분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

본 실험에서는 생물물리학적 기술을 사용하여 토마토의 큐티클 및 보호 폴리머의 가교 능력을 평가하고, 과일 큐티클에서 표피 및 내표피 왁스의 선택적 제거를 모니터링합니다. 전체 과일에서 큐티클을 분리하는 것은 토마토 껍질과 부착된 세포벽을 효소 처리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 추출 과정을 통해 과일 큐티클의 왁스를 철저히 제거하여 분리된 큐틴의 분자적 특성 분석을 위한 큐틴을 얻습니다.

바이오 폴리에스테르 분석은 고체 상태 핵자기공명법을 통해 수행됩니다. 고체 상태 NMR 스펙트럼 분석 결과, 야생형 및 형질전환 토마토 열매 큐티클의 큐틴에서 가교 결합이 가능한 산소화된 알로파틱 잔기의 상대적 비율에 차이가 있음이 밝혀졌습니다. 또는, 아라비아 고무를 칠하고 벗겨내어 에피큐티클 왁스를 제거한 후, 클로로포름에 담가 열매 큐티클에서 인트라큐티클 왁스를 제거합니다.

그 후, 토마토 껍질과 동일한 효소 처리로 분리된 부분적으로 왁스가 제거된 큐티클을 고체 NMR 및 원자간력 현미경을 사용하여 분석합니다. 궁극적으로, NMR 스펙트럼에서 점진적으로 감소하는 왁스 피크와 AFM 이미징으로 관찰되는 과일 큐티클의 표면 프로파일 변화를 통해 에피큐티큘러 및 인트라큐티큘러 왁스가 순차적으로 제거됨을 확인할 수 있습니다. 식물의 지상부 기관은 큐티클이라고 불리는 바이오 폴리에스터 왁스 조립체에 의해 보호됩니다. 본 영상에서는 고체 핵자기 공명과 원자간력 현미경을 사용하여 토마토 과일 큐티클에서 내부 및 외부 왁스의 선택적 제거를 평가하는 프로토콜을 제시하겠습니다.

이 방법들은 또한 엔지니어링된 큐티클 재료의 가교 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시연할 사람은 세 명의 Stark 그룹 구성원인 Ishish Chatterjee 박사, 박사 과정 후보생 Shantani Sarkar, 그리고 전 고등학생 Julia Tik입니다. 추가 시연자는 화학 공학 동료인 Alexander 박사 연구실의 박사후 연구원 Olivia Nisau 박사입니다. 토마토 껍질의 효소적 분리를 시작하려면, 상업용 또는 재배된 과일 세 개를 볼에 담고, 껍질을 크게 벗겨낸 뒤 내부 과피 조직은 버립니다.

그런 다음 토마토 껍질을 탈이온수로 세척하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 준비한 효소 칵테일에 껍질을 벗긴 토마토 껍질이 완전히 잠기도록 비커에 넣어 보관합니다. 31°C에서 24시간 동안 지속적으로 흔들어주며 배양합니다. 뷰너 funnel 또는 주방용 체를 사용하여 토마토 껍질을 수거하고 탈이온수로 세척합니다.

껍질을 상온의 진공 오븐에 1시간 동안 둔 후, 건조된 껍질은 라벨이 부착되고 뚜껑이 닫힌 병에 보관할 수 있습니다. 후속 왁스 제거 절차를 위해, 중앙에 위치한 유리 또는 일회용 딤블의 약 절반을 토마토 큐티클 샘플로 채우고 핀셋을 사용하여 고체상 추출(solid extraction)에 사용할 추출 컬럼 바닥에 조심스럽게 배치하십시오. 서면 프로토콜에 설명된 대로 메탄올 용매를 사용하여 고체상 추출 장치 설정을 계속하십시오.

한 시간 동안 과정을 모니터링하며, 리저버에 초당 약 한 방울이 쌓이고 장치 내의 삭스(socks)에서 사이펀 현상이 발생하도록 배리어시(variac) 전압을 조정하십시오. 12시간의 추출 후 심블(thimble)이 가득 차면, 장치를 식힌 다음 가열 맨틀을 내리고 추출기와 리저버를 하나의 단위로 함께 분리하여 추출 후 용매를 폐기하십시오. 컬럼을 기울여 아래쪽 플라스크로 사이펀 배수가 되도록 하십시오.

