Name: 포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: 배우세요 포유류 H1 링커 히스톤 서브타입의 mRNA 및 단백질 발현 분석 방법을 실시간 PCR과 역상 HPLC 기술을 활용하여 정량화하는 종합적인 실험 기법을 익히세요.

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이 작품은 NIH 교부금 GM085261와 조지아 암 연합 내외 학술 상 (YF까지)에 의해 지원됩니다.

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

assays의 집합은 포유 동물 링커 히스톤 subtypes의 표현 수준의 포괄적인 분석을 가능하게 여기 제시. 적절히 설계된 qRT-PCR의 assays는 어떤 포유 동물 히스톤 H1 유전자의 RNA 메시지 중 매우 민감하고 정확한 측정을 제공합니다. 링커 히스톤 나눠 봤는데요의 유전자에 대해 qRT-PCR assays의 중요한 부분은 반대로 전사를 바탕으로 임의의 프라이머를 사용하여 cDNA의 준비입니다. 대부분의 H1 유전자를 포함한 대부분의 히스톤 유전자, mRNA의 다른 세포 mRNAs로 표시 긴 폴리-A 꼬리를 포함하지 않습니다. 따라서 oligo-DT의 primers와 전통 역방향 전송 방식은 효율적으로 H1의 cDNAs을 생산하지 않습니다. 예 : H1 0과 같은 폴리 - 꼬리를 포함하는 mRNA의 성적 증명서와 함께 몇 H1 유전자의 발현 분석, H1의 RNAs의 높은 풍부한로 아마도 인해 qRT-PCR 기반 랜덤 hexamers (그림 3)과 마찬가지로 효과적...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> RNase 보내겠 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizol 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> 절대 에탄올 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR 녹색 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease 전 </td><td> 시그마 </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal 96 - 웰 PCR 플레이트 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Microseal &#39;B&#39;씰 접착제 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> MSB-1001 </tD&gt; </tr><tr><td> 자당 </td><td> Agros의 생명체 </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> 인산 나트륨 이염의 heptahydrate (나 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 (NaCl) </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> 나트륨 dihydrogen 인산의 heptahydrate (아니 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> 전체 미니 proteinase 억제제 칵테일 정제 </td><td> 로슈 응용 과학 </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Phenylmethanesulfonyl 플루오르 (PMSF) </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> 염화칼륨 (KCl) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> 트리스는 [히드록시 메틸 aminomethane] </td><td> Bioanalytical 미국 </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 (MgCl2) </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> 황산 (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> 암모늄 수산화물 (NH 4 OH) </td><td> Agros의 생명체 </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> 브래드 포드 단백질 분석 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Trifluoroacetic 산성 (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

