Name: 대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 배우세요 대형 단층 소포를 이용한 펩타이드 막 투과 정량화 방법을. 트립신 캡슐화 및 FRET 신호 분석으로 막 횡단 효율을 측정하여 세포 투과성 펩타이드 설계에 활용할 수 있습니다.

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저자가 도움이 토론에 대한 우리 부부는 플레밍과 제시카 첸 감사하고 싶습니다. 자금은 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIH - NIAID) 수상 R15AI079685 및 연구 회사 Cottrell 대학 과학 수상에 의해 제공되었다. 추가 학생 지원은 하워드 휴즈 의학 연구소와 스탤리가 기금에​​ 의해 제공되었다.

1. 대형 Unilamellar 지질 Vesicles (LUVs)의 준비 <ol><li> 세포막의 분석 19 싫어하지 &#39;역할을 LUVs를 준비합니다. </li><li> 믹스 phosphatidylcholine (POPC, 760.10 g / 몰), phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 g / 몰), 5 dimethylaminonaphthalene - 1 - sulfonyl 50 클로로포름에 용해 phosphatidylethanolamine (DNS - 포프, 994.350 g / 몰) (아벤티 폴라 Lipids) : 45:5 비율. 모든 분석은 실험 및 제어 모두 LUVs의 별도의 준비가 필요합니다 마찬가지로 두 개의 지질 케이크 유리병을 준비한다. 총 지질 (0.188 MG POPC, 0.169 MG의 POPG, 그리고 0.019 MG DNS - 교황)의 0.376 MG는 일반적으로 하나의 translocation 시험에 대한 충분한 vesicles를 만들기 위해 충분하다. </li><li> N 2 가스 스트림을 사용하여 클로로포름에서 증발. </li><li> 지질 케이크에게 진공 건조기에서 9~14시간을 건조. </li><li> 주식 10 MM의 HEPES 버퍼 솔루션 (10 MM의 HEPES, 238.3 g / 몰, 45 MM NaCl, 58.44 g / 몰, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 372.24 g / 몰 산도 7.4) 준비합니다. HEPES 완충액은 일입니다4 ° C.에 ored </li><li> 위의 준비 10 MM HEPES 버퍼에서 0.4 mm까지 돼지의 트립신 (23.3 ㎏ / 몰)의 주식 솔루션을 준비합니다. 트립신은 -20 ° C에서 저장되고, 우리의 실천, 보통 사용하기 전에 2 개 이상의 동결 - 해동주기를 받아야하지 않습니다. </li><li> -20 ° C. 10 MM의 HEPES 버퍼 솔루션과 저장소에있는 4.0 밀리미터 보먼 - Birk 트립신 억제제 (8 ㎏ / 몰)의 주식 솔루션을 준비 우리의 사용이 주식은 매월 보충함하고 그것이 다시 만들어지기 전에 보통 3 개 이상 동결 / 해동주기를 받아야하지 않습니다. </li><li> 0.4 MM 트립신 재고 및 말린 지질 케이크 10 MM HEPES 버퍼 솔루션의 동일한 볼륨을 추가하여 0.2 MM의 트립신 솔루션 Reconstitute 실험 multilamellar vesicles (MLVs). 0.376 MG 총 지질의 단일 샘플 들어, 트립신 솔루션과 HEPES 완충액 150 μL의 150 μL의 혼합물은 충분합니다. </li><li> 0 동등한 볼륨을 추가하여 0.2 MM 트립신 및 2.0 MM 보먼 - Birk 트립신 억제제와 솔루션에 Reconstitute 제어 MLVs.4 MM 트립신 재고 및 말린 지질 케이크 4.0 MM 트립신 억제제. 0.376 MG 총 지질의 단일 샘플 들어, 트립신 솔루션과 트립신 억제제 150 μL의 150 μL의 혼합물은 충분합니다. </li><li> 유리 튜브에서 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송 MLV 솔루션. </li><li> 액체 질소 5 동결 / 해동주기에 따라 MLV는 솔루션을 제공합니다. </li><li> 각 테플론 압출기 기사에 HEPES 버퍼에 moistened이 필터 지원을 배치하여 지질 압출기를 (아벤티 폴라 Lipids) 준비합니다. 두 테플론 압출기 조각 사이에 0.1 μm의 모공 (워트 먼지, 영국)와 nuclepore 트랙 새겨져 멤브레인를 삽입하고 금속 압출기 용기 내부의 압출기의 조각을 넣으십시오. 