핀셋을 사용하여 딤블을 추출 컬럼의 넥 바로 아래까지 들어 올립니다. 딤블에서 과잉 용매를 배출한 후 깨끗한 표면에 놓습니다. 플라스크를 분리하고 폐액을 라벨이 부착된 용매 수거함에 붓습니다.

클로로포름과 텍산과 같이 극성이 점차 낮아지는 연속적인 용매를 사용하여 추출 과정을 각각 12시간 동안 반복합니다. 토마토 큐티클 샘플이 건조되면, 질량을 측정하고 파라필름으로 밀봉한 스크류 캡 병에 담아 실온에 보관합니다. NMR 분석을 위한 샘플 준비를 위해, 공급업체에서 제공한 패킹 도구를 사용하여 큐틴이라 불리는 완전히 탈왁스 처리된 토마토 큐티클 4~6 mg을 1.6 mm fast MAS 지르코니아 로터에 넣습니다.

상단 캡을 장착한 후, 회전 속도를 측정할 수 있도록 캡의 절반을 검은색 잉크 마커 펜으로 칠합니다. 고체 NMR 실험의 초기 설정은 기술적으로 까다로운 과정이며, 숙련된 직원의 지도하에 수행되어야 합니다. 서면 프로토콜에 설명된 대로 모델 화합물을 사용하여 자기장 균질도를 조정하고 실험 파라미터를 최적화하는 것부터 시작하십시오. 컷팅 및 패킹이 완료된 로터를 프로브에 삽입한 다음, 프로브를 마그넷 안에 배치합니다.

회전 속도를 10 kilohertz까지 점진적으로 높여 샘플이 잘 패킹되었는지 확인하고, 로터가 20 hertz 미만의 변동폭으로 안정적으로 회전하는지 검증합니다. 프로브의 튜닝 및 매칭 커패시터를 반복적으로 조정하여 proton 및 carbon 13 NMR 주파수 모두에서 전력 반사가 최소화되도록 합니다. 실험 온도를 25 degrees Celsius로 설정합니다.

10 kHz 회전 주파수에서 결정된 Hartman Han 양성자 탄소 매칭 조건에 해당하는 사전 최적화된 CPMA 실험을 시작하십시오. 4,096회의 트랜지언트를 획득한 후, 50~100 Hz의 지수적 선폭 확장(exponential line broadening)으로 스펙트럼을 처리하고 푸리에 변환을 수행하여 ppm 단위의 화학적 차폐 대비 신호 강도로 나타나는 NMR 스펙트럼을 생성하십시오. 본문에 설명된 대로 탄소 13 화학적 이동 값을 참조하십시오.

로터 회전 주파수를 15 kilohertz로 높이고, C-P-M-A-S 탄소 13 NMR Spectra의 래더 회전 주파수 화학적 이동 분석에서 결정된 Hartman Han Matching 조건에 해당하는 C-P-M-A-S 측정을 반복합니다. 분석 결과, 완전히 DW 왁스 제거된 토마토 큐티클에 존재하는 주요 작용기로서 장쇄 PHA, 산소화된 PHA, 다중 결합 및 방향족 탄소 수율이 확인되었습니다. 산소화된 알코올은 큐틴 바이오폴리머의 단량체 단위 간에 공유 결합을 형성함으로써 큐틴 매트릭스의 분자 구조를 구축하는 데 결정적인 역할을 합니다.

45에서 100 parts per million 사이의 스펙트럼 영역에서 관찰된 상대적 피크 면적의 차이는 돌연변이 큐틴이 야생형 아핀에 비해 가교를 형성하는 CHO 구조 작용기의 비율이 상대적으로 높음을 시사합니다. 에피큐티큘라 왁스와 인트라큐티큘라 왁스의 선택적 분리를 시작합니다.

