제거 절차를 위해, 중앙에 위치한 유리 또는 일회용 딤블의 약 절반을 토마토 큐티클 샘플로 채우고 핀셋을 사용하여 고체상 추출(solid extraction)에 사용할 추출 컬럼 바닥에 조심스럽게 배치하십시오. 서면 프로토콜에 설명된 대로 메탄올 용매를 사용하여 고체상 추출 장치 설정을 계속하십시오.한 시간 동안 과정을 모니터링하며, 리저버에 초당 약 한 방울이 쌓이고 장치 내의 삭스(socks)에서 사이펀 현상이 발생하도록 배리어시(variac) 전압을 조정하십시오. 12시간의 추출 후 심블(thimble)이 가득 차면, 장치를 식힌 다음 가열 맨틀을 내리고 추출기와 리저버를 하나의 단위로 함께 분리하여 추출 후 용매를 폐기하십시오. 컬럼을 기울여 아래쪽 플라스크로 사이펀 배수가 되도록 하십시오.핀셋을 사용하여 딤블을 추출 컬럼의 넥 바로 아래까지 들어 올립니다. 딤블에서 과잉 용매를 배출한 후 깨끗한 표면에 놓습니다. 플라스크를 분리하고 폐액을 라벨이 부착된 용매 수거함에 붓습니다.클로로포름과 텍산과 같이 극성이 점차 낮아지는 연속적인 용매를 사용하여 추출 과정을 각각 12시간 동안 반복합니다. 토마토 큐티클 샘플이 건조되면, 질량을 측정하고 파라필름으로 밀봉한 스크류 캡 병에 담아 실온에 보관합니다. NMR 분석을 위한 샘플 준비를 위해, 공급업체에서 제공한 패킹 도구를 사용하여 큐틴이라 불리는 완전히 탈왁스 처리된 토마토 큐티클 4~6 mg을 1.6 mm fast MAS 지르코니아 로터에 넣습니다.상단 캡을 장착한 후, 회전 속도를 측정할 수 있도록 캡의 절반을 검은색 잉크 마커 펜으로 칠합니다. 고체 NMR 실험의 초기 설정은 기술적으로 까다로운 과정이며, 숙련된 직원의 지도하에 수행되어야 합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 모델 화합물을 사용하여 자기장 균질도를 조정하고 실험 파라미터를 최적화하는 것부터 시작하십시오. 컷팅 및 패킹이 완료된 로터를 프로브에 삽입한 다음, 프로브를 마그넷 안에 배치합니다.회전 속도를 10 kilohertz까지 점진적으로 높여 샘플이 잘 패킹되었는지 확인하고, 로터가 20 hertz 미만의 변동폭으로 안정적으로 회전하는지 검증합니다. 프로브의 튜닝 및 매칭 커패시터를 반복적으로 조정하여 proton 및 carbon 13 NMR 주파수 모두에서 전력 반사가 최소화되도록 합니다. 실험 온도를 25 degrees Celsius로 설정합니다.10 kHz 회전 주파수에서 결정된 Hartman Han 양성자 탄소 매칭 조건에 해당하는 사전 최적화된 CPMA 실험을 시작하십시오. 4,096회의 트랜지언트를 획득한 후, 50~100 Hz의 지수적 선폭 확장(exponential line broadening)으로 스펙트럼을 처리하고 푸리에 변환을 수행하여 ppm 단위의 화학적 차폐 대비 신호 강도로 나타나는 NMR 스펙트럼을 생성하십시오. 본문에 설명된 대로 탄소 13 화학적 이동 값을 참조하십시오.로터 회전 주파수를 15 kilohertz로 높이고, C-P-M-A-S 탄소 13 NMR Spectra의 래더 회전 주파수 화학적 이동 분석에서 결정된 Hartman Han Matching 조건에 해당하는 C-P-M-A-S 측정을 반복합니다. 분석 결과, 완전히 DW 왁스 제거된 토마토 큐티클에 존재하는 주요 작용기로서 장쇄 PHA, 산소화된 PHA, 다중 결합 및 방향족 탄소 수율이 확인되었습니다. 