Name: 마우스 폐에 돌기 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 마우스 폐에서 전통적 수지상 세포를 고순도로 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 자기 세포 분리, 유세포 분류를 통해 면역학 연구에 필수적인 세포 준비물을 얻을 수 있습니다.

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저자 microphotographs 그의 도움을 셀 정렬과 피터 Mottram 함께 그녀의 도움 LSU의 유동세포계측법 코어 시설에서 마릴린 디트리히에 감사드립니다. 이 작품은 비행 수행자 의학 연구소, LSU 경쟁력 연구 프로그램 수상, 그리고 NIH / NIAID 기금 P20 RR020159 및 R03AI081171에 의해 후원되었다.

1. 폐 재관류 및 단일 세포 현탁액 <ol><li> 대퇴 정맥을 통해 intraperitoneal 케타민을 / xylazine 마취 혼합물의 주입 (MG / 마우스 케타민을 1.8, xylazine 0.19) 및 과다와 마우스를 안락사 </li><li> 절단하고 부드럽게 복막의 바깥쪽 피부를 다시 당겨 흉강을 폭로. 심장과 폐 모두 노출 갈빗대 절단하여 다이어프램을 열 진행합니다. </li><li> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - HBSS (칼슘 / 마그네슘없는 HBSS에 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 가득 5 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 폐가 Perfuse. 25 G 바늘을 연결하고 우심실에 바늘을 삽입합니다. 주사하는 동안 누출을 방지하기 위해, 집게를 사용하여 바늘 주위 myocardiac 조직을 확보. 상수 압력을 유지하면서 부드럽게 솔루션을 주입. 정확한 재관류는 폐암의 인플레이션과 분홍색 / 흰색 색상의 변화가 발생합니다. </li><li> 이 조직에서 잠재적인 오염을 폐기하기 위해 림프절을 배수 제거합니다. </li><li> 수집폐 조직은 얼음에 페트리 접시에 전송하고, 면도날을 사용하여 작은 조각으로 썰어. </li><li> 5 ML / collagenase의 소화 솔루션의 폐를 포함하는 gentleMACS C 관에 근거 조직을 전송 (collagenase 유형 1A 0.5 MG / ML 플러스 유형 IV 소 췌장 DNase 20 5% FBS, 100 U / ML 페니실린과 100 μg이 포함된 HBSS에 μg / ML ML의 스트렙토 마이신) /. </li><li> 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 gentleMACS의 dissociator을 사용합니다. m_lung_01 : 프로그램을 선택합니다. 30 분 37 ° C에서 샘플을 품어. 관에게 조직 조각을 resuspend 위해 5 분마다 흔들어. 프로그램 m_lung_02 진행합니다. </li><li> 4 335 X g에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 샘플을 전송 ° C. 이 단계 후, 4 시에 시약 및 centrifugations을 유지 ° C가 세포 생존의 감소를 방지합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 실온에서 1 분 ACK lysing 버퍼 2 ML을 추가하여 나머지 적혈구를 lyse. 13 세포를 씻으십시오4 335 X g에서 10 분 동안 차가운 PBS/0.5 %의 BSA와 원심 분리기 ° C.의 ML </li><li> 차가운 PBS/0.5 %의 BSA 5 ML에 뜨는, resuspend 총 세포를 버리고 100 μm의 나일론 메쉬를 철저하게 전달합니다. </li><li> trypan 파랑 제외 염료를 사용하여 전체 휴대폰 번호를 확인합니다. </li></ol> 2. 자기 고립과 CD11c + 세포의 농축 <ol><li> 4 ° C에서 200 X g에서 10 분간 단일 세포 현탁액을 원심 분리기와 뜨는 폐기. </li><li> 10 8 전체 세포마다 분리 버퍼 400 μl에 Resuspend 세포 펠렛 (PBS, 0.5 % BSA, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)). 4 30 분 anti-CD16/CD32 항체 (0.5μg / 10 6 셀)를 사용하여 바인딩을 차단 FC - 중재 unspecific 항체 ° C. </li><li> 4 200 X g에서 10 분 동안 차가운 분리 버퍼와 원심 분리기 10 ML과 세포를 씻으 ° C. 분리 버퍼 400 μl의 세포를 Resuspend. </li><li> 10 8 회 CD11c MicroBeads 100 μl 추가 </&gt; 전체 세포를 먹어 볼래요. 잘 섞어 냉장고에 15 분 (2-8 ° C)를 품어. </li><li> 4 ° C에서 200 X g에서 10 분 동안 차가운 분리 버퍼와 원심 분리기 10 ML과 세포를 씻고 뜨는 폐기. </li><li> 감기 분리 버퍼 3 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 프로그램 posseld를 선택하여 autoMACS 프로 TM 구분 기호를 사용하여 자기 분리를 수행합니다. 긍정적인 분율 (0.5 ML)를 수집합니다. </li></ol> 3. 