두 번째 묶음의 통토마토를 증류수로 세척합니다. 페이퍼 타월과 Kim wipes로 물기를 제거한 후, 알루미늄 호일 위에 꼭지 부분이 아래로 향하도록 놓습니다. 통토마토의 위쪽부터 아래쪽까지 120% gum Arabic 수용액을 바릅니다.

아라비아 고무가 과일 껍질 위에서 1시간 동안 마르도록 두어 얇은 막이 형성되게 합니다. 핀셋을 사용하여 이 막을 제거하되, 토마토 껍질에 구멍이 나지 않도록 주의하십시오. 본문에 기술된 대로 이 막을 추가 처리하면 표피 큐티클 왁스를 얻을 수 있습니다.

토마토의 물리적 형태는 그대로 유지됩니다. 토마토를 클로로포름에 2분 동안 담급니다. 상온에서 용매를 증발시킨 후 큐티클 내부 왁스를 수집하고, 토마토 껍질을 벗긴 뒤 셀룰레이스(cellulase)와 펙티네이트(pectinate) 및 아세트산 나트륨 완충액으로 효소 처리하여 각각 셀룰로오스와 펙틴을 제거합니다.

그 후, 앞서 설명한 바와 같이 sali 추출을 수행하여 토마토의 왁스 성분을 완전히 제거할 수 있습니다. C-P-M-A-S 실험은 본문의 설명대로 천연 및 부분적으로 왁스가 제거된 과일 큐티클 샘플을 사용하여 반복할 수 있습니다. 원자 힘 현미경의 설정 과정은 복잡하므로, 초기에는 숙련된 기술진의 감독 하에 수행하는 것이 가장 바람직합니다. 먼저 스캐닝 프로브 현미경(SPM)의 전원을 켜고, 현미경 모드 전환 스위치가 접촉 모드 원자 힘 현미경 모드로 설정되어 있는지 확인하십시오.

다음으로, 전면의 사용자 조정 노브 두 개를 돌려 SPM 헤드를 수동으로 올립니다. 헤드 뒷면의 클램핑 나사를 돌려 SPM 헤드에서 AFM 팁 홀더를 분리합니다. 핀셋을 사용하여 홀더에서 기존의 AFM 캔틸레버를 제거합니다.

그런 다음 패키지에서 실리콘 질화물 팁이 달린 새 캔틸레버를 조심스럽게 꺼내어 기존 캔틸레버 대신 설치하십시오. 광학 현미경을 사용하여 새로 설치한 FM 캔틸레버가 파손되지 않았는지 확인합니다. 토마토 큐티클 시료를 양면 테이프로 시료 퍽에 부착하십시오.

광학 현미경을 사용하여 큐티클 샘플이 평평하고 매끄러운 상태로 유지되는지 확인합니다. 샘플을 퍽(puck) 위에 배치한 후, 퍽에 부착된 토마토 큐티클 샘플을 SPM 스캐너 상단의 자성 영역에 놓습니다. 노브를 돌려 스캐너 전면의 수동 나사 두 개를 AFM 팁이 파손되지 않을 정도로 충분히 높게 설정합니다.

팁 홀더를 SPM 헤드에 장착할 때, 전동 후면 나사를 앞쪽의 두 나사와 거의 동일한 높이로 설정하십시오. 팁 홀더를 SPM 헤드에 다시 삽입하고 헤드의 후면 클램핑 나사를 조여 고정하십시오. 레이저를 켠 후, 헤드 상단에 있는 중앙 및 우측 레이저 조절 노브를 사용하여 FM 캔틸레버 상에 레이저 스폿을 정렬하십시오.

종이 위에 반사된 레이저 빔을 모니터링하여 레이저 스폿이 FM 캔틸레버의 끝단에 정확히 위치하도록 조정하십시오. 합산 신호가 최대가 되도록 레이저 스폿의 위치를 조정하십시오. 이동식 거울을 수평 및 수직으로 조정하여 포토 검출기 상의 반사 레이저 스폿 위치를 조절함으로써, 입사광이 4개의 사분면에 균일하게 수신되도록 하십시오.

사용자가 조절하는 전면 나사와 SPM 스캐너의 전동 후면 나사를 후퇴시켜 검출기가 FM 팁을 내립니다. 도립 현미경을 통해 FM 팁이 시료 표면으로 접근하는 것을 시각적으로 모니터링하십시오. 세 개의 나사가 모두 동일한 높이에 있는지 확인하십시오.

기울어진 샘플의 이미징으로 인한 아티팩트를 방지하려면, 팁을 샘플 쪽으로 이동시키되 샘플 표면에 닿거나 표면을 파괴할 정도로 너무 가깝게 접근하지 않도록 합니다. A FM 캔틸레버에서 반사된 레이저 광은 이동 가능한 거울을 거쳐 광민감성 검출기로 전달되며, 이는 질화규소 A FM 프로브를 이용한 접촉 A FM 모드에서 작동합니다. 거울의 위치를 조정하여 출력 신호 전압을 0 V 설정점(setpoint)에 대해 -2 V로 설정하고, 차동 신호를 0 V로 설정합니다.

nano scope 소프트웨어를 사용합니다. 현미경 아이콘을 클릭하고 적절한 프로필을 선택합니다. 스캔 제어 설정 패널을 사용하여 스캔 속도와 스캔 크기를 설정합니다.

팁 결합 아이콘을 클릭하여 AFM 팁이 샘플 표면에 접촉하도록 합니다. 프로그램이 SPM 베이스의 전동 백 스크루를 제어하여 팁이 샘플 표면에 접촉할 때까지 낮춥니다. 팁 결합이 성공적으로 완료되면 스캐닝 프로세스가 자동으로 시작됩니다.

소프트웨어의 이미지 모드와 스코프 모드를 모두 사용하여 스캐닝 과정을 모니터링하고, 서면 프로토콜에 기술된 대로 반복적으로 파라미터를 조정하여 최고 해상도의 이미지를 얻으십시오. 예를 들어, 처음에는 큰 Z축 데이터 스케일 값으로 스캐닝을 시작하십시오. 그 후, Z 데이터 스케일 값을 조심스럽게 줄여 이미지 상의 표면 특징이 가장 잘 대비되도록 하십시오.

데이터 파일을 저장하기 위해 이미지를 캡처하십시오. 수직 스캐너 드리프트로 인한 이미지 휨 및 스캔 라인 간의 수직 오프셋으로 인해 발생하는 이미지 아티팩트를 제거하기 위해 플래트닝 함수를 사용하여 데이터를 처리하십시오. 마지막으로, 평균 거칠기 탄소를 계산하십시오.

13 C-P-M-A-S-N-M-R 스펙트럼 분석 결과, 31 parts per million에서 왁스 피크가 점진적으로 감소하는 것이 나타났으며, 이는 큐틴 바이오폴리머의 주요 화학적 구조를 유지하면서 큐티클 및 왁스 복합체로부터 외큐티클 및 내큐티클 왁스가 순차적으로 제거되었음을 나타냅니다. FM 이미지 분석에서는 과일 큐티클로부터 외큐티클 왁스와 내큐티클 왁스가 단계적으로 추출됨에 따라 표면 불규칙성이 드러났으며, 이는 큐티클 조립 구조의 변화를 의미합니다. 이 기술을 숙달하면, 토마토 과일 큐티클로부터 외큐티클 및 내큐티클 왁스를 순차적으로 제거하는 과정을 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

과일 큐티클의 철저한 추출을 위해 용매 추출을 수행할 때는 접촉 노드를 사용한 후 다양한 극성을 가진 용매 패널을 사용하는 것이 중요합니다. 여기에 FM 프로토콜이 설명되어 있습니다. 추가적인 FM 실험을 통해 큐티클의 표면 탄성을 측정할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 큐틴-왁스 복합체에서 성분을 체계적으로 분리하는 방법과 고체 NMR 및 AFM을 사용하여 각각 큐티클 물질의 분자 구조 분석 및 신속한 표면 검사를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 영상에서 설명하는 기술을 통해 식물 생물학 연구자들은 천연 및 공학적 식물 조직의 분자 조성과 초분자 구조를 결정할 수 있습니다.