압출기 용기의 금속 위로 강화하고 홀더에 넣어 전에 두 압출기 조각을 통해 도넛 스페이서를 넣으십시오. </li><li> 소포 샘플의 손실을 방지하기 위해 250 μL 유리 주사기를 사용하여 500 μL 10 MM의 HEPES 버퍼와 압출기 내에서 무효 볼륨을 채우십시오. &lt;/ 리&gt; <li> 압출기에 각 MLV 샘플을로드하고 세포막을 통해 균일한 unilamellar 소포 크기를 보장하기 위해 최소한 21 번 샘플을 누르십시오. LUVs은 MLV 솔루션 다음 압출에서 얻을 수 있습니다. </li><li> 4 저장 LUVs ° C 및 48 시간 이내에 사용합니다. </li></ol> 2. Quantifying은 집중력 LUV <ol><li> LUV 농도는 샘플 20 전체 인의 함량을 결정하여 계량했다. </li><li> 상온에서 nanopure 물 저장 4 SO 8.9 NH 2를 준비합니다. </li><li> 2.5 % W / V 암모늄 molybdate VI (588.04 g / 몰) nanopure 물의 솔루션을 준비합니다. 10 % W / V 아스코르비 산 (176.1 g / 몰) nanopure 물의 솔루션을 준비합니다. 튜브 호일로를 덮고하여 빛의 노출에서 아스코르비 산 솔루션을 보호할 수 있습니다. 최대 2 개월 동안 4 ° C에서 두 솔루션을 저장합니다. </li><li> 0.65 MM 인산 버퍼 솔루션 (일염기의 무수 인산 나트륨, 120g / 몰) 준비합니다. </li><li> 여섯 표준 부엉 준비bes. 표준 0.0 μL, 50 μL (0.0325 μmoles), 100 μL (0.065 μmoles), 175 μL (0.114 μmoles), 250 μL (0.163 μmoles) 또는 인 솔루션의 350 μL (0.228 μmoles)를 포함해야합니다. </li><li> 세중의에서 샘플 튜브를 LUV 준비합니다. 각 샘플 튜브 LUVs의 약 0.1 μmoles를 포함해야합니다. 실험 및 제어 농도가 별도로 측정해야합니다 LUV. </li><li> 보먼 - Birk 억제제 가루에 말린 인의 소금에 대한 해결하려면 컨트롤 빈이 준비되어야합니다 LUV. 샘플 튜브 LUV 컨트롤에 배치되면서 빈은 0.2 MM MM trypsin/2.0 보먼 - Birk 억제제 솔루션의 동일한 볼륨을 포함해야합니다. </li><li> 표준 샘플, 그리고 빈 튜브의 각에 8.9 NH 2 SO 4의 장소 450 μL. </li><li> 175-210에서 열 샘플, 표준, 25 분 동안 공백 ° C 오븐에. </li><li> 모든 튜브를 제거하고 괜찮아 수 있습니다. 부엉의 각 30 % H 2 O 2 150 μL 추가bes. </li><li> 열 샘플, 표준 및 175-210에서 30 분 여백 ° C. </li><li> 샘플, 표준 및 열을에서 공백을 제거합니다. 솔루션 중 하나가 아직 무색하지 않은 경우, 175-210시 추가 15 분 동안 모든 튜브와 열 ° C. 50 μL H 2 O 2를 추가 </li><li> 3.9 ML nanopure H 2 O, 0.5 ML의 암모늄 molybdate 솔루션과 각각의 튜브에 0.5 ML의 아스코르비 산 솔루션을 추가합니다. </li><li> 끓는 물에 목욕에 5~7분 모든 튜브를 가열. </li><li> 애질런트 8453 UV - 보이는 분광 광도계를 사용하여 820 nm의 각 표준 및 시료의 흡광도를 측정. 0.0 mmoles의 인을 포함하는 튜브는 모든 표준 및 실험을위한 빈으로 사용해야하는 것은 샘플을 LUV. 0.2 MM MM trypsin/2.0 보먼 - Birk 억제제 솔루션을 포함하는 튜브 컨트롤의 빈으로 사용해야하는 것은 샘플을 LUV. </li><li> 선형 흡수 대 인 콘텐츠 표준 곡선은 생산 전체 phosph를 계산하는 데 사용할 수 있습니다orus 내용과 샘플의 농도를 LUV. </li></ol> 3. 펩타이드 솔루션을 준비 <ol><li> nanopure H 2 O.의 펩타이드를 해산 설명한대로이 분석에 사용되는 펩티드 하나 트립토판 잔류물을 포함해야합니다. </li><li> 세중의에서 282 nm의에서 펩타이드 솔루션의 흡광도를 측정. 5700 M -1 cm -1의 트립토판을위한 어금니 흡광 계수를 사용하여 펩타이드 농도를 계산합니다. </li><li> 30 μm의의 최종 농도 nanopure 물의 펩타이드를 희석. -20 ° C에 보관 </li></ol> 4. Translocation의 부량 <ol><li> 1.7 ML의 microcentrifuge 튜브의 실험 및 제어 샘플을 준비합니다. 250 μm의의 최종 농도는 각 솔루션에 충분한 LUVs를 추가합니다. 그 억제제가 트립신 농도보다 큰 10X 최종 농도가되도록 충분히 보먼 - Birk 억제제 솔루션을 추가합니다. 450 μL에 최종 솔루션 볼륨을 가지고 충분한 10 MM의 HEPES 버퍼를 추가합니다. </li> &lt;Starna 마이크로 쿼츠의 fluorometer 전지로 리&gt; 소 50 μL 펩타이드 솔루션입니다. LUVs과 펩타이드 사이의 비율은 아무도 소포로 translocated없는 경우에도 거의 모든 그대로 펩티드가 무서워에게 신호를주는 dansyl 그룹에 가까운 정도로 가까이에있는 것을 보장하기 위해 충분히 높습니다. 이것은 유사한를하고 vesicles로 이동시키다하지 펩티드​​에 대한 컨트롤 상태에서 관찰 걱정과 일치합니다. </li><li> cuvette에있는 펩타이드 솔루션 실험 또는 제어 샘플을 추가합니다. 이 3 μm의하는 최종 펩타이드 농도를 가지고해야합니다. </li><li> 초당 최소 한번은 형광 독서를 복용, 실험이나 제어뿐만 아니라 즉시 25 분 형광등 속도론 실험 솔루션을 LUV을 시작합니다. 25-280 nm의에서 여기 파장 525 nm의에서 방출 파장과 온도를 설정 ° C. 캐리 이클립스 형광 분광 광도계를 사용하여, 우리가 고등에게 PMT 감도를 설정할 수 있습니다. </li></ol><html> 5. 양적 Translocation 비율을 생성 <ol><li> 데이터 수집의 십오초 후 형광 읽기로 초기 형광 (F O)를 정의합니다. 우리 악기 설정에서, 우리는 수집된 형광 데이터의 첫 번째 15 초 샘플 추가시 시스템에 샘플 챔버를 닫고, 다른 perturbations, 때문에 혼합하기 위해 신뢰할 수있는 것으로 나타났습니다. 각각의 시점에 상대 형광을 (F / F 0) 취득 F O 각 후속 독서를 나누십시오. </li><li> 평균 실험의 마지막 순간에서 모든 상대적인 형광 수치가 최종 평균 상대 형광을 얻기 위해 <img alt="[F / 정] 평균" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> 을 나누기 <img alt="[F / 정] 평균" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> 에 의해 제어 샘플 <img alt="[F / 정] 평균" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> 실험 샘플 수정 최종 형광 값을 얻을 수 있습니다. </li></ol>르 &quot;&gt; 6. 대표 결과 그림 2는 강력한 translocation을 보여준 대표적인 펩타이드이 분석의 결과를 보여줍니다. 이 실험 (검은색 추적)의 신호는 시간이 지남에 따라 신호를 걱정에 표시된 드롭을 보여줍니다. 그러나, 그것은 불완전 트립신 억제 또는 translocation의 능력과 관계없는 기타 요인으로 인해 신호를 걱정의 가능성 손실을 제어하는​​ 것이 중요합니다. 이를 위해, 우리는 항상 또한, 펩타이드 및 트립신과 보먼 - Birk 트립신 억제제 (회색 추적, 그림 2)를 모두 포함하는 LUVs 사이의 신호를 무서워 측정합니다. 우리 손으로, 그것은 실험이 실행될 때마다 모든 펩타이드에 대해이 컨트롤을 수행하는 것이 중요했습니다. 이것은 우리가 명확하게 지질 소포를 준비하거나 일반적으로 이러한 농도에서 관찰 상대적으로 약한 형광 신호를 미칠 수 있습니다 악기 소음, 사이에 차이로 인해 신호의 변경 사항에 대한 정확한 수 있습니다. 컨트롤 expe의 중요성트립신 억제제를 포함하는 LUVs를 사용 riment는 그림 3에 표시된 데이터로 강조 표시됩니다. 이 경우에는 펩타이드 신호 실험 샘플 (블랙 추적)의 그림 2에서와 비슷한 금액을 감소. 그러나, 컨트롤 샘플이 펩타이드에 대한 좀 더 빠른 감소를 보여주는 그물 translocation이 낮은 그럼. 우리의 프로토콜 제 5 본 실험에서 translocation을 quantifying위한 간단한 방법을 설명합니다. 높은 translocation 비율 효율적으로 이동시키다 펩티드 지표되며 그림 2에 표시된 세포 관통 펩티드에 대한 translocation의 비율은 1.16이며, 약하게 translocating 펩티드가 가까이 1 translocation 비율을 가지고있는 동안. 우리의 경험에서, 다른 소포의 준비와 수행 세 독립적인 실험에 대한 표준 오차는 0.01-0.06의 범위에 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> 그림 1. translocat의 개략도이온 분석. 