마우스 폐에 돌기 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 고도로 정제된 마우스 폐 수지상 세포 제제를 얻는 것입니다. 이것은 배출되는 림프절을 포함하지 않고 먼저 폐 조직을 수집함으로써 달성됩니다. 그런 다음 콜라겐 분해 효소 분해에 의해 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

다음 단계는 자기 세포 분리 시스템을 사용하여 CD 11 C 양성 세포를 농축하는 것입니다. 이제 기존의 수지상 세포 하위 집합은 유세포 분석 세포 분류에 의해 분리됩니다. 궁극적으로, 마우스 폐 조직에서 분리된 기존의 수지상 세포는 유세포 분석과 광학 현미경으로 분석할 수 있습니다.

이 방법은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다음과 같은 질문, 예를 들어 기존 수지상 세포 하위 집합이 호흡기의 선천성 면역 및 감염성 질환에 어떤 영향을 미치는지? 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 Issa Lancelin과 저입니다. 쥐를 안락사시킨 후 먼저 복막의 바깥쪽 피부를 자르고 부드럽게 당겨 흉강을 노출시킵니다.

흉곽을 절단하여 횡격막을 열어 심장과 폐를 모두 노출시킵니다. 심장과 폐가 노출되면 관류 절차를 시작할 수 있습니다. 5ml 주사기에 E-D-T-A-H-B-S-S를 채우고 25 게이지 바늘을 주사기에 연결합니다.

그런 다음 주사 중 누출을 방지하기 위해 바늘을 오른쪽 심실에 삽입합니다. 집게를 사용하여 바늘 주위의 심근 조직을 고정합니다. 그런 다음 일정한 압력을 유지하면서 용액을 부드럽게 주입합니다.

정확한 관류는 폐 팽창을 일으키고 잠재적인 오염을 우회하고 배출 림프절을 제거 및 폐기하기 위해 분홍색 또는 흰색으로 색상을 변경합니다. 그런 다음 폐 조직을 채취하여 절제된 장기를 얼음 위의 페트리 접시로 옮깁니다. 부드러운 맥스 C 튜브에 5ml의 폐 콜라겐분해효소 소화액을 채운 다음 폐를 작은 조각으로 자릅니다.

면도날을 사용하여 부드러운 최대 해리를 사용하여 조직을 튜브로 옮깁니다. 단일 세포 현탁액을 얻으려면 프로그램 M lung zero one을 선택합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양하고 5분마다 튜브를 흔들어 조직 F 조각을 재현탁시킨 다음 M 폐 제로 2 프로그램을 진행합니다.

이제 샘플을 15ml 원추형 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 335배 G로 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버리고 2ml의 CK 용해 완충액을 펠릿에 첨가하여 1분 동안 순 실온에서 나머지 적혈구를 용해합니다. 그런 다음 0.5%BSA가 보충된 13ml의 차가운 PBS로 세포를 세척합니다.

수프라 나틴을 버린 후, 이 펠릿을 5ml의 차가운 PBS와 BSA에 다시 현탁시킨 다음 100마이크로미터 나일론 메쉬에 셀 용액을 통과시킵니다. 마지막으로 trian blue exclusion으로 총 셀 번호를 결정합니다. 완만한 최대 해리를 사용하는 대신 15ml 원뿔형 튜브에 폐당 5ml의 콜라겐분해효소 용액을 채웁니다.

잘게 썬 폐 조직을 튜브에 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 폐 조직을 배양합니다. 조직 조각을 다시 회전시키기 위해 15분마다 세포를 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 20 게이지 바늘에 연결된 3 밀리리터 주사기에 샘플을 6-8 회 통과시켜 소화 조직을 파괴합니다.

이 과정에서 거품을 만들지 마십시오. 먼저 단세포 현탁액을 섭씨 4도에서 200배 G로 10분 동안 세척하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 400마이크로리터의 분리 완충액에 세포를 재현탁합니다.

