Name: 전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 학습하세요 마우스 좌골 신경 크러시와 근육 전체 마운트 분석 방법을 통해 재생성을 평가하는 기술을. 이 재현 가능한 프로토콜은 신경 손상 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 또한 NIH 교부금 K08NS065157 (TAF까지)에 의해 지원되었다 Musculoskeletal 장애에 대한 펜은 센터, 관절염의 국립 연구소에서 보너스 번호 P30AR050950는 Musculoskeletal와 피부 질환이 작품을 (TAF와 스티븐 S. Scherer) 지원. 마지막으로, