특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가

다음 실험의 전체적인 목표는 특정 유전자의 발현을 조절한 후, 그것이 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이는 Bosque 23 세포를 형질전환하여 과발현 유도 또는 SHRA 포함 컨스트럭트(construct)를 포함하는 바이러스 입자를 생성함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, ramo 세포를 해당 바이러스로 감염시켜 표적 유전자의 넉다운(knockdown) 또는 과발현을 유도합니다.

다음으로, 세포가 돌연변이를 축적할 수 있도록 단일 세포 클론을 수주 동안 배양합니다. 마지막으로, IgM 소실 분석과 IG 유전자 서열 분석을 통해 변경된 유전자 발현의 효과를 결정할 수 있습니다. 이 방법은 항체 다양성에 관여하는 새로운 인자를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

먼저, 600 µL의 따뜻한 DMEM을 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주하는 것으로 시작합니다. 그다음, 배지로 직접 피펫팅하도록 주의하며 30 µL의 FuGENE 6를 튜브에 넣고, 용액을 1초 미만으로 볼텍싱한 후 튜브를 상온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 본 과정과 같은 렌티바이러스 감염을 위해 6 µg의 shRNA construct와 각각 1.5 µg의 pVSVG-pmdLGPRRE 및 pRSV-rev를 DMEM FuGENE 6 혼합물에 첨가합니다.

용액을 짧게 볼텍싱한 다음, 다시 실온에서 25분 동안 배양합니다. 마지막으로, 50~60% 합류도(confluency)의 Bosque 23 세포 배양물에 D-N-A-D-M-E-M FU 유전자 복합체를 트랜스펙션합니다. 세포를 혼합하고 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 세포에 DMEM 5 mL를 추가하고 인큐베이터에서 24시간 동안 더 배양합니다. 형질전환 후 셋째 날에 10 mL 주사기를 사용하여 형질전환된 box 23 세포에서 배지 10 mL를 수확한 후, 주사기 끝에 0.45 µm 필터를 장착합니다. 여과된 배지를 깨끗한 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 수집합니다. 감염 24시간 전에 2 × 10⁵ cells/mL 농도의 RAMO 세포 2 mL를 완전 RPMI 배지가 담긴 6-웰 플레이트에 분주합니다. 다음 날, 10 µg/mL 폴리브레빈(polybrene) 용액 3 µL와 바이러스 1 mL를 RAMO 세포에 추가하고, 파이펫팅을 통해 세포 현탁액을 잘 혼합합니다.

비감염 대조군의 경우, 바이러스 대신 완전 RPMI 1 mL와 poly brain 3 µL를 웰 하나에 첨가합니다. 또한, 일치하는 음성 대조군으로 하나의 웰을 감염시키고, GFP 함유 벡터로 또 다른 웰을 감염시켜 FACS를 통해 감염 효율을 결정합니다. 이제 6-웰 플레이트를 상온에서 3000 ×g로 90분 동안 원심분리한 후, 플레이트를 인큐베이터에 넣고 48시간 동안 배양합니다.

마지막으로, 감염된 세포를 15 milliliter 폴리프로필렌 튜브에 넣고 400 Gs에서 4분 동안 원심분리합니다. 실온에서 세포 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 배지를 흡입하여 제거한 후, 신선한 RPMI에 세포를 재현탁합니다. 세포 수를 측정한 후, 감염된 RAMO 세포의 일부를 10 cells per milliliter로 희석합니다.

각각의 파종 플레이트당 최종 부피 10 milliliters가 되도록 RPMI 조건화 배지와 FBS 용액에 희석합니다. 그다음 멀티채널 파이펫을 사용하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 희석된 세포를 100 microliters씩 파종합니다.

플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 현미경을 사용하여 각 웰을 확인하십시오. 단일 세포를 식별하기 위한 적절한 초점 깊이를 결정하는 것이 까다로울 수 있으므로, 세포의 존재 여부를 확인해야 합니다. 먼저 96-웰 플레이트 바닥에 각인된 웰 번호에 초점을 맞추어 보십시오.