포유류의 링커 - 히스톤 subtypes의 표현 분석

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

링커 히스톤 H1 높은 순서 구조로 염색질의 접이식 촉진, nucleosome 핵심 입자와 링커 DNA에 바인딩합니다. H1은 포유류의 개발 1 필수적이며, 생체내 2-4 특정 유전자 발현을 조절. 고도 보존 히스톤 단백질 중에서 H1의 링커 histones의 가족은 가장 이질적인 그룹입니다. differentially 개발되는 동안 서로 다른 세포 유형의 규제 포유류 11 H1의 subtypes가 있습니다. 이러한 H1의 subtypes 5 체세포 H1s (H1a-E), 교체 H1 0, 4 배아 세포 특정 H1의 subtypes 및 H1x 5 포함되어 있습니다. DNA와 결합 친화성 및 염색질 압축 능력 6-9에 차이가 여러 H1의 subtypes의 존재는 염색질 기능의 변조의 추가 레벨을 제공합니다. 따라서 mRNA와 단백질의 두 개별 H1의 subtypes의 양적 표현 분석은, 이상의 규정의 이해에 필요한주문 염색질 구조와 기능. 여기 개별 H1의 subtypes의 표현 수준 (그림 1) 분석을 위해 설계 assays 집합을 설명합니다. 다양한 H1 변종의 유전자의 mRNA 발현은보다 정확한 빠르고, 그리고 북부 얼룩 분석의 대체 접근법에 비해 훨씬 적은 샘플을 필요로 매우 민감하고 정량 역방향 전사-PCR (qRT-PCR) assays의 집합에 의해 측정됩니다. 대부분의 다른 세포 mRNA 메시지와는 달리, H1 유전자의 대부분을 포함하여 대부분의 히스톤 유전자, 대한 mRNAs는 오랜 polyA 꼬리 부족하지만, 3 &#39;번역되지 않은 지역 (UTR) 10시 줄기 루프 구조를 포함합니다. 따라서 cDNAs 대신 oligo-DT의 primers의 무작위 primers를 사용하여 역방향 전사하여 총 RNA의 준비가되어 있습니다. 각 H1의 subtypes (표 1) 특정 primers와 실시간 PCR의 assays는 개별 H1를 나눠 봤는데요의 mRNA 수준의 고도의 양적 측정을 얻기 위해 수행되는의. 가사 유전자 표현은 정상화를위한 컨트롤로 분석된다. 각 H1를 나눠 봤는데요 및 핵심 histones의 단백질의 상대적인 풍요로움은 11-13 포유 동물 세포에서 추출한 총 histones의 반대 위상 고성능 액체 크로마 토그래피 (RP-HPLC) 분석을 통해 얻어진다. HPLC 방법 및 용출 조건은 여기 마우스 H1의 subtypes의 최적 분판을주는 설명했다. HPLC 프로필을 quantifying함으로써, 우리는뿐만 아니라 세포의 nucleosome 비율 H1을 결정으로, H1 가정 내에서 개별 H1의 subtypes의 상대적 비율을 계산.

우리는 H1의 링커 histones의 표현 수준을 분석 assays 집합을 설명합니다. H1의 histones의 단백질 양을 정함은 HPLC 분석에 의해 달성되는 반면, 개별 H1 유전자의 mRNA는 정량적 실시간 PCR 다음에 임의의 프라이머 기반 역방향 전사로 측정됩니다.

