대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

소포 막을 통한 펩타이드 전위를 정량화하기 위해, 트립신이 캡슐화된 형광 표지 지질 소포를 생성합니다. 외부 트립신의 활성을 억제하기 위해 트립신 억제제를 첨가하여 소포 내강에만 활성 트립신이 남도록 합니다.

형광 표지된 펩타이드가 소낭(vesicle)에 첨가되었을 때만, 펩타이드의 형광 태그가 FRET 공여체로 작용하여 소낭의 형광 분자를 들뜨게 합니다. 그러나 단백질이 막을 통과하면 트립신(trypsin)에 의해 분해되어 FRET 신호가 소실됩니다. 분광 분석을 통해 펩타이드 전이 정도를 확인할 수 있으며, 이는 시간이 경과함에 따라 소낭과 펩타이드 사이의 FRET 감소로 나타납니다.

다른 지질 소포 기술과 세포 내 펩타이드 진입 측정 방법을 포함한 다른 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 막 진입의 역학에 대한 정보를 제공하며, 펩타이드에 트립토판이 포함되어 있는 경우 형광 표지를 추가할 필요가 없다는 점입니다. 이 방법은 효과적인 막 전이를 위해 어떤 특성이 필요한지와 같은 막 활성 펩타이드의 설계 및 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 분석을 위한 세포막 모사체로 사용할 거대 단일층 지질 소포(UUVs)를 준비하는 것입니다.

먼저 클로로포름 내에서 phosphatidylcholine, phosphatidyl, glycerol 및 dimethyl amino naphthalene-one sul phyl phosphatidyl ethanolamine을 50:45:5 비율로 혼합합니다. 일반적으로 단일 실험 또는 대조군 시험에 충분한 양의 소포를 만들기 위해 0.376 mg의 총 지질을 사용합니다.

하나의 바이알은 실험군 샘플로, 다른 하나는 대조군으로 준비하고 질소 가스 흐름을 이용하여 클로로포름을 증발시킵니다. 이 단계 후에 남은 건조된 지질을 지질 케이크라고 합니다. 진공 데시케이터에서 지질 케이크를 9~14시간 동안 건조시킵니다.

다음으로, 10 mM HEI 스톡 용액, 0.4 mM 돼지 트립신 스톡 및 4.0 mM Bowman Burke 트립신 억제제 스톡을 준비하십시오. 준비를 위한 세부 사항은 첨부 문서에서 확인할 수 있습니다. 건조된 지질 케이크에 0.4 mM 트립신 스톡과 10 mM HEI 버퍼 용액을 동일한 부피로 첨가하십시오. 그런 다음 바이알을 볼텍싱하여 다중층 소포(multilamellar vesicles, MVs)를 재구성하십시오. 대조군 MV를 재구성하려면 건조된 지질 케이크에 0.4 mM 트립신 스톡과 4.0 mM 트립신 억제제를 동일한 부피로 첨가한 후 이전과 동일하게 볼텍싱하십시오.

MLV가 재구성되면, 유리 바이알의 MLV 용액을 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 액체 질소와 30 °C 항온수조를 번갈아 사용하여 MLV 용액을 5회 동결-해동 사이클에 노출시킵니다. 이어서 Heiss Buffer로 두 개의 필터 지지체를 적셔 지질 압출기를 준비합니다.

그 다음, 각각을 습윤된 테플론 압출기 조각 위에 올리고, 두 테플론 압출기 조각 사이에 0.1 micron 공극의 nucleo pore track etched membrane을 배치합니다. 이제 압출기 조각들을 금속 압출기 캐니스터 내부에 넣고, 두 압출기 조각 위에 도넛형 스페이서를 배치합니다. 압출기 캐니스터의 금속 상단을 조인 후, 250 microliter 유리 주사기를 사용하여 홀더에 거치합니다.

소포체 시료의 손실을 방지하기 위해 익스트루더 빈(extruder void)을 10 mM HEPES 완충액 500 µL로 채웁니다. 시료를 10 mL 비커로 옮깁니다.

그 후 각 MLV 샘플을 압출기에 넣고 멤브레인을 통해 샘플을 최소 21회 통과시킵니다. 압출 후 Ella 소포의 크기가 균일해지도록, 거대 ELLA 지질 소포 또는 L UUV를 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. UUV를 4°C에서 보관하고 48시간 이내에 사용하십시오.

LUV 농도를 평가하기 위해 샘플 내의 총 인 함량을 측정합니다. 다음의 시약들을 동봉된 서면 프로토콜의 규격에 따라 준비해야 합니다: 8.9 N H₂SO₄, 2.5% w/v ammonium molybdate, 10% w/v ascorbic acid 및 0.65 mM phosphate buffer solution.

여기에 표시된 대로 6개의 인 표준물질을 준비하십시오. 그런 다음 대조군에 사용한 것과 동일한 부피의 0.2 millimolar trypsin 및 2.0 millimolar Bowman BIR 억제제 용액을 사용하여 LUV 공시료(blank)를 준비하십시오. 이는 Bowman B 억제제 분말 내에 건조된 인염이 있을 경우 이를 보정하기 위함입니다.

다음으로, 약 0.1 micromoles(통상 약 25 microliters)의 UUVs를 일회용 유리 배양 튜브에 3반복으로 피펫팅합니다. 그 후, 각 시료, 표준물질 및 공시료 튜브에 8.9 normal H₂SO₄ 450 microliters를 첨가합니다. 그런 다음 시료, 표준물질 및 공시료를 175~210 °C 오븐에 25분 동안 둡니다.