실험은 샘플 (A)가 형광등 dansyl 교황 (검은 막대)와 도핑된 있으며, 트립신 (가위)를 포함하는 캡슐 LUV. 트립신 억제제 (빨간색 동그라미)은 LUVs 외부 트립신을 억제하는 데 사용됩니다. LUVs는 펩타이드 (보라색)에 노출되어 있습니다. 과 펩타이드 협회가 translocting 펩티드는 노골적인 내부 트립신 발생으로 감소 신호 (녹색)을 걱정 세포막의 산출을 LUV. 트립신과 트립신 억제제가 모두 통제 캡슐 아르는 (B) translocation 관련없는 신호를 걱정의 감소를 측정하기위한 샘플을 LUV. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> 그림 2. 세포 관통 펩티드에 대한 대표적인 데이터. 항균 pepide을 translocating 대표는 제어에 비해 신호를 걱정에 큰 방울을 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> 그림3. 컨트롤의 중요성을 강조 대표 데이터. 않은 translocating 펩타이드의 tryptic 소화가 완전히 억제는 실험과 제어 모두에서 시간이 지남에 따라 신호를 걱정에서 드롭으로 연결 솔루션을 LUV. 제어 및 실험 트레이스 간의 차이가 비교적 적은이기 때문에,이 돌연변이가 약하게 translocating 펩타이드로 특징입니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 프로토콜은 내부 지질 vesicles 외부 펩티드의 농도에 상대적인 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 변경 사항은 translocation 능력에 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 약물 전달 벡터로서 잠재력을 지닌 세포 관통 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 관통 펩티드에 대한 흥미가 증가함에 따라, 직접 translocation 이벤트를 측정할 방법이 정량 방식으로 개발하고 사용하는 방식을 볼 수 재미있을 것입니다. 우리가 실험실에서, 우리는 분석의 일관성이 조심스럽게 실험의 몇 가지 특정 측면을 모니터링하여 향상시킬 수 것으로 나타났습니다. 첫째, 실험 및 제어 모두 vesicles의 부량이 프로토콜을 사용하여 얻은 결과의 일관성을 향상시킵니다. 이 분석은 또한 이전에 단백질 translocation과 소화의 시작 부분에 정확한 초기 형광을 감지하는 능력에 따라 달라집니다. 따라서, 그것은 fluore을 위해 필수적이며,즉시 단백질이...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 16시에서 18시 1분까지 PG </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 1시 18분 Dansyl PE </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16시에서 18시 1분까지 PC </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> 돼지의 트립신 </td><td> 시그마 </td><td> T - 0303 </td></tr><tr><td> 보먼 - Birk 트립신 / 키모 트립신 억제제 </td><td> 시그마 </td><td> T - 9777 </td></tr><tr><td> 미니 압출기 </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td> 610,000 </td></tr><tr><td> 암모늄 molybdate (파라) </td><td> 알파 Aesar </td><td> 10,811 </td></tr><tr><td> L - 아스코르비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> 과산화수소, 30 % 용액 </td><td> Mallinckrodt 화학 </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H - 3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S - 9625 &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> 아니 2 PO 4 </td><td> 시그마 </td><td> S - 0751 </td></tr></tbody></table>