포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석

링커 히스톤 H1은 뉴클레오솜 핵심 입자와 링커 DNA에 결합하여, 염색질이 고차 구조로 접히는 것을 촉진합니다. H1은 필수적이며...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 H1 mRNA 수준 분석과 H1 단백질 수준 측정을 통해 히스톤 H1 아형의 발현 수준을 분석하는 것입니다. mRNA 분석을 수행하기 위해, 먼저 배양 세포 또는 마우스 조직에서 총 RNA를 추출합니다. 다음 단계에서는 랜덤 프라이머를 사용하여 총 RNA의 역전사를 수행한 후, 각 H1 아형 유전자에 대해 정량적 실시간 PCR 분석을 실시합니다. 히스톤 H1 단백질 분석은 마우스 조직 또는 배양 세포로부터 총 히스톤 추출물을 준비하는 것으로 시작합니다.이어서 역상 HPLC 분석을 통해 각 H1 서브타입과 핵심 히스톤 H2B를 분획하고 정량합니다. 최종적으로 정량적 실시간 PCR과 역상 HPLC 분석을 통해 각 H1 서브타입의 mRNA와 단백질 발현 수준을 확인합니다.저희는 조지아 공과대학교 생물학과 Yuhan FES 연구실의 대학원생들입니다. 오늘은 포유류 H one 서브타입에서 H one의 발현을 분석하기 위한 종합적인 분석법 세트를 보여드리겠습니다. 이 분석법들을 통해 다양한 H one 서브타입에서 mRNA와 단백질 모두의 발현 수준을 정량적으로 측정할 수 있습니다.Histone H1은 고차 염색질 접힘을 촉진하는 주요 염색질 구조 단백질이며, 세포 분화 및 발달 과정에서 차별적으로 발현되는 여러 Histone H1 변이체가 존재합니다. 이러한 H1 하위 유형의 발현 프로파일링은 고차 염색질 구조와 기능의 조절을 더 잘 이해하기 위해 필수적입니다. 이제 시작하겠습니다.RNA 추출 전, 모든 작업 표면과 피펫은 70% ethanol로 닦아내고 RNA 제거 용액(RNAs decontamination solution)으로 처리해야 합니다. 이러한 조치는 RNA 오염 및 RNA 분해 가능성을 줄여줍니다. 또한, 모든 과정에서 장갑을 착용해야 하며, 부착성 세포 배양물에서 RNA 추출을 시작하기 위해 배양액을 흡입하고 PBS로 세포를 세척합니다.그런 다음 웰에서 PBS를 제거하십시오. 고품질의 RNA를 얻기 위해서는 충분한 양의 triol 시약이 필요합니다. 6웰 플레이트의 웰 하나에서 RNA를 추출할 때 triol 시약 1 mL를 사용하며, triol 시약 제조사의 매뉴얼에 따라 세포에서 RNA를 추출하십시오. RNA 추출 후 NanoDrop 1000을 사용하여 RNA 농도를 측정하십시오.전형적인 수율은 배양 세포 1 × 10⁶개당 5~15 µg의 RNA 범위입니다. cDNA 합성을 진행하기 전, GE 전기영동을 통해 RNA 품질을 분석하여 미량의 genomic DNA에 의한 RNA 오염 가능성을 제거하십시오. 총 RNA를 cDNA로 역전사하기 위해 제조사의 지침에 따라 RNA-free DNase로 RNA 샘플을 처리하십시오. 제조사의 지침에 따라 superscript three first strand synthesis system을 사용하십시오. 대부분의 H1 유전자 mRNA에는 poly-A 꼬리가 없으므로, 프라이머로 oligo-dT 대신 random hexamer를 사용하는 것이 매우 중요합니다.cDNA 합성을 위해, 역전사 후 cDNA 증폭은 qPCR을 통해 수행할 수 있으며, qPCR 분석 전 SYBR Green 염료로 검출됩니다. 각 H1 유전자 및 내부 참조 유전자에 특이적인 정방향 및 역방향 PCR 프라이머를 설계하였으며, 서면 프로토콜에 기술된 표준 곡선법을 통해 프라이머 효율을 테스트하였습니다. 프라이머, cDNA 및 SYBR Green Super를 혼합하여 각 PCR 반응액을 준비하십시오.micros EAL 96-well PCR 플레이트에서 반응물을 잘 혼합하고, micros EAL B 점착성 씰을 사용하여 플레이트 커버가 플레이트에 완전히 밀폐되었는지 확인합니다. 그다음 밀폐된 플레이트를 볼텍싱하고 반응 혼합물을 짧게 원심분리합니다. qPCR을 위해 플레이트를 My IQ 단색 실시간 PCR 검출 시스템에 넣습니다.증폭 이후 설명된 텍스트의 지침에 따라 QPCR 조건을 설정하고 런을 수행하십시오. PCR 효율과 임계 주기 또는 CT 값을 확인하기 위해 증폭 곡선을 검토하십시오. 임계선은 IQ five 광학 시스템 소프트웨어 버전 2.0에 의해 자동으로 설정될 수 있습니다.Cyber green은 모든 이중 가닥 DNA를 검출하므로, 프라이머 이량체나 오염 물질이 아닌 원하는 앰플리콘만이 증폭 및 검출되었는지 확인하기 위해 QPCR 후에 융해 곡선(melting curve) 분석을 수행하는 것이 매우 중요합니다. 융해 곡선 분석 프로그램을 위해 QPCR 기기는 샘플을 55 °C에서 95 °C까지 0.5 °C 간격으로 가열하며 데이터를 수집합니다. 이중 가닥 DNA의 온도 또는 TM은 앰플리콘의 길이와 GC 함량에 따라 달라지므로, 서로 다른 앰플리콘은 서로 다른 TM 값을 갖게 됩니다.QPCR 생성물의 미분 융해 곡선을 검토하여 원하는 증폭 산물의 특이적 융해 온도와 노이즈 증폭 피크의 부재를 확인하십시오. 여기서는 TM이 86 °C인 H one A PCR 증폭 산물의 융해 곡선이 예시로 나와 있습니다. IQ five 광학 시스템 소프트웨어를 사용하여 QPCR 데이터를 분석하십시오. H one 이소형 유전자의 발현 값을 하우스키핑 유전자의 발현 값으로 정규화하여 H one 유전자의 상대적 발현 수준을 구하십시오.안락사시킨 마우스에서 분석 대상 장기를 적출한 후, 얼음처럼 차가운 PBS로 헹굽니다. 본 시연에서는 세척 후 간에서 전체 히스톤(total histones)을 준비하는 과정을 수행합니다. 면도날을 사용하여 조직을 작은 조각으로 다집니다. 다진 조직을 Dounce 균질기에 옮긴 다음, 조직 1g당 10mL의 부피로 수크로스 완충액을 균질기에 첨가합니다.조직을 10~15회 스트로크로 균질화합니다. 