마우스 폐에 돌기 세포의 분리

본 절차의 전체적인 목표는 고순도로 정제된 마우스 폐 수지상 세포 준비물을 얻는 것입니다. 이는 먼저 배출 림프절을 제외하고 폐 조직을 수집함으로써 수행됩니다. 그 다음, 콜라게나제 소화를 통해 단일 세포 부유액을 얻습니다.

다음 단계는 자기 세포 분리 시스템을 사용하여 CD 11 C 양성 세포를 농축하는 것입니다. 이제 유세포 분석 세포 분류법을 통해 상습 수지상 세포 하위 집단을 분리합니다. 최종적으로, 생쥐 폐 조직에서 분리된 상습 수지상 세포를 유세포 분석 및 광학 현미경으로 분석할 수 있습니다.

이 방법은 호흡기 내 선천성 면역 및 감염성 질환에서 전통적 수지상 세포 서브셋의 역할은 무엇인가와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 절차는 제 연구실의 연구원인 Issa Lancelin과 제가 시연하겠습니다. 마우스를 안락사시킨 후, 복막의 외피를 절개하고 조심스럽게 뒤로 당겨 흉강을 노출시키는 것으로 시작합니다.

늑골을 절단하여 횡격막을 열고 심장과 폐를 모두 노출시킵니다. 심장과 폐가 노출되면 관류 절차를 시작할 수 있습니다. 5 mL 주사기에 E-D-T-A-H-B-S-S를 채우고 주사기에 25 gauge 바늘을 연결합니다.

그다음 주입 중 누출을 방지하기 위해 우심실에 바늘을 삽입하십시오. 포셉을 사용하여 바늘 주변의 심근 조직을 고정합니다. 그런 다음 일정한 압력을 유지하면서 용액을 천천히 주입하십시오.

정확한 관류가 이루어지면 폐가 팽창하며 색상이 분홍색 또는 흰색으로 변합니다. 잠재적인 오염을 방지하기 위해 배출 림프절을 제거하여 폐기하십시오. 그 다음 폐 조직을 채취하여 절제한 장기를 얼음 위의 페트리 접시에 옮깁니다. gentle max C 튜브에 5 mL의 폐 콜라게나제 소화액을 채운 후, 폐를 작은 조각으로 다집니다.

면도날을 사용하여 조직을 튜브로 옮기고 가볍게 최대 해리(max dissociation)를 수행합니다. 단일 세포 현탁액을 얻으려면 program M lung zero one을 선택하십시오. 그런 다음 샘플을 37 °C에서 30분 동안 배양하며, 5분마다 튜브를 흔들어 조직 F 파편을 재현탁한 후 program M lung zero two를 진행하십시오.

이제 샘플을 15 milliliter 원심분리관으로 옮기고 4 °C에서 335 ×g로 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛에 2 milliliters의 CK 용해 버퍼를 가하여 실온에서 1분 동안 남은 적혈구를 용해합니다. 그 후 0.5% BSA가 첨가된 차가운 PBS 13 milliliters로 세포를 세척합니다.

상층액을 제거한 후, 이 펠릿을 5 mL의 차가운 PBS 및 BSA 혼합액에 다시 현탁하고, 세포 용액을 100 µm 나일론 메쉬에 통과시킵니다. 마지막으로, trypan blue 배제법을 통해 총 세포 수를 측정합니다. GentleMACS 해리 장치를 사용하는 대신, 폐 한 개당 5 mL의 collagenase 용액을 15 mL 원추형 튜브에 채웁니다.

잘게 자른 폐 조직을 튜브에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 조직 파편들이 다시 섞이도록 15분마다 세포를 볼텍싱합니다. 그런 다음 20 gauge 바늘이 연결된 3 mL 주사기로 샘플을 6~8회 통과시켜 소화된 조직을 파쇄합니다.

과정 중에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 먼저, 단일 세포 현탁액을 4°C에서 200 ×g로 10분 동안 원심분리하여 세척한 후 상층액을 제거합니다. 그다음 세포를 400 µL의 분리 완충액에 재현탁합니다.