여덟 번째 총 세포가 0.5마이크로그램의 항 CD 1632 항체를 사용하여 FC 매개 비특이적 항체 결합을 차단하는 척하고, 섭씨 4도에서 30분 동안 6개의 세포를 가장합니다. 10ml의 냉간 분리 완충액으로 세포를 세척한 후 reus는 400마이크로리터의 분리 완충액에 세포를 현탁시킵니다. 그런 다음 CD 11 C 마이크로 비드 100 마이크로 리터를 첨가하고 여덟 번째 총 세포를 가장하고 잘 혼합하여 세포와 비드 용액을 냉장고에서 15 분 동안 배양합니다.

10ml의 냉분리 완충액으로 결합되지 않은 비드를 제거한 후 상등액을 버리고 1ml의 냉간 분리 완충액에 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 마지막으로 AutoMax pro 분리기에 샘플을 로드하고 P-O-S-S-E-L-D 프로그램을 실행합니다. 세포 분획을 발현하는 CD 11 C를 수집한다.

농축된 CD 11 C 양성 세포 현탁액을 항 CD 11 C PEI 7 및 이러한 세포에 존재하는 MHC Class Two 분자에 대한 항체와 함께 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다. 차가운 PBS plus BSA로 세포를 세척한 후 세포와 PBS plus BSA 0.5ml를 재현탁하고 40마이크로미터 나일론 메쉬 필터에 통과시킵니다. 마지막으로, 정제된 CD 11 C 양성 세포를 팩스 튜브에 추가하여 나중에 별도의 블랭크 튜브에서 정량화합니다.

정제된 세포의 손상을 방지하고 여과된 세포 현탁액을 사실별로 분류하기 위해 100마이크로리터의 PBS와 BSA를 5mL 수집 튜브에 첨가하여 세포 분류 프로세스 전반에 걸쳐 수집된 세포를 냉장 온도로 유지합니다. 이 밀도 그래프에는 비장에서 발견되는 기존의 수지상 세포가 폐에 있는 세포보다 3배 이상 많습니다. 또한, 폐에서 CD 11 C 양성 세포는 종래의 수지상 세포 게이트 외부의 MHC 클래스 2 낮은 이벤트 그룹으로 표시되는 바와 같이 종래의 수지상 세포가 아닌 세포 집단을 포함한다.

이 밀도 그래프에서 볼 수 있듯이 그림의 왼쪽에서 CD 11 C, 전체 폐 세포의 자기 분리는 기존 수지상 세포 수를 전체 세포의 약 1.5%에서 약 16.5%로 증가시킵니다.그러나 CD 11 C 양성 MHC 클래스 2 낮은 매크로 파스는 여전히 전체 세포 인구의 70% 이상을 차지하여 이 단계에서 농축된 폐 기존 수지상 세포 하위 집합의 순도를 크게 오염시킵니다. 격리 과정. 그러나 팩스로 분류하면 오른쪽 상단 마이크로 사진에서 볼 수 있듯이 기존의 수지상 세포 순도가 96% 이상으로 향상됩니다. CD 11 C high MHC Class 2 high conventional dendritic cell은 전형적인 수상돌기를 가진 둥근 세포인 반면, 오른쪽 하단 마이크로 사진에서 볼 수 있는 CD 11 C high MHC class 2 low cell은 대식세포 형태학에서 보다 전형적인 세포 돌기를 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안 표시된 온도에서 폐 조직과 단세포 제제를 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이는 세포 생존율과 기존의 수지상 세포 수율을 보존하는 데 매우 중요하기 때문입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 폐에서 수지상 세포 부분 집합을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

폐 수지상 세포 부분 집합의 분리는 폐에서 숙주 면역 반응을 유발할 수 있는 호흡기 병원체 및 환경 요인에 대한 반응으로 이러한 세포의 기능에 대한 통찰력을 얻는 데 매우 유용한 도구입니다.