기존 돌기 세포 (CDC) 격리 <ol><li> 반 CD11c PE - Cy7 및 anti-IA/IE (MHC - II) FITC 항체 30 분 동안 4 ° C.와 함께 품어 풍부한 CD11c 양성 세포 현탁액 항체의 최적화된 농도는 세포의 0.5 μg / 10 6입니다. </li><li> 4 335 X g에서 10 분 동안 차가운 PBS/0.5 %의 BSA와 원심 분리기 ° C.로 세포를 씻어 Resuspend PBS/0.5 %의 BSA의 0.5 ML의 세포와 40 μm의 나일론 메쉬을 통해 전달합니다. </li><li> 로 이동순결 모드에서 FACS의 아리아 셀 분류기를 사용하여 세포를 정렬합니다. 정화 세포의 손상을 방지하기 위해 수집 튜브에 PBS/0.5 %의 BSA 100 μl를 추가합니다. 셀 정렬 과정에 걸쳐 냉장 온도에서 세포 보관하십시오. </li></ol> 4. 단일 세포 현탁액 및 CD11c + 세포 농축을 얻기위한 대체 프로토콜 <ol><li> gentleMACS의 dissociator의 교체에서 단계 1.5에서 접지된 폐 조직은 37 ° C.에서 1 시간 동안 폐암과 부화 당 collagenase 솔루션의 5 ML을 포함한 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다 와동은 세포 매 15 분 조직 조각을 resuspend하기 위해서. 에서 밖으로 20 G 바늘에 연결된 3 ML의 주사기를 통해 샘플에게 6-8 번 통과하여 조직을 중단. 과정에서 거품을 만들어 피하십시오, 달리 세포 생존이 위험해질 것입니다. 단일 세포 현탁액이 얻어되면 1.8 단계로 진행합니다. </li><li> AutoMACSPro TM separa의 교체에토르, CD11c 세포의 강화를위한 자기 절연은 또한 두 맥 컬럼을 통해 수동으로 세포 현탁액을 전달하여 수행할 수 있습니다. 해당 컬럼의 선택은 샘플 크기에 따라 달라집니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 폐 CDC는 CD11c 하이 / MHC - II 안녕하세요 셀룰라 인구로 구분됩니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 1, CDC는 비장 (4.8 %) 등의 다른 조직에 비해 1.4 %의 적은 비율을 나타냅니다. 그러나, 비장과는 달리, 폐 CD11c 양성 세포는 CDC보다 다른 세포 인구를 포함하여, MHC - II의 다른 양의 표현한다. 단일 셀 준비 후, 총 폐 세포의 세포 수율은 3.8-3.0에 대해 조금있는에서 1 % 이상 60-70%의 가능성과 함께 X 10 7 세포 / 폐암은 CDC의 하위 집합을 표현했다. 이 비율은 전체 폐암 CDC가 약 10 T를 증가했던 CD11c 자성 분리 후 증가되었습니다원래 준비 (그림 2A)에서 imes (&gt; 16 %). 그러나, MHC - II (CD11c 하이 / MHC - II 이오, macrophages)의 낮은 금액을 표현하는 CD11c 세포가 폐 CDC 집합과 혼합되었다 높은 오염 세포 인구 (&gt; 70 %) 대표. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 2B, 그 세포는 CDC 순도가&gt; 96 %에 도달 셀 정렬 단계 이후에 제거했다. 전체 절차 이후에 CDC의 일반적인 수율은 5 X 10 4 셀 / 폐되었습니다. Microphotographs은 전형적인 dendrites (상단 패널)와 둥근 세포로 CDC의 형태학의 특성을 보여줍니다. 한편, CD11c 안녕하세요 / MHC - II 소호 macrophages (MΦ, 낮은 패널) 12 전형적인 세포 protuberances를 보여줍니다 morphologically 다른 하위 집합을 나타낸다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> 마우스 폐와 비장 그림 1. 차동 DC 주파수. 폐C57BL / 6 마​​우스에서 차 비장 조직을 collagenase와 수집 치료를했다. collagenase의 소화 다음, 세포는 반 마우스 CD11c - PE - Cy7 및 안티 마우스 IA / IE - FITC로 얼룩진했다. 대표 유동세포계측법의 플롯은 폐와 비장의 CDC의 비율 (CD11c 하이 / MHC - II 안녕)를 보여줍니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> 그림 2. 마우스 폐에서 CDC의 분리. 마우스 폐 단일 세포 현탁액을 방지 CD11c microbeads으로 표시하고 자동으로 셀 분리 통과.) 대표 줄거리는 CDC의 비율 (CD11c 하이 / MHC - II 안녕)를 보여 주며되었습니다 Macrophages (MΦ, CD11c 안녕하세요 / MHC - II 싸다) CD11c 농축 후 인구. 농축 분율의 추가 얼룩 방지 - 마우스 CD11c - PE - Cy7 및 안티 마우스 IA / IE - FITC을 사용하여 따라갔다. 이중 긍정 세포 분류와 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 에자신의 형태를 확인, 세포가 수정 라이트 ​​- Giemsa의 얼룩과 cytospun과 스테인드되었습니다. B) 대표 플롯은 CDC의 비율과 셀 정렬 후 MΦ을 보여줍니다. Microphotographs는 폐 질병 통제 센터와 폐 MΦ의 대표 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm의.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