대형 unilamellar vesicles로 펩타이드의 translocation 측정

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

쉽게 세포막 수용체 1의 도움없이 세포 세포막을 교차 펩티드에 적극적인 관심이 있습니다. 이들의 대부분은 자주 약물 전달 벡터 1-3으로 자신의 잠재력에 대해 설명되어 있습니다 세포 관통 펩티드,라고합니다. 또한, 특히 4,5 이외의 멤브레인 lytic 메커니즘, 세포 용해를 일으키는 않고 박테리아 세포막을 건너 세포내 프로세스 6,7을 방해하여 세포를 죽일 이들을 통해 작동 항균 펩티드의 증가 관심이 있습니다. 사실, 저자는 점점 더 셀 - 관통 및 항균 펩티드 1,8 사이의 관계를 지적했습니다. 멤브레인 translocation과 펩타이드 구조와 이동시키다하는 기능 사이의 관계 과정의 확실한 이해 translocation에 대한 효과적이고 재현성 assays가 필요합니다. 몇몇 그룹은 대형 unilamel로 translocation을 측정하는 방법을 제안했습니다고맙다 지질 vesicles (LUVs) 9-13. LUVs은 박테리아와 진핵 세포 점막에 대한 유용한 모델로 봉사하고 자주 펩타이드 형광 연구 14,15에 사용됩니다. 여기, 우리는 먼저 이러한 magainin 및 buforin II 16,17으로 항균 펩티드를 고려 마츠 및 동료에 의해 ​​개발된 방법은 우리의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 방법에 대한 우리의 프로토콜을 제공하는 것 외에도, 우리는이 분석을 사용하여 translocation 능력을 quantifies 데이터 분석에 대한 직접적인 접근 방식을 제시한다. 다른 사람에 비해이 translocation 분석의 장점은 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 트립토판 함유 펩티드로, 펩타이드 특성 18을 변경할 수있는 형광 레이블의 추가를 필요로하지 않습니다 가능성을 가지고 있습니다. 간단히, 지질 vesicles로 translocation 능력은 기본 트립토판의 잔류물와 D 사이의 포스터 공명 에너지 전송 (걱정)의 함수로 측정단백질은 외부와 관련된 ansyl phosphatidylethanolamine은 멤브레인 (그림 1) LUV. 그들은 LUVs와 캡슐 노골적인 트립신 발생으로 휴대 관통 펩티드는 LUV 멤브레인 및 신호를 걱정의 드롭에서 disassociation로 이어지는, 죽습니다. 의 드롭 translocating 펩타이드에 대한 관찰 신호가 LUVs이 트립신 및 트립신 억제제, 또는 때 저절로 지질 세포막을 교차하지 않는 펩타이드가 트립신 함유 LUVs에 노출을 모두 포함하는 동일한 펩타이드에 대한 관찰보다 훨씬 큰 무서워. 형광에이 변경 사항은 시간이 지남에 따라 펩타이드 translocation의 직접 부량을 제공합니다.

이 프로토콜 세부 대형 unilamellar 지질 vesicles로 펩타이드 translocation의 양적 측정을위한 방법입니다. 이 방법은 또한 멤브레인 translocation의 속도에 대한 정보를 제공하고 효율적이고 자발적 지질 bilayers를 건너되는 펩티드를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

세포막 수용체의 도움 없이 세포막을 쉽게 통과하는 펩타이드에 대한 관심이 높아지고 있습니다1. 이러한 펩타이드 중 상당수는 ...

