포유류의 링커 - 히스톤 Subtypes의 표현 분석

본 실험 절차의 전반적인 목표는 H1 mRNA 수준 분석과 H1 단백질 수준 측정을 통해 히스톤 H1 아형의 발현 수준을 분석하는 것입니다. mRNA 분석을 수행하기 위해, 먼저 배양 세포 또는 마우스 조직에서 총 RNA를 추출합니다. 다음 단계에서는 랜덤 프라이머를 사용하여 총 RNA의 역전사를 수행한 후, 각 H1 아형 유전자에 대해 정량적 실시간 PCR 분석을 실시합니다. 히스톤 H1 단백질 분석은 마우스 조직 또는 배양 세포로부터 총 히스톤 추출물을 준비하는 것으로 시작합니다.

이어서 역상 HPLC 분석을 통해 각 H1 서브타입과 핵심 히스톤 H2B를 분획하고 정량합니다. 최종적으로 정량적 실시간 PCR과 역상 HPLC 분석을 통해 각 H1 서브타입의 mRNA와 단백질 발현 수준을 확인합니다.

저희는 조지아 공과대학교 생물학과 Yuhan FES 연구실의 대학원생들입니다. 오늘은 포유류 H one 서브타입에서 H one의 발현을 분석하기 위한 종합적인 분석법 세트를 보여드리겠습니다. 이 분석법들을 통해 다양한 H one 서브타입에서 mRNA와 단백질 모두의 발현 수준을 정량적으로 측정할 수 있습니다.

Histone H1은 고차 염색질 접힘을 촉진하는 주요 염색질 구조 단백질이며, 세포 분화 및 발달 과정에서 차별적으로 발현되는 여러 Histone H1 변이체가 존재합니다. 이러한 H1 하위 유형의 발현 프로파일링은 고차 염색질 구조와 기능의 조절을 더 잘 이해하기 위해 필수적입니다. 이제 시작하겠습니다.

RNA 추출 전, 모든 작업 표면과 피펫은 70% ethanol로 닦아내고 RNA 제거 용액(RNAs decontamination solution)으로 처리해야 합니다. 이러한 조치는 RNA 오염 및 RNA 분해 가능성을 줄여줍니다. 또한, 모든 과정에서 장갑을 착용해야 하며, 부착성 세포 배양물에서 RNA 추출을 시작하기 위해 배양액을 흡입하고 PBS로 세포를 세척합니다.

그런 다음 웰에서 PBS를 제거하십시오. 고품질의 RNA를 얻기 위해서는 충분한 양의 triol 시약이 필요합니다. 6웰 플레이트의 웰 하나에서 RNA를 추출할 때 triol 시약 1 mL를 사용하며, triol 시약 제조사의 매뉴얼에 따라 세포에서 RNA를 추출하십시오. RNA 추출 후 NanoDrop 1000을 사용하여 RNA 농도를 측정하십시오.

전형적인 수율은 배양 세포 1 × 10⁶개당 5~15 µg의 RNA 범위입니다. cDNA 합성을 진행하기 전, GE 전기영동을 통해 RNA 품질을 분석하여 미량의 genomic DNA에 의한 RNA 오염 가능성을 제거하십시오. 총 RNA를 cDNA로 역전사하기 위해 제조사의 지침에 따라 RNA-free DNase로 RNA 샘플을 처리하십시오. 제조사의 지침에 따라 superscript three first strand synthesis system을 사용하십시오. 대부분의 H1 유전자 mRNA에는 poly-A 꼬리가 없으므로, 프라이머로 oligo-dT 대신 random hexamer를 사용하는 것이 매우 중요합니다.

cDNA 합성을 위해, 역전사 후 cDNA 증폭은 qPCR을 통해 수행할 수 있으며, qPCR 분석 전 SYBR Green 염료로 검출됩니다. 각 H1 유전자 및 내부 참조 유전자에 특이적인 정방향 및 역방향 PCR 프라이머를 설계하였으며, 서면 프로토콜에 기술된 표준 곡선법을 통해 프라이머 효율을 테스트하였습니다. 프라이머, cDNA 및 SYBR Green Super를 혼합하여 각 PCR 반응액을 준비하십시오.

micros EAL 96-well PCR 플레이트에서 반응물을 잘 혼합하고, micros EAL B 점착성 씰을 사용하여 플레이트 커버가 플레이트에 완전히 밀폐되었는지 확인합니다. 그다음 밀폐된 플레이트를 볼텍싱하고 반응 혼합물을 짧게 원심분리합니다. qPCR을 위해 플레이트를 My IQ 단색 실시간 PCR 검출 시스템에 넣습니다.