그 후 2주 뒤에 세포를 탐색합니다. 유성 잉크를 사용하여 웰의 가장자리를 따라 세포 콜로니가 형성되었는지 확인합니다. 세포 성장이 활발한 웰을 표시한 다음, 추가 배양을 위해 콜로니를 1 mL의 RPMI가 담긴 24웰 플레이트로 옮깁니다.

수일 동안 배양한 후, 세포를 6-웰 플레이트로 옮겨 계속 배양합니다. 6-웰 플레이트에 세포 콜로니를 접종하고 3주 후에, 각 웰에서 5×10⁵개의 세포를 1.5 mL 미세원심분리 튜브로 옮깁니다. 이때 대조군 및 HRNA 넉다운 웰의 세포와 염색되지 않은 대조군용 샘플 하나를 함께 수확합니다.

이제 모든 세포를 상온에서 400 Gs로 4분 동안 원심 분리하며, 두 번째 원심 분리 시에는 1 mL의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 염색하지 않은 대조군 펠릿은 50 µL의 PBS에 현탁하고, 나머지 펠릿들은 PBS와 1:20으로 희석한 PE 표지 항-인간 IGM 항체 혼합액에 현탁합니다. 그 다음 모든 세포 샘플을 얼음 위에서 1시간 동안 배양하고, 이전과 동일하게 PBS로 세포를 두 번 더 세척한 후 상층액을 제거하고 모든 펠릿을 100 µL의 PBS에 다시 현탁합니다.

다음으로, 재현탁된 염색 세포와 염색되지 않은 대조군 세포를 팩스 튜브(fax tubes)로 옮긴 후 유세포 분석기로 분석합니다. 대조군과 S-H-R-N-A 녹다운 세포의 IgM 음성 세포 백분율을 비교합니다. ID를 위한 레트로바이러스 과발현 벡터를 bosque 23 세포에 형질전환하였습니다.

그 후 바이러스를 수확하여 야생형(wt)과 AID 과발현 세포(AID.High)인 Ramos 세포에 감염시켰습니다. 단일 세포 배양된 세포를 3주 동안 성장시킨 후, qRT-PCR을 통해 유전자 발현을 분석하였습니다. 예상대로 qRT-PCR 결과, AID 과발현 벡터로 세포를 감염시킨 후 AID 발현이 현저히 증가한 것을 확인하였습니다. 감염된 세포의 IgM 소실은 FACS로 또한 평가하였습니다. 이전 그림과 같이 3주 시점에서 표면 IgM을 FACS로 측정하였으며, 야생형과 AID.High 세포의 IgM 소실 비율을 계산하여 여기에 그래프로 나타냈습니다. 예상대로 AID 과발현 세포에서 표면 IgM의 더 큰 소실이 나타났습니다.

별도의 실험에서, 대조군으로 사용되는 무관한 S-H-R-N-A 또는 SHM에 대해 보호 작용을 할 것으로 예상되는 고충실도 DNA 복구 인자를 표적으로 하는 S-H-R-N-A를 포함하는 렌티바이러스를 bosque 23 세포에서 제작하였습니다. 그 후, 이 렌티바이러스들을 Ramos 세포의 a ID high 클론에 감염시켰습니다. 다시 유전자 발현을 분석한 결과, 예상대로 해당 인자를 표적으로 하는 S-H-R-N-A가 있을 때 DNA 복구 인자의 수치가 감소하는 것이 관찰되었습니다. 또한, 복구 인자가 SHM 과정 중 돌연변이로부터 보호 작용을 한다고 생각되므로, 3주 후 단일 세포 클론에서 IGM 소실을 분석하였으며, 이 그림에서 확인할 수 있듯이 해당 인자가 없을 때 IGM 소실과 SHM이 증가하는 현상이 나타납니다.

이 영상을 시청하신 후에는, raw B 세포주에서 OVEREXPRESSION 또는 S-H-R-N-A 포함 제작물의 바이러스 감염을 수행하는 방법과, 해당 세포에서 체세포 하이퍼뮤테이션(somatic hypermutation)을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.