소포 막을 통한 펩타이드 전위를 정량화하기 위해, 트립신이 캡슐화된 형광 표지 지질 소포를 생성합니다. 외부 트립신의 활성을 억제하기 위해 트립신 억제제를 첨가하여 소포 내강에만 활성 트립신이 남도록 합니다.형광 표지된 펩타이드가 소낭(vesicle)에 첨가되었을 때만, 펩타이드의 형광 태그가 FRET 공여체로 작용하여 소낭의 형광 분자를 들뜨게 합니다. 그러나 단백질이 막을 통과하면 트립신(trypsin)에 의해 분해되어 FRET 신호가 소실됩니다. 분광 분석을 통해 펩타이드 전이 정도를 확인할 수 있으며, 이는 시간이 경과함에 따라 소낭과 펩타이드 사이의 FRET 감소로 나타납니다.다른 지질 소포 기술과 세포 내 펩타이드 진입 측정 방법을 포함한 다른 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 막 진입의 역학에 대한 정보를 제공하며, 펩타이드에 트립토판이 포함되어 있는 경우 형광 표지를 추가할 필요가 없다는 점입니다. 이 방법은 효과적인 막 전이를 위해 어떤 특성이 필요한지와 같은 막 활성 펩타이드의 설계 및 공학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 분석을 위한 세포막 모사체로 사용할 거대 단일층 지질 소포(UUVs)를 준비하는 것입니다.먼저 클로로포름 내에서 phosphatidylcholine, phosphatidyl, glycerol 및 dimethyl amino naphthalene-one sul phyl phosphatidyl ethanolamine을 50:45:5 비율로 혼합합니다. 일반적으로 단일 실험 또는 대조군 시험에 충분한 양의 소포를 만들기 위해 0.376 mg의 총 지질을 사용합니다.하나의 바이알은 실험군 샘플로, 다른 하나는 대조군으로 준비하고 질소 가스 흐름을 이용하여 클로로포름을 증발시킵니다. 이 단계 후에 남은 건조된 지질을 지질 케이크라고 합니다. 진공 데시케이터에서 지질 케이크를 9~14시간 동안 건조시킵니다.다음으로, 10 mM HEI 스톡 용액, 0.4 mM 돼지 트립신 스톡 및 4.0 mM Bowman Burke 트립신 억제제 스톡을 준비하십시오. 준비를 위한 세부 사항은 첨부 문서에서 확인할 수 있습니다. 건조된 지질 케이크에 0.4 mM 트립신 스톡과 10 mM HEI 버퍼 용액을 동일한 부피로 첨가하십시오. 그런 다음 바이알을 볼텍싱하여 다중층 소포(multilamellar vesicles, MVs)를 재구성하십시오. 대조군 MV를 재구성하려면 건조된 지질 케이크에 0.4 mM 트립신 스톡과 4.0 mM 트립신 억제제를 동일한 부피로 첨가한 후 이전과 동일하게 볼텍싱하십시오.MLV가 재구성되면, 유리 바이알의 MLV 용액을 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 액체 질소와 30 °C 항온수조를 번갈아 사용하여 MLV 용액을 5회 동결-해동 사이클에 노출시킵니다. 이어서 Heiss Buffer로 두 개의 필터 지지체를 적셔 지질 압출기를 준비합니다.그 다음, 각각을 습윤된 테플론 압출기 조각 위에 올리고, 두 테플론 압출기 조각 사이에 0.1 micron 공극의 nucleo pore track etched membrane을 배치합니다. 이제 압출기 조각들을 금속 압출기 캐니스터 내부에 넣고, 두 압출기 조각 위에 도넛형 스페이서를 배치합니다. 압출기 캐니스터의 금속 상단을 조인 후, 250 microliter 유리 주사기를 사용하여 홀더에 거치합니다.소포체 시료의 손실을 방지하기 위해 익스트루더 빈(extruder void)을 10 mM HEPES 완충액 500 µL로 채웁니다. 시료를 10 mL 비커로 옮깁니다.그 후 각 MLV 샘플을 압출기에 넣고 멤브레인을 통해 샘플을 최소 21회 통과시킵니다. 압출 후 Ella 소포의 크기가 균일해지도록, 거대 ELLA 지질 소포 또는 L UUV를 1.7 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. UUV를 4°C에서 보관하고 48시간 이내에 사용하십시오.LUV 농도를 평가하기 위해 샘플 내의 총 인 함량을 측정합니다. 다음의 시약들을 동봉된 서면 프로토콜의 규격에 따라 준비해야 합니다: 8.9 N H₂SO₄, 2.5% w/v ammonium molybdate, 10% w/v ascorbic acid 및 0.65 mM phosphate buffer solution.여기에 표시된 대로 6개의 인 표준물질을 준비하십시오. 그런 다음 대조군에 사용한 것과 동일한 부피의 0.2 millimolar trypsin 및 2.0 millimolar Bowman BIR 억제제 용액을 사용하여 LUV 공시료(blank)를 준비하십시오. 이는 Bowman B 억제제 분말 내에 건조된 인염이 있을 경우 이를 보정하기 위함입니다.다음으로, 약 0.1 micromoles(통상 약 25 microliters)의 UUVs를 일회용 유리 배양 튜브에 3반복으로 피펫팅합니다. 그 후, 각 시료, 표준물질 및 공시료 튜브에 8.9 normal H₂SO₄ 450 microliters를 첨가합니다. 그런 다음 시료, 표준물질 및 공시료를 175~210 °C 오븐에 25분 동안 둡니다.25분이 지난 후, 모든 튜브를 오븐에서 꺼내 식힙니다. 