폐 마우스 DC의 격리가 호흡기 자극의 다양한 연구를위한 중요한 기술이다. 이러한 세포를 얻는 과정은 세포의 손실뿐만 아니라 세포 생존과 정결을 방지 중요한 단계를 포함하고 있습니다. 수령 전에 폐가 Perfusing 것은 물론 오염 물질을 감소 적혈구와 같은 주변 세포를 제거하는 데 도움이 될 것입니다. 폐 다수의 처리 때 자동 분리의 사용 advanteogus 수있다 그렇지 않으면 수동으로 완료되면 collagenase는 소화 후 조직의 분산이 부드럽게 수행되어야한다는 것을 염두에 유지, 대체 프로토콜을 선택할 수 있습니다. 폐 조직의 잠복기는 collagenase 솔루션 동안 지정된 부화 시간 이상 연장해서는 안됩니다. 이 단계 후에, 나머지 과정은 세포 사망을 줄이기 위해 얼음처럼 차가운 버퍼 및 냉장 원심 분리기를 사용하여 수행할 수 있어야합니다. 오염 적혈구의 용해 더 t 반복하지 말았어야 할 단계입니다두 번 한 전체 과정. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 통과, 지정된 단계에서 세포 분류기의 막히는뿐만 아니라 세...

<table width="200" border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> ACK lysing 버퍼 </td><td> Invitrogen </td><td> D6 - 0005DG </td><td></td></tr><tr><td> 안티 마우스 CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5,580,979 </td><td> PE - Cy7 복합 </td></tr><tr><td> 안티 마우스 IA / IE (269) </td><td> BD - Pharmingen </td><td> 553,623 </td><td> 복합 FITC </td></tr><tr><td> Collangenase 입력 1A </td><td> 시그마 </td><td> 9891 - 500MG </td><td></td></tr><tr><td> 세포 strainers </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) Microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 시그마 </td><td> D5025 - 150KU </td><td></td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 14,170 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes 버퍼 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시 60mm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 351,016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C 튜브 </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> 젠틀 맥에서의 dissociator </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS - PRO ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS 아리아 </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

폐암 돌기 세포 (DC)는 호흡기 tolerogenic 응답의 제어뿐만 아니라 3 침입 병원균 1,2를 감지의 근본적인 역할을한다. 폐암 돌기 세포 중 적어도 세 가지 주요 하위 집합은 생쥐에서 설명되었습니다 : 종래의 DC (CDC) 4, plasmacytoid DC (PDC) 5 IFN 생산 킬러 DC (IKDC) 6,7. CDC 집합은 폐 8 가장 유명한 DC의 하위 집합입니다. DC의 하위 집합을 식별하는 것으로 알려진 일반적인 마커는 CD11c, 유형 I 또한, monocytes, macrophages, neutrophils 및 일부 B 세포 9 표현 transmembrane 인테 그린 (β2)입니다. 일부 조직에서는, 마우스 DC를 식별하는 마커로 CD11c를 사용하면 대부분의 CD11c + 세포가 주요 histocompatibility 복잡한 클래스 II (MHC - II)의 높은 수준을 표현 CDC의 하위 집합을 나타냅니다 비장에 같은 유효합니다. 그러나, 폐는 더 이질적인 조직입니다사이드 DC의 하위 집합은 MHC - II의 낮은 수준의 한판 승부 CD11c 높은 수준을 표현 뚜렷한 세포 인구의 높은 비율 있습니다. 의 특성과 대부분 F4/80, 지라 대식 세포 표지 자사의 표현에 따르면, CD11c 하이 MHC - II 그런 건 폐 전지 인구가 잠재적인 DC 전구체 11로, 폐동맥 macrophages 최근 10으로 확인되었습니다. 마우스 PDC 대조적으로, 폐의 면역 반응에 CDC의 특정 역할의 연구는 이러한 세포의 격리에 도움이 될 특정 마커의 부족으로 인해 제한되었습니다. 따라서,이 작품에서 우리는 고도로 정제된 마우스 폐 질병을 분리하는 절차를 설명합니다. 폐 DC의 하위 집합의 분리는 호흡기 병원균뿐만 아니라 폐의 호스트 면역 반응을 일으킬 수있다 환경 요인에 대한 응답에서 이러한 세포의 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 매우 유용한 도구를 나타냅니다.

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

폐 수지상세포(DC)는 침입하는 병원균을 감지하는 것 1,2뿐만 아니라 ...의 면역 관용 반응을 조절하는 데 3 필수적인 역할을 합니다.