25분이 지난 후, 모든 튜브를 오븐에서 꺼내 식힙니다. 각 튜브에 30% H2O 150 µL를 추가합니다. 그런 다음 샘플, 표준물질 및 공시료를 175에서 210 °C 사이에서 30분 동안 더 가열합니다.

30분 후, 시료 표준물질과 공시료를 가열 장치에서 꺼냅니다. 용액이 아직 무색이 되지 않은 경우, 모든 튜브에 H2O 50 µL를 추가하고 175에서 210 °C로 15분 더 가열합니다. 용액이 무색이 되면, 각 튜브에 nano pure H2O 3.9 mL, 몰리브덴산 암모늄 용액 0.5 mL, 그리고 아스코르브산 용액 0.5 mL를 추가합니다.

그다음 모든 튜브를 5~7분 동안 가열합니다. 끓는 물 중탕기 내에서 Agilent 8 4 5 3 UV visible spectrophotometer를 사용하여 820 nanometers에서 각 표준물질과 시료의 흡광도를 측정합니다. 실험군과 대조군의 LUV 농도는 각각 개별적으로 측정해야 합니다.

0.0 millimoles의 인(phosphorus)이 포함된 튜브를 모든 표준물질 및 실험용 LUV 샘플의 공시료(blank)로 사용해야 합니다. 0.2 millimolar trypsin과 2.0 millimolar bone 및 bir 억제제 용액이 포함된 튜브를 대조군 LUV 샘플의 공시료로 사용해야 합니다. 생성된 인 함량 대비 흡광도의 선형 표준 곡선을 사용하여 샘플의 총 인 함량과 LUV 농도를 계산해야 합니다.

펩타이드 용액을 준비하려면 펩타이드를 Oppu H2O에 용해합니다. 이 분석에 사용되는 펩타이드는 반드시 하나의 트립토판 잔기를 포함해야 합니다. 282 nm에서 펩타이드 용액의 흡광도를 3회 반복 측정합니다. 트립토판의 몰 흡광 계수 5,700을 사용하여 펩타이드 농도를 계산합니다.

m⁻¹ cm⁻¹로 희석한 후, 펩타이드를 nano pure water에 넣어 최종 농도가 30 µM이 되도록 희석하고 -20 °C에서 보관하십시오. translocation을 정량하기 위해, 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 실험군 및 대조군 샘플을 준비하십시오. 각 용액에 최종 농도가 250 µM이 되도록 UUVs를 충분히 첨가하십시오.

억제제 최종 농도가 트립신 농도보다 10배 높게 되도록 Bowman BIR 억제제 용액을 충분히 첨가하십시오. 최종 용액 부피가 450 µL가 되도록 10 mM HEIS 완충액을 추가하십시오. 펩타이드 용액 50 µL를 Stana micro chords 형광 측정 셀에 넣고 분광 광도계 프로그램에 배치하십시오.

25°C에서 280 nm의 들뜸 파장과 525 nm의 방출 파장으로 초당 최소 1회 이상의 형광 값을 기록하는 25분간의 형광 키네틱 실험을 수행하기 위한 형광 분광광도계입니다. PMT 감도를 'high'로 설정한 후, qve 내의 펩타이드 용액에 실험군 또는 대조군 시료를 첨가합니다. 이때 최종 펩타이드 농도가 3 µM이 되도록 해야 하며, 즉시 형광 키네틱 실험을 시작합니다.

실험군과 대조군 샘플의 분석이 모두 완료되면, 동반 문서에 기술된 대로 전위 비율(translocation ratios)을 계산하십시오. s와 펩타이드 간의 비율은 충분히 높으므로, 펩타이드가 소포 내로 전위되지 않았더라도 거의 모든 온전한 펩타이드가 dansel 그룹과 충분히 가까운 거리에 위치하여 fret 신호를 생성하도록 보장합니다. 이는 소포 내로 전위되는 펩타이드와 그렇지 않은 펩타이드 모두 대조군 조건에서 유사한 fret이 관찰되는 것과 일치합니다.

전위 분석(Translocation assays)은 본 영상에 설명된 대로 수행되었습니다. 이 그림은 강력한 전위를 나타낸 대표적인 펩타이드의 결과를 보여줍니다. 검은색 선으로 표시된 이 실험의 신호는 FRET 신호의 뚜렷한 감소를 나타냅니다.

시간이 지남에 따라 전위 비율이 높을수록 펩타이드가 효율적으로 전위됨을 나타냅니다. 여기에 표시된 세포 투과성 펩타이드의 전위 비율은 1.19이며, 불완전한 트립신 분해 및 억제제 또는 전위 능력과 무관한 기타 요인으로 인한 FRET 신호 손실 가능성을 제어하기 위해 전위 비율이 1에 가까운 펩타이드가 대조군으로 사용됩니다. 트립신과 Bowman-Birk trypsin inhibitor가 모두 포함된 UUV와 펩타이드 사이의 FRET 신호를 측정합니다.

이는 회색 추적선으로 표시됩니다. 트립신 억제제가 포함된 UUV를 사용한 대조 실험의 중요성이 여기 제시된 데이터에 의해 강조됩니다. 이 경우, 검은색 추적선으로 표시된 실험 시료에서 펩타이드 신호가 이전 그림과 유사한 수준으로 감소했습니다.

하지만 대조군 샘플에서는 이 펩타이드의 감소 속도가 더 빠르게 나타나므로, 순 전위량은 더 낮습니다. 이 영상을 시청한 후면, 지질 소포를 제작하고 트립토판 함유 펩타이드의 전위를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 펩타이드와 소포를 혼합한 직후에 즉시 데이터를 수집하기 시작하는 것이 중요함을 기억하십시오.