각 튜브에 30% H2O 150 µL를 추가합니다. 그런 다음 샘플, 표준물질 및 공시료를 175에서 210 °C 사이에서 30분 동안 더 가열합니다.30분 후, 시료 표준물질과 공시료를 가열 장치에서 꺼냅니다. 용액이 아직 무색이 되지 않은 경우, 모든 튜브에 H2O 50 µL를 추가하고 175에서 210 °C로 15분 더 가열합니다. 용액이 무색이 되면, 각 튜브에 nano pure H2O 3.9 mL, 몰리브덴산 암모늄 용액 0.5 mL, 그리고 아스코르브산 용액 0.5 mL를 추가합니다.그다음 모든 튜브를 5~7분 동안 가열합니다. 끓는 물 중탕기 내에서 Agilent 8 4 5 3 UV visible spectrophotometer를 사용하여 820 nanometers에서 각 표준물질과 시료의 흡광도를 측정합니다. 실험군과 대조군의 LUV 농도는 각각 개별적으로 측정해야 합니다.0.0 millimoles의 인(phosphorus)이 포함된 튜브를 모든 표준물질 및 실험용 LUV 샘플의 공시료(blank)로 사용해야 합니다. 0.2 millimolar trypsin과 2.0 millimolar bone 및 bir 억제제 용액이 포함된 튜브를 대조군 LUV 샘플의 공시료로 사용해야 합니다. 생성된 인 함량 대비 흡광도의 선형 표준 곡선을 사용하여 샘플의 총 인 함량과 LUV 농도를 계산해야 합니다.펩타이드 용액을 준비하려면 펩타이드를 Oppu H2O에 용해합니다. 이 분석에 사용되는 펩타이드는 반드시 하나의 트립토판 잔기를 포함해야 합니다. 282 nm에서 펩타이드 용액의 흡광도를 3회 반복 측정합니다. 트립토판의 몰 흡광 계수 5,700을 사용하여 펩타이드 농도를 계산합니다.m⁻¹ cm⁻¹로 희석한 후, 펩타이드를 nano pure water에 넣어 최종 농도가 30 µM이 되도록 희석하고 -20 °C에서 보관하십시오. translocation을 정량하기 위해, 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 실험군 및 대조군 샘플을 준비하십시오. 각 용액에 최종 농도가 250 µM이 되도록 UUVs를 충분히 첨가하십시오.억제제 최종 농도가 트립신 농도보다 10배 높게 되도록 Bowman BIR 억제제 용액을 충분히 첨가하십시오. 최종 용액 부피가 450 µL가 되도록 10 mM HEIS 완충액을 추가하십시오. 펩타이드 용액 50 µL를 Stana micro chords 형광 측정 셀에 넣고 분광 광도계 프로그램에 배치하십시오.25°C에서 280 nm의 들뜸 파장과 525 nm의 방출 파장으로 초당 최소 1회 이상의 형광 값을 기록하는 25분간의 형광 키네틱 실험을 수행하기 위한 형광 분광광도계입니다. PMT 감도를 'high'로 설정한 후, qve 내의 펩타이드 용액에 실험군 또는 대조군 시료를 첨가합니다. 이때 최종 펩타이드 농도가 3 µM이 되도록 해야 하며, 즉시 형광 키네틱 실험을 시작합니다.실험군과 대조군 샘플의 분석이 모두 완료되면, 동반 문서에 기술된 대로 전위 비율(translocation ratios)을 계산하십시오. s와 펩타이드 간의 비율은 충분히 높으므로, 펩타이드가 소포 내로 전위되지 않았더라도 거의 모든 온전한 펩타이드가 dansel 그룹과 충분히 가까운 거리에 위치하여 fret 신호를 생성하도록 보장합니다. 이는 소포 내로 전위되는 펩타이드와 그렇지 않은 펩타이드 모두 대조군 조건에서 유사한 fret이 관찰되는 것과 일치합니다.전위 분석(Translocation assays)은 본 영상에 설명된 대로 수행되었습니다. 이 그림은 강력한 전위를 나타낸 대표적인 펩타이드의 결과를 보여줍니다. 검은색 선으로 표시된 이 실험의 신호는 FRET 신호의 뚜렷한 감소를 나타냅니다.시간이 지남에 따라 전위 비율이 높을수록 펩타이드가 효율적으로 전위됨을 나타냅니다. 여기에 표시된 세포 투과성 펩타이드의 전위 비율은 1.19이며, 불완전한 트립신 분해 및 억제제 또는 전위 능력과 무관한 기타 요인으로 인한 FRET 신호 손실 가능성을 제어하기 위해 전위 비율이 1에 가까운 펩타이드가 대조군으로 사용됩니다. 트립신과 Bowman-Birk trypsin inhibitor가 모두 포함된 UUV와 펩타이드 사이의 FRET 신호를 측정합니다.이는 회색 추적선으로 표시됩니다. 트립신 억제제가 포함된 UUV를 사용한 대조 실험의 중요성이 여기 제시된 데이터에 의해 강조됩니다. 이 경우, 검은색 추적선으로 표시된 실험 시료에서 펩타이드 신호가 이전 그림과 유사한 수준으로 감소했습니다.하지만 대조군 샘플에서는 이 펩타이드의 감소 속도가 더 빠르게 나타나므로, 순 전위량은 더 낮습니다. 이 영상을 시청한 후면, 지질 소포를 제작하고 트립토판 함유 펩타이드의 전위를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 펩타이드와 소포를 혼합한 직후에 즉시 데이터를 수집하기 시작하는 것이 중요함을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 형광 염료와 담금질제로 캡슐화된 대형 단층 소포(LUV)인 세포막 모방체를 사용하여 세포 투과 펩타이드와 세포막의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석에 대해 설명합니다.