균질물을 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 샘플을 500 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 새 튜브로 옮기고 2000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.세포를 펠렛화하려면 0.5% NP 40가 첨가된 10 milliliters의 sucrose buffer에 세포 펠렛을 다시 현탁합니다. 샘플을 down homogenizer로 옮기고 20분간의 배양 시간 동안 10회 스트로크를 수행합니다. 이 단계에서 핵을 얻을 수 있습니다.현미경으로 핵의 품질을 검사하십시오. 2000 RPM에서 5분간 원심분리하여 핵을 펠렛화한 후, 상층액은 버립니다. 그다음, 조직 1g당 3mL의 고염 버퍼(high salt buffer)를 사용하여 핵 펠렛을 재부유시킵니다.샘플을 소형 다운 균질기에 옮기고 5~10회 스트로크로 균질화합니다. 현탁액을 3개의 에핑거 튜브에 나누어 담습니다. 튜브를 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.배양 후 14,000 RPM에서 10분간 원심분리하여 크로마틴 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거한 후, 각 크로마틴 펠렛에 0.2 normal 황산을 0.8 milliliters 첨가하여 전체 히스톤을 추출합니다. 에핑거 튜브 페스틀(einor tube pestle)을 사용하여 펠렛이 완전히 분해될 때까지 충분히 갈아줍니다.회전 플랫폼에서 샘플을 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 원심분리 후, 상층액을 두 개의 EOR 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 얼음처럼 차가운 에탄올을 2.5배 부피만큼 첨가합니다.샘플을 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관한 다음 날, 14,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 총 히스톤을 펠렛으로 침전시키고 상층액을 제거합니다. 펠렛을 70% ethanol로 세 번 세척한 후, 튜브 뚜껑을 열어 벤치 위에 20~30분 동안 두어 공기 건조시키고 즉시 HPLC 분석을 진행합니다. 역상 컬럼의 용량과 HPLC 장비에 따라 권장되는 부피의 이중 증류수에 히스톤 펠렛을 재현탁하고, 14,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.불용성 잔류물을 제거하기 위해, GE ACTA purifier UPC 900과 같은 HPLC 시스템의 역상 컬럼에 50~100 µg의 총 히스톤 단백질을 주입합니다. 컬럼의 막힘을 방지하기 위해 과도한 양의 단백질 주입은 피해야 합니다. 서면 프로토콜에 기재된 대로 아세토니트릴 기울기를 증가시키며 링커, 히스톤 및 핵심 히스톤을 분리합니다. 유출액은 214 nm에서 모니터링하며, HPLC 프로파일을 기록하고 분석합니다. 단백질 분획은 추가 분석을 위해 GE FRAC 920 분획 자동 수집기로 수집할 수 있습니다.여기에 마우스 간 및 마우스 배아 줄기세포에서 준비된 cDNA를 사용한 H one A-Q-P-C-R 반응의 전형적인 증폭 곡선이 제시되어 있습니다. 증폭 플롯을 평가한 결과, 각 샘플의 3반복 QPCR 반응이 거의 동일한 CT 값으로 일관된 신호를 나타내어 높은 재현성을 보여주었습니다. RT minus QPCR 반응에서 증폭산물이 축적되지 않은 것은 게놈 DNA 오염이 없거나 최소 수준이었음을 나타내며, H one 유전자와 하우스키핑 유전자의 CT 값을 이용하여 각 H one 유전자의 상대적 RNA 발현 수준을 계산하였습니다.여기에 제시된 그래프는 H1A 및 H1.0 유전자에 대해 계산된 결과의 예시입니다. H1A mRNA의 상대적 발현 수준은 생쥐 간과 비교했을 때 생쥐 배아줄기세포에서 더 높게 나타나는 반면, H1.0 발현은 배아줄기세포보다 간에서 훨씬 더 높습니다. 생쥐 배아줄기세포와 성체 생쥐 간에서의 H1A 또는 H1.0 발현 차이는 히스톤 단백질의 HPLC 프로파일에서도 분명하게 확인할 수 있습니다.H10. 분화 특이적 H1은 성체 마우스 간에 다량으로 축적됩니다. 이와 대조적으로, H10 단백질은 분화되지 않은 마우스 배아줄기세포에서는 거의 나타나지 않습니다.반면, H1A는 배아줄기세포에서 높게 발현되지만, H1 피크 정량 분석 결과 성체 마우스 간에서는 낮은 수준으로 나타납니다. HPLC 프로파일을 통해 성체 마우스 간 내 H1 가문 중 각 개별 H1 하위 유형의 상대적 비율이 결정됩니다. 또한, 뉴클레오좀당 개별 H1 하위 유형의 값은 해당 H1 하위 유형의 214 nanometers 흡광도 정규화 피크 값과 H2B 정규화 값의 2분의 1 사이의 비율로부터 계산할 수 있습니다. 이와 유사한 방식으로 뉴클레오좀당 총 H1 값도 계산할 수 있습니다.Q-R-T-P-C-R 분석법을 숙달하면 H1 서브타입 분석은 하루 만에 완료할 수 있으며, 적절히 수행될 경우 히스톤 추출 및 HPRC 분석은 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 히스톤 H1 유전자의 Q-R-T-P-C-R 분석을 시도할 때는 RNA 분해를 방지하고 게놈 DNA 오염을 제거하는 것이 중요하며, 무엇보다 역전사 반응에 random primer를 포함하는 것이 매우 중요합니다. 히스톤 추출 및 HPOC 분석 시에는 단백질 분해를 막기 위해 추출 버퍼에 단백질 억제제를 즉시 첨가해야 하며, 또한 완전한 히스톤 추출을 용이하게 하기 위해 염색질을 완전히 해리시키는 것에 주의를 기울여야 합니다.이 영상을 시청한 후에는 mRNA와 단백질 수준 모두에서 포유류 histo H1 서브타입의 발현을 종합적으로 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

