성장 팩터 Progranulin와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 수정된 효모 - 2 하이브리드 시스템

이 MY two H 시스템은 기존의 효모 이중 잡종법(yeast two hybrid) 프로토콜을 개선하여 위양성(false positives)의 수를 현저히 줄여줍니다. 먼저, 베이트 플라스미드를 효모에 소규모로 형질전환하십시오. 경쟁적 억제제 스크리닝을 사용하여 베이트 구조물을 검증한 후, minus four 플레이트에서 cDNA 라이브러리를 스크리닝하십시오.

XGL 및 반응 분석을 통해 양성 클론을 검증하십시오. 그 후, DNA 시퀀싱과 생물정보학 분석을 통해 상호작용 가능성이 있는 단백질을 식별하십시오. 최종적으로, 이 수정된 효모 이중 잡종 시스템은 스크리닝 과정의 효율성과 성공률을 유의미하게 향상시킵니다.

전통적인 효모 이중 하이브리드 시스템은 위양성을 생성하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 본 영상에서는 이중 하이브리드 상호작용 검출 효율을 유의미하게 개선한 수정된 스크리닝 절차를 보여드립니다. 그럼 시작하겠습니다.

MAV 2 0 3의 5 mL overnight 배양액을 50 mL의 YPD에 접종합니다. 30 °C에서 2~4시간 동안 배양합니다. 그 다음 원심분리를 통해 효모를 수확하고, 한 번 세척한 후 펠렛을 2 mL의 솔루션 1에 재현탁하여 상온에서 10분 동안 배양합니다.

형질전환을 위한 DNA 혼합물을 준비합니다. 효모 세포 100 µL를 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 용액 2 700 µL를 넣고 잘 섞습니다.

먼저 30 °C에서 30분 동안 배양한 후, 열 충격을 줍니다. 원심분리를 통해 세포를 수확하고 펠렛을 200 µL의 오토클레이브 멸균 증류수에 재현탁합니다. 현탁액을 단계 희석하여 SD LU 플레이트에 도말하고 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다. 이 단계는 베이트 플라스미드가 전사를 활성화하는지, 그리고 이러한 자가 활성화가 his3 유전자 산물의 경쟁적 억제제인 3-AT와 같은 억제제에 의해 중화될 수 있는지를 확인하는 과정입니다.

먼저, bait 플라스미드를 MAV 2 0 3 효모에 형질전환합니다. 반응물을 SD LU 플레이트에 도말하고 30 °C에서 배양합니다. 3-AT에 의해 유도된 자가 활성화를 확인하기 위해 콜로니를 스크리닝하려면, 오토클레이브 처리된 이쑤시개를 사용하여 각 형질전환 콜로니를 농도가 증가하는 3-AT가 포함된 SD LU hiss 플레이트에 패치하고 30 °C에서 배양합니다.

100 millimolar 3-AT가 포함된 플레이트에서 성장하는 베이트 균주는 re의 투하이브리드 스크리닝에 부적합하므로 제거합니다. 남은 베이트의 경우, 세포 성장을 억제하는 가장 낮은 3-AT 농도를 선택하여 CD NA 라이브러리 스크리닝에 사용하며, 베이트 플라스미드를 함유한 효모의 분리된 콜로니 여러 개를 100 microliters의 오토클레이브 멸균 증류수에 현탁합니다. 이를 두 개의 10 centimeter SD LU 플레이트에 도말합니다.

두 플레이트를 30°C에서 배양합니다. 세포를 긁어내어 10 mL에 완전히 현탁시킵니다. 증류수를 고압 증기 멸균하고 500 mL의 액체 YPD 배지를 접종합니다.

스펙트럼, 광도 측정 및 30 °C 배양을 통해 세포 밀도를 확인합니다. 원심분리를 통해 세포를 수확하십시오. 100 mL의 오토클레이브 멸균 증류수로 한 번 세척하고, 50 mL의 용액 1로 한 번 더 세척합니다.

그 다음 펠렛을 2.5 milliliters의 용액 1에 재현탁합니다. 이제 변성된 전단성 연어 정자 DNA와 cDNA 라이브러리를 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 40% polyethylene glycol이 포함된 용액 2를 15 milliliters 추가합니다.

살살 섞은 후 700 µL씩 25개의 멸균 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 나누어 담고, 30 °C 항온수조에서 30분 동안 배양한 다음, 42 °C 항온수조에서 15분 동안 열 충격 처리를 합니다.

원심분리를 통해 세포를 수확한 후, 각 펠렛을 400 µL의 오토클레이브 멸균 증류수에 조심스럽게 재현탁합니다. 각 형질전환 혼합물을 두 개의 선택 배지에 도말하고 30 °C에서 5~10일 동안 배양하여 반응 플레이트의 형질전환 효율을 대조군으로 추정합니다. 한 가지 반응물에 대해 연속 희석을 수행합니다.

30°C에서 3일 동안 배양한 후, 전체 콜로니 수를 측정합니다. 콜로니를 YPD 플레이트로 옮겨 30°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 공기 방울이 생기지 않도록 주의하며 원형 니트로셀룰로오스 막을 YPD 플레이트 위에 직접 올립니다.

1분 후, 모든 콜로니가 멤브레인으로 옮겨졌는지 확인합니다. 콜로니가 있는 면이 위로 향하도록 멤브레인을 알루미늄 호일 보트에 놓고 액체 질소 표면에 20초 동안 띄웁니다. 그 다음, 액체 질소에 몇 분간 담급니다.

이제 해동을 위해 막을 제거하십시오. 그동안 신선한 XCA 용액 층이 있는 Whatman 용지가 깔린 페트리 접시를 준비합니다. 그런 다음 해동된 막을 조심스럽게 담그고 37 °C에서 배양하십시오.

청색 콜로니가 나타날 때까지 기다립니다. 먹이, 클론 및 베이트 구조물을 효모로 재구성하면 위양성을 더욱 제거할 수 있습니다. 먼저, 상호작용하는 단백질을 포함하고 있을 가능성이 있는 효모 균주에서 플라스미드 DNA를 분리하십시오.

DNA를 e coli DH5α에 형질전환하고 LB ampicillin 플레이트에서 배양하여 선택합니다. 제한효소 분석을 통해 형질전환체를 스크리닝합니다. 이제 prey 및 bait 플라스미드를 효모 MAV 2 0 3에 공동 형질전환하고 SC LU trip 플레이트에 도말하여 30°C에서 2~3일 동안 배양합니다.

xal 분석 시퀀스를 수행하기 위해 서로 다른 세 개의 콜로니를 선택하고, 양성 클론에서 플라스미드 DNA를 추출하여 생물정보학을 이용해 유전자를 식별합니다. 본 실험에서는 뇌 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 미끼(bait)로 뇌 성장 인자인 Granulin을 사용하여 54개의 양성 클론을 얻었습니다.

250만 개의 형질전환체 중에서 후보군을 분리하였습니다. pro granulin 베이트를 사용하여 형질전환체를 스크리닝하였습니다. ex skull 어세이를 통한 추가 분석 결과, pro granulin 베이트에 대해 23개의 양성 클론 후보가 확인되었습니다.

흥미롭게도, 시퀀싱 데이터의 생물정보학적 분석을 통해 TNF R2가 확인되었습니다. 실제로 추가적인 기능 실험을 통해 progranulin이 TNF 수용체의 새로운 리간드임이 입증되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 관심 있는 염기를 사용하여 이 변형된 hybrid screen을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

일부 사용 영역에 위험 요소가 있으므로 반드시 장갑을 착용하고 작업하시기 바랍니다. 실험의 성공을 빕니다.