세포를 투과하는 펩타이드와 멤브레인의 상호작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석

제시된 프로토콜은 공극 스패닝 무용매 지질 이중층을 사용하여 단일 수송체 수준에서 막 단백질 매개 수송을 분석하는 방법을 설명합니다. 이는 대단히 병렬적인 데이터 수집 및 분석과 결합된 대량 생산된 나노포어 어레이 칩을 생성함으로써 달성되며, 향후 멤브레인 단백질 이펙터 스크리닝의 확립을 가능하게 합니다.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

여기에 제시된 펩티드 계의 작은 unilamellar 소포의 생성을 위한 프로토콜은 성장할 수 있다. 막 펩티드의 vesiculo 생산을 용이하게하기 위해, 이들 소포는 전사 번역 시스템 및 펩티드 인코딩 플라스미드를 구비한다.

자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

이 프로토콜의 목표는 마이크로파이펫 흡인에 의해 거대 소포의 막 기계적 특성을 안정적으로 측정하는 것입니다.

마이크로 파이펫 포부로 전기 형성 및 기계적 특성 측정에 의한 거대한 Unilamellar 하이브리드 소포의 Obtention

형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.

세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

배우세요 대형 단층 소포를 이용한 펩타이드 막 투과 정량화 방법을. 트립신 캡슐화 및 FRET 신호 분석으로 막 횡단 효율을 측정하여 세포 투과성 펩타이드 설계에 활용할 수 있습니다.

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

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