expression-analysis-of-mammalian-linker-histone-subtypes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 프로토콜은 질량 분석기 (MS)를 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 특성화하기위한 완벽하게 통합 된 워크 플로우를 설명합니다. 워크 플로는 나노 흐름 액체 크로마토 그래피 및 데이터 분석을위한 지침을 사용하여 세포 배양 또는 조직, 히스톤 유도체 및 소화, MS 분석에서 히스톤 정화를 포함한다. 삼일 -이 프로토콜은 2 내에 완성을 위해 설계되었습니다.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

이 원고는 히스톤 및 그 번역 후 변형을 인식하는 항체의 특이성 프로파일 링에 펩타이드 마이크로 어레이 기술을 적용하는 방법을 설명합니다.

펩티드 Microarrays를 가진 Histone 항체 특이성의 분석

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

고처리량 단일 분자 이미징 기술인 DNA 커튼은 다양한 단백질-DNA 상호 작용의 실시간 시각화를 위한 플랫폼을 제공합니다. 본 프로토콜은 DNA 커튼 기술을 활용하여 Schizosaccharomyces pombe bromodomain-containing AAA+ ATPase인 Abo1의 생물학적 역할과 분자 메커니즘을 조사합니다.

DNA 커튼 기법에 의한 히스톤 조립의 분자 메커니즘 해독

이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.

간 조직의 3D 세포 배양 모델에서 히스톤 번역 후 변형의 글로벌 수준 정량화

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

이 방법은 히스톤 단백질형 특성화 및 조사를 위한 간단하고 빠른 전략을 설명합니다.

2D-TAU 젤 전기영동을 이용한 히스톤 프로테오폼 공개

배우세요 포유류 H1 링커 히스톤 서브타입의 mRNA 및 단백질 발현 분석 방법을 실시간 PCR과 역상 HPLC 기술을 활용하여 정량화하는 종합적인 실험 기법을 익히세요.

포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석

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