증폭 이후 설명된 텍스트의 지침에 따라 QPCR 조건을 설정하고 런을 수행하십시오. PCR 효율과 임계 주기 또는 CT 값을 확인하기 위해 증폭 곡선을 검토하십시오. 임계선은 IQ five 광학 시스템 소프트웨어 버전 2.0에 의해 자동으로 설정될 수 있습니다.

Cyber green은 모든 이중 가닥 DNA를 검출하므로, 프라이머 이량체나 오염 물질이 아닌 원하는 앰플리콘만이 증폭 및 검출되었는지 확인하기 위해 QPCR 후에 융해 곡선(melting curve) 분석을 수행하는 것이 매우 중요합니다. 융해 곡선 분석 프로그램을 위해 QPCR 기기는 샘플을 55 °C에서 95 °C까지 0.5 °C 간격으로 가열하며 데이터를 수집합니다. 이중 가닥 DNA의 온도 또는 TM은 앰플리콘의 길이와 GC 함량에 따라 달라지므로, 서로 다른 앰플리콘은 서로 다른 TM 값을 갖게 됩니다.

QPCR 생성물의 미분 융해 곡선을 검토하여 원하는 증폭 산물의 특이적 융해 온도와 노이즈 증폭 피크의 부재를 확인하십시오. 여기서는 TM이 86 °C인 H one A PCR 증폭 산물의 융해 곡선이 예시로 나와 있습니다. IQ five 광학 시스템 소프트웨어를 사용하여 QPCR 데이터를 분석하십시오. H one 이소형 유전자의 발현 값을 하우스키핑 유전자의 발현 값으로 정규화하여 H one 유전자의 상대적 발현 수준을 구하십시오.

안락사시킨 마우스에서 분석 대상 장기를 적출한 후, 얼음처럼 차가운 PBS로 헹굽니다. 본 시연에서는 세척 후 간에서 전체 히스톤(total histones)을 준비하는 과정을 수행합니다. 면도날을 사용하여 조직을 작은 조각으로 다집니다. 다진 조직을 Dounce 균질기에 옮긴 다음, 조직 1g당 10mL의 부피로 수크로스 완충액을 균질기에 첨가합니다.

조직을 10~15회 스트로크로 균질화합니다. 균질물을 15 milliliter 튜브로 옮긴 후, 샘플을 500 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 새 튜브로 옮기고 2000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

세포를 펠렛화하려면 0.5% NP 40가 첨가된 10 milliliters의 sucrose buffer에 세포 펠렛을 다시 현탁합니다. 샘플을 down homogenizer로 옮기고 20분간의 배양 시간 동안 10회 스트로크를 수행합니다. 이 단계에서 핵을 얻을 수 있습니다.

현미경으로 핵의 품질을 검사하십시오. 2000 RPM에서 5분간 원심분리하여 핵을 펠렛화한 후, 상층액은 버립니다. 그다음, 조직 1g당 3mL의 고염 버퍼(high salt buffer)를 사용하여 핵 펠렛을 재부유시킵니다.

샘플을 소형 다운 균질기에 옮기고 5~10회 스트로크로 균질화합니다. 현탁액을 3개의 에핑거 튜브에 나누어 담습니다. 튜브를 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.

배양 후 14,000 RPM에서 10분간 원심분리하여 크로마틴 펠렛을 형성합니다. 상층액을 제거한 후, 각 크로마틴 펠렛에 0.2 normal 황산을 0.8 milliliters 첨가하여 전체 히스톤을 추출합니다. 에핑거 튜브 페스틀(einor tube pestle)을 사용하여 펠렛이 완전히 분해될 때까지 충분히 갈아줍니다.

회전 플랫폼에서 샘플을 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 원심분리 후, 상층액을 두 개의 EOR 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 얼음처럼 차가운 에탄올을 2.5배 부피만큼 첨가합니다.

샘플을 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관한 다음 날, 14,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 총 히스톤을 펠렛으로 침전시키고 상층액을 제거합니다. 펠렛을 70% ethanol로 세 번 세척한 후, 튜브 뚜껑을 열어 벤치 위에 20~30분 동안 두어 공기 건조시키고 즉시 HPLC 분석을 진행합니다. 역상 컬럼의 용량과 HPLC 장비에 따라 권장되는 부피의 이중 증류수에 히스톤 펠렛을 재현탁하고, 14,000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

불용성 잔류물을 제거하기 위해, GE ACTA purifier UPC 900과 같은 HPLC 시스템의 역상 컬럼에 50~100 µg의 총 히스톤 단백질을 주입합니다. 컬럼의 막힘을 방지하기 위해 과도한 양의 단백질 주입은 피해야 합니다. 서면 프로토콜에 기재된 대로 아세토니트릴 기울기를 증가시키며 링커, 히스톤 및 핵심 히스톤을 분리합니다. 유출액은 214 nm에서 모니터링하며, HPLC 프로파일을 기록하고 분석합니다. 단백질 분획은 추가 분석을 위해 GE FRAC 920 분획 자동 수집기로 수집할 수 있습니다.

여기에 마우스 간 및 마우스 배아 줄기세포에서 준비된 cDNA를 사용한 H one A-Q-P-C-R 반응의 전형적인 증폭 곡선이 제시되어 있습니다. 증폭 플롯을 평가한 결과, 각 샘플의 3반복 QPCR 반응이 거의 동일한 CT 값으로 일관된 신호를 나타내어 높은 재현성을 보여주었습니다. RT minus QPCR 반응에서 증폭산물이 축적되지 않은 것은 게놈 DNA 오염이 없거나 최소 수준이었음을 나타내며, H one 유전자와 하우스키핑 유전자의 CT 값을 이용하여 각 H one 유전자의 상대적 RNA 발현 수준을 계산하였습니다.

여기에 제시된 그래프는 H1A 및 H1.0 유전자에 대해 계산된 결과의 예시입니다. H1A mRNA의 상대적 발현 수준은 생쥐 간과 비교했을 때 생쥐 배아줄기세포에서 더 높게 나타나는 반면, H1.0 발현은 배아줄기세포보다 간에서 훨씬 더 높습니다. 생쥐 배아줄기세포와 성체 생쥐 간에서의 H1A 또는 H1.0 발현 차이는 히스톤 단백질의 HPLC 프로파일에서도 분명하게 확인할 수 있습니다.

H10. 분화 특이적 H1은 성체 마우스 간에 다량으로 축적됩니다. 이와 대조적으로, H10 단백질은 분화되지 않은 마우스 배아줄기세포에서는 거의 나타나지 않습니다.

반면, H1A는 배아줄기세포에서 높게 발현되지만, H1 피크 정량 분석 결과 성체 마우스 간에서는 낮은 수준으로 나타납니다. HPLC 프로파일을 통해 성체 마우스 간 내 H1 가문 중 각 개별 H1 하위 유형의 상대적 비율이 결정됩니다. 또한, 뉴클레오좀당 개별 H1 하위 유형의 값은 해당 H1 하위 유형의 214 nanometers 흡광도 정규화 피크 값과 H2B 정규화 값의 2분의 1 사이의 비율로부터 계산할 수 있습니다. 이와 유사한 방식으로 뉴클레오좀당 총 H1 값도 계산할 수 있습니다.

Q-R-T-P-C-R 분석법을 숙달하면 H1 서브타입 분석은 하루 만에 완료할 수 있으며, 적절히 수행될 경우 히스톤 추출 및 HPRC 분석은 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 히스톤 H1 유전자의 Q-R-T-P-C-R 분석을 시도할 때는 RNA 분해를 방지하고 게놈 DNA 오염을 제거하는 것이 중요하며, 무엇보다 역전사 반응에 random primer를 포함하는 것이 매우 중요합니다. 히스톤 추출 및 HPOC 분석 시에는 단백질 분해를 막기 위해 추출 버퍼에 단백질 억제제를 즉시 첨가해야 하며, 또한 완전한 히스톤 추출을 용이하게 하기 위해 염색질을 완전히 해리시키는 것에 주의를 기울여야 합니다.

이 영상을 시청한 후에는 mRNA와 단백질 수준 모두에서 포유류 histo H1 서브타입의 발현을 종합적으로 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.