산소화된 알코올은 큐틴 바이오폴리머의 단량체 단위 간에 공유 결합을 형성함으로써 큐틴 매트릭스의 분자 구조를 구축하는 데 결정적인 역할을 합니다.45에서 100 parts per million 사이의 스펙트럼 영역에서 관찰된 상대적 피크 면적의 차이는 돌연변이 큐틴이 야생형 아핀에 비해 가교를 형성하는 CHO 구조 작용기의 비율이 상대적으로 높음을 시사합니다. 에피큐티큘라 왁스와 인트라큐티큘라 왁스의 선택적 분리를 시작합니다.두 번째 묶음의 통토마토를 증류수로 세척합니다. 페이퍼 타월과 Kim wipes로 물기를 제거한 후, 알루미늄 호일 위에 꼭지 부분이 아래로 향하도록 놓습니다. 통토마토의 위쪽부터 아래쪽까지 120% gum Arabic 수용액을 바릅니다.아라비아 고무가 과일 껍질 위에서 1시간 동안 마르도록 두어 얇은 막이 형성되게 합니다. 핀셋을 사용하여 이 막을 제거하되, 토마토 껍질에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오. 본문에 기술된 대로 이 막을 추가 처리하면 표피 큐티클 왁스를 얻을 수 있습니다.토마토의 물리적 형태는 그대로 유지됩니다. 토마토를 클로로포름에 2분 동안 담급니다. 상온에서 용매를 증발시킨 후 큐티클 내부 왁스를 수집하고, 토마토 껍질을 벗긴 뒤 셀룰레이스(cellulase)와 펙티네이트(pectinate) 및 아세트산 나트륨 완충액으로 효소 처리하여 각각 셀룰로오스와 펙틴을 제거합니다.그 후, 앞서 설명한 바와 같이 sali 추출을 수행하여 토마토의 왁스 성분을 완전히 제거할 수 있습니다. C-P-M-A-S 실험은 본문의 설명대로 천연 및 부분적으로 왁스가 제거된 과일 큐티클 샘플을 사용하여 반복할 수 있습니다. 원자 힘 현미경의 설정 과정은 복잡하므로, 초기에는 숙련된 기술진의 감독 하에 수행하는 것이 가장 바람직합니다. 먼저 스캐닝 프로브 현미경(SPM)의 전원을 켜고, 현미경 모드 전환 스위치가 접촉 모드 원자 힘 현미경 모드로 설정되어 있는지 확인하십시오.다음으로, 전면의 사용자 조정 노브 두 개를 돌려 SPM 헤드를 수동으로 올립니다. 헤드 뒷면의 클램핑 나사를 돌려 SPM 헤드에서 AFM 팁 홀더를 분리합니다. 핀셋을 사용하여 홀더에서 기존의 AFM 캔틸레버를 제거합니다.그런 다음 패키지에서 실리콘 질화물 팁이 달린 새 캔틸레버를 조심스럽게 꺼내어 기존 캔틸레버 대신 설치하십시오. 광학 현미경을 사용하여 새로 설치한 FM 캔틸레버가 파손되지 않았는지 확인합니다. 토마토 큐티클 시료를 양면 테이프로 시료 퍽에 부착하십시오.광학 현미경을 사용하여 큐티클 샘플이 평평하고 매끄러운 상태로 유지되는지 확인합니다. 샘플을 퍽(puck) 위에 배치한 후, 퍽에 부착된 토마토 큐티클 샘플을 SPM 스캐너 상단의 자성 영역에 놓습니다. 노브를 돌려 스캐너 전면의 수동 나사 두 개를 AFM 팁이 파손되지 않을 정도로 충분히 높게 설정합니다.팁 홀더를 SPM 헤드에 장착할 때, 전동 후면 나사를 앞쪽의 두 나사와 거의 동일한 높이로 설정하십시오. 팁 홀더를 SPM 헤드에 다시 삽입하고 헤드의 후면 클램핑 나사를 조여 고정하십시오. 레이저를 켠 후, 헤드 상단에 있는 중앙 및 우측 레이저 조절 노브를 사용하여 FM 캔틸레버 상에 레이저 스폿을 정렬하십시오.종이 위에 반사된 레이저 빔을 모니터링하여 레이저 스폿이 FM 캔틸레버의 끝단에 정확히 위치하도록 조정하십시오. 합산 신호가 최대가 되도록 레이저 스폿의 위치를 조정하십시오. 이동식 거울을 수평 및 수직으로 조정하여 포토 검출기 상의 반사 레이저 스폿 위치를 조절함으로써, 입사광이 4개의 사분면에 균일하게 수신되도록 하십시오.사용자가 조절하는 전면 나사와 SPM 스캐너의 전동 후면 나사를 후퇴시켜 검출기가 FM 팁을 내립니다. 도립 현미경을 통해 FM 팁이 시료 표면으로 접근하는 것을 시각적으로 모니터링하십시오. 세 개의 나사가 모두 동일한 높이에 있는지 확인하십시오.기울어진 샘플의 이미징으로 인한 아티팩트를 방지하려면, 팁을 샘플 쪽으로 이동시키되 샘플 표면에 닿거나 표면을 파괴할 정도로 너무 가깝게 접근하지 않도록 합니다. A FM 캔틸레버에서 반사된 레이저 광은 이동 가능한 거울을 거쳐 광민감성 검출기로 전달되며, 이는 질화규소 A FM 프로브를 이용한 접촉 A FM 모드에서 작동합니다. 거울의 위치를 조정하여 출력 신호 전압을 0 V 설정점(setpoint)에 대해 -2 V로 설정하고, 차동 신호를 0 V로 설정합니다.nano scope 소프트웨어를 사용합니다. 현미경 아이콘을 클릭하고 적절한 프로필을 선택합니다. 스캔 제어 설정 패널을 사용하여 스캔 속도와 스캔 크기를 설정합니다.팁 결합 아이콘을 클릭하여 AFM 팁이 샘플 표면에 접촉하도록 합니다. 프로그램이 SPM 베이스의 전동 백 스크루를 제어하여 팁이 샘플 표면에 접촉할 때까지 낮춥니다. 팁 결합이 성공적으로 완료되면 스캐닝 프로세스가 자동으로 시작됩니다.소프트웨어의 이미지 모드와 스코프 모드를 모두 사용하여 스캐닝 과정을 모니터링하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 반복적으로 파라미터를 조정하여 최고 해상도의 이미지를 얻으십시오. 예를 들어, 처음에는 큰 Z축 데이터 스케일 값으로 스캐닝을 시작하십시오. 그 후, Z 데이터 스케일 값을 조심스럽게 줄여 이미지 상의 표면 특징이 가장 잘 대비되도록 하십시오.데이터 파일을 저장하기 위해 이미지를 캡처하십시오. 수직 스캐너 드리프트로 인한 이미지 휨 및 스캔 라인 간의 수직 오프셋으로 인해 발생하는 이미지 아티팩트를 제거하기 위해 플래트닝 함수를 사용하여 데이터를 처리하십시오. 마지막으로, 평균 거칠기 탄소를 계산하십시오.13 C-P-M-A-S-N-M-R 스펙트럼 분석 결과, 31 parts per million에서 왁스 피크가 점진적으로 감소하는 것이 나타났으며, 이는 큐틴 바이오폴리머의 주요 화학적 구조를 유지하면서 큐티클 및 왁스 복합체로부터 외큐티클 및 내큐티클 왁스가 순차적으로 제거되었음을 나타냅니다. FM 이미지 분석에서는 과일 큐티클로부터 외큐티클 왁스와 내큐티클 왁스가 단계적으로 추출됨에 따라 표면 불규칙성이 드러났으며, 이는 큐티클 조립 구조의 변화를 의미합니다. 이 기술을 숙달하면, 토마토 과일 큐티클로부터 외큐티클 및 내큐티클 왁스를 순차적으로 제거하는 과정을 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.과일 큐티클의 철저한 추출을 위해 용매 추출을 수행할 때는 접촉 노드를 사용한 후 다양한 극성을 가진 용매 패널을 사용하는 것이 중요합니다. 여기에 FM 프로토콜이 설명되어 있습니다. 추가적인 FM 실험을 통해 큐티클의 표면 탄성을 측정할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 큐틴-왁스 복합체에서 성분을 체계적으로 분리하는 방법과 고체 NMR 및 AFM을 사용하여 각각 큐티클 물질의 분자 구조 분석 및 신속한 표면 검사를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 영상에서 설명하는 기술을 통해 식물 생물학 연구자들은 천연 및 공학적 식물 조직의 분자 조성과 초분자 구조를 결정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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