0.5 µg의 anti CD 1632 항체를 사용하여 총 8x10⁸개의 세포에 대해 FC 매개 비특이적 항체 결합을 차단하였으며, 4 °C에서 30분 동안 6x10⁸개의 세포를 처리하였습니다. 10 mL의 차가운 분리 버퍼로 세포를 세척한 후, 400 µL의 분리 버퍼에 세포를 다시 부유시킵니다. 그런 다음 총 8x10⁸개의 세포에 100 µL의 CD 11 C 마이크로비즈를 첨가하고 잘 혼합한 뒤, 세포와 비즈 혼합액을 냉장고에서 15분 동안 배양합니다.

10 mL의 차가운 분리 버퍼로 결합되지 않은 비드를 제거한 후, 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1 mL의 차가운 분리 버퍼에 다시 현탁합니다. 마지막으로, 샘플을 AutoMax pro 분리기에 로딩하고 P-O-S-S-E-L-D 프로그램을 실행하여 CD 11 C 발현 세포 분획을 수집합니다.

농축된 CD 11 C 양성 세포 현탁액을 anti CD 11 C PEI seven 및 해당 세포에 존재하는 MHC Class Two 분자 표적 항체와 함께 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 차가운 PBS plus BSA로 세포를 세척한 후, 0.5 milliliters의 PBS plus BSA로 세포를 재현탁하고 40 micrometer 나일론 메쉬 필터에 통과시킵니다. 마지막으로, 정제된 CD 11 C 양성 세포를 별도의 빈 튜브에 옮겨 담아 이후 정량을 위해 fax tube에 추가합니다.

정제된 세포의 손상을 방지하기 위해 5 mL 수집 튜브에 PBS 및 BSA 혼합액 100 µL를 넣고, 필터링된 세포 현탁액을 FACS로 분리하며, 세포 분리 과정 전반에 걸쳐 수집된 세포를 냉장 온도로 유지하십시오. 이 밀도 도표(density plot)에서 비장 내의 전통적 수지상 세포 수는 폐에서 발견되는 수보다 3배 이상 많습니다. 또한, 폐의 CD11c 양성 세포에는 전통적 수지상 세포 게이트 외부의 MHC Class II low 이벤트 그룹으로 나타나는, 전통적 수지상 세포가 아닌 세포 집단이 포함되어 있습니다.

이 밀도 도표의 왼쪽 그림에서 보는 바와 같이, CD11c 자성 분리를 통해 전체 폐 세포 중 conventional dendritic cell의 비율이 약 1.5%에서 약 16.5%로 증가합니다. 하지만 CD11c 양성 MHC Class II low macrophage가 여전히 전체 세포 집단의 70% 이상을 차지하고 있어, 분리 과정의 이 단계에서는 농축된 폐 conventional dendritic cell 하위 집단의 순도가 상당히 오염된 상태입니다. 그러나 FACS로 분리하면 오른쪽 상단 현미경 사진에서 보는 것처럼 conventional dendritic cell의 순도가 96% 이상으로 향상됩니다. CD11c high MHC Class II high conventional dendritic cell은 전형적인 수지상 돌기를 가진 둥근 세포인 반면, 오른쪽 하단 현미경 사진에 보이는 CD11c high MHC Class II low 세포는 대식세포 형태의 전형적인 특징인 세포 돌기를 나타냅니다.

이 절차를 수행할 때는 폐 조직과 단일 세포 준비물을 지시된 온도로 유지하며 취급하는 것이 중요합니다. 이는 세포 생존율을 보존하고 일반적인 수지상 세포 수율을 확보하는 데 결정적이기 때문입니다. 이 영상을 시청하고 나면 마우스 폐에서 수지상 세포 하위 집단을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

폐 수지상 세포 하위 집합의 분리는 호흡기 병원체 및 폐의 숙주 면역 반응을 유발할 수 있는 환경 요인에 반응하는 이러한 세포들의 기능에 대한 통찰력을 얻기 위한 매우 유용한 도구가 됩니다.