본 절차의 전체적인 목표는 고순도로 정제된 마우스 폐 수지상 세포 준비물을 얻는 것입니다. 이는 먼저 배출 림프절을 제외하고 폐 조직을 수집함으로써 수행됩니다. 그 다음, 콜라게나제 소화를 통해 단일 세포 부유액을 얻습니다.다음 단계는 자기 세포 분리 시스템을 사용하여 CD 11 C 양성 세포를 농축하는 것입니다. 이제 유세포 분석 세포 분류법을 통해 상습 수지상 세포 하위 집단을 분리합니다. 최종적으로, 생쥐 폐 조직에서 분리된 상습 수지상 세포를 유세포 분석 및 광학 현미경으로 분석할 수 있습니다.이 방법은 호흡기 내 선천성 면역 및 감염성 질환에서 전통적 수지상 세포 서브셋의 역할은 무엇인가와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실험 절차는 제 연구실의 연구원인 Issa Lancelin과 제가 시연하겠습니다. 마우스를 안락사시킨 후, 복막의 외피를 절개하고 조심스럽게 뒤로 당겨 흉강을 노출시키는 것으로 시작합니다.늑골을 절단하여 횡격막을 열고 심장과 폐를 모두 노출시킵니다. 심장과 폐가 노출되면 관류 절차를 시작할 수 있습니다. 5 mL 주사기에 E-D-T-A-H-B-S-S를 채우고 주사기에 25 gauge 바늘을 연결합니다.그다음 주입 중 누출을 방지하기 위해 우심실에 바늘을 삽입하십시오. 포셉을 사용하여 바늘 주변의 심근 조직을 고정합니다. 그런 다음 일정한 압력을 유지하면서 용액을 천천히 주입하십시오.정확한 관류가 이루어지면 폐가 팽창하며 색상이 분홍색 또는 흰색으로 변합니다. 잠재적인 오염을 방지하기 위해 배출 림프절을 제거하여 폐기하십시오. 그 다음 폐 조직을 채취하여 절제한 장기를 얼음 위의 페트리 접시에 옮깁니다. gentle max C 튜브에 5 mL의 폐 콜라게나제 소화액을 채운 후, 폐를 작은 조각으로 다집니다.면도날을 사용하여 조직을 튜브로 옮기고 가볍게 최대 해리(max dissociation)를 수행합니다. 단일 세포 현탁액을 얻으려면 program M lung zero one을 선택하십시오. 그런 다음 샘플을 37 °C에서 30분 동안 배양하며, 5분마다 튜브를 흔들어 조직 F 파편을 재현탁한 후 program M lung zero two를 진행하십시오.이제 샘플을 15 milliliter 원심분리관으로 옮기고 4 °C에서 335 ×g로 10분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠렛에 2 milliliters의 CK 용해 버퍼를 가하여 실온에서 1분 동안 남은 적혈구를 용해합니다. 그 후 0.5% BSA가 첨가된 차가운 PBS 13 milliliters로 세포를 세척합니다.상층액을 제거한 후, 이 펠릿을 5 mL의 차가운 PBS 및 BSA 혼합액에 다시 현탁하고, 세포 용액을 100 µm 나일론 메쉬에 통과시킵니다. 마지막으로, trypan blue 배제법을 통해 총 세포 수를 측정합니다. GentleMACS 해리 장치를 사용하는 대신, 폐 한 개당 5 mL의 collagenase 용액을 15 mL 원추형 튜브에 채웁니다.잘게 자른 폐 조직을 튜브에 넣고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 조직 파편들이 다시 섞이도록 15분마다 세포를 볼텍싱합니다. 그런 다음 20 gauge 바늘이 연결된 3 mL 주사기로 샘플을 6~8회 통과시켜 소화된 조직을 파쇄합니다.과정 중에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 먼저, 단일 세포 현탁액을 4°C에서 200 ×g로 10분 동안 원심분리하여 세척한 후 상층액을 제거합니다. 그다음 세포를 400 µL의 분리 완충액에 재현탁합니다.0.5 µg의 anti CD 1632 항체를 사용하여 총 8x10⁸개의 세포에 대해 FC 매개 비특이적 항체 결합을 차단하였으며, 4 °C에서 30분 동안 6x10⁸개의 세포를 처리하였습니다. 10 mL의 차가운 분리 버퍼로 세포를 세척한 후, 400 µL의 분리 버퍼에 세포를 다시 부유시킵니다. 그런 다음 총 8x10⁸개의 세포에 100 µL의 CD 11 C 마이크로비즈를 첨가하고 잘 혼합한 뒤, 세포와 비즈 혼합액을 냉장고에서 15분 동안 배양합니다.10 mL의 차가운 분리 버퍼로 결합되지 않은 비드를 제거한 후, 상층액을 버리고 세포 펠릿을 1 mL의 차가운 분리 버퍼에 다시 현탁합니다. 마지막으로, 샘플을 AutoMax pro 분리기에 로딩하고 P-O-S-S-E-L-D 프로그램을 실행하여 CD 11 C 발현 세포 분획을 수집합니다.농축된 CD 11 C 양성 세포 현탁액을 anti CD 11 C PEI seven 및 해당 세포에 존재하는 MHC Class Two 분자 표적 항체와 함께 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 차가운 PBS plus BSA로 세포를 세척한 후, 0.5 milliliters의 PBS plus BSA로 세포를 재현탁하고 40 micrometer 나일론 메쉬 필터에 통과시킵니다. 마지막으로, 정제된 CD 11 C 양성 세포를 별도의 빈 튜브에 옮겨 담아 이후 정량을 위해 fax tube에 추가합니다.정제된 세포의 손상을 방지하기 위해 5 mL 수집 튜브에 PBS 및 BSA 혼합액 100 µL를 넣고, 필터링된 세포 현탁액을 FACS로 분리하며, 세포 분리 과정 전반에 걸쳐 수집된 세포를 냉장 온도로 유지하십시오. 이 밀도 도표(density plot)에서 비장 내의 전통적 수지상 세포 수는 폐에서 발견되는 수보다 3배 이상 많습니다. 또한, 폐의 CD11c 양성 세포에는 전통적 수지상 세포 게이트 외부의 MHC Class II low 이벤트 그룹으로 나타나는, 전통적 수지상 세포가 아닌 세포 집단이 포함되어 있습니다.이 밀도 도표의 왼쪽 그림에서 보는 바와 같이, CD11c 자성 분리를 통해 전체 폐 세포 중 conventional dendritic cell의 비율이 약 1.5%에서 약 16.5%로 증가합니다. 하지만 CD11c 양성 MHC Class II low macrophage가 여전히 전체 세포 집단의 70% 이상을 차지하고 있어, 분리 과정의 이 단계에서는 농축된 폐 conventional dendritic cell 하위 집단의 순도가 상당히 오염된 상태입니다. 그러나 FACS로 분리하면 오른쪽 상단 현미경 사진에서 보는 것처럼 conventional dendritic cell의 순도가 96% 이상으로 향상됩니다. CD11c high MHC Class II high conventional dendritic cell은 전형적인 수지상 돌기를 가진 둥근 세포인 반면, 오른쪽 하단 현미경 사진에 보이는 CD11c high MHC Class II low 세포는 대식세포 형태의 전형적인 특징인 세포 돌기를 나타냅니다.이 절차를 수행할 때는 폐 조직과 단일 세포 준비물을 지시된 온도로 유지하며 취급하는 것이 중요합니다. 이는 세포 생존율을 보존하고 일반적인 수지상 세포 수율을 확보하는 데 결정적이기 때문입니다. 이 영상을 시청하고 나면 마우스 폐에서 수지상 세포 하위 집단을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.폐 수지상 세포 하위 집합의 분리는 호흡기 병원체 및 폐의 숙주 면역 반응을 유발할 수 있는 환경 요인에 반응하는 이러한 세포들의 기능에 대한 통찰력을 얻기 위한 매우 유용한 도구가 됩니다.

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

이 문서에서 우리는 murine 주민 폐 mesenchymal 줄기 세포 (MSC 폐), 그들의 확장, 특성화 및 immunomodulatory 속성의 분석의 절연을 보여줍니다.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

여기서는 자세하게 마우스 장 돌기 세포 (DC가)와 macrophages의 급속한 분리를위한 방법론. 창자 DCS 및 macrophages의 Phenotypic 특성은 세포 정렬 뒤에 자석 구슬 농축은 기능적 연구를위한 매우 순수 인구를 얻을하는 데 사용하는 동안 멀티 컬러 플로우에게 cytometric 분석을 사용하여 수행됩니다.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

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우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

Monocyte 파생 된 DC (MoDC) 위험 관련 된 분자의 작은 금액을 느낄 수 및 따라서 쉽게 끝났다. 우리는 혈액과 종양과 그들의 조기 활성화를 피하기 위해 고려해 야 하는 주요 조치를 강조 하면서 면역성이 있는 복합물으로 그들의 활성화에서 MoDC의 격리에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.

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여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.

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이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

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자사는 자기 비드 기반 T 세포 농축 및 펩타이드:주요 조직 적합성 복합체(MHC) 사량체를 통해 쥐 폐에서 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 분리하고 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

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Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

배우세요 마우스 폐에서 전통적 수지상 세포를 고순도로 분리하는 방법을. 콜라게나제 소화와 자기 세포 분리, 유세포 분류를 통해 면역학 연구에 필수적인 세포 준비물을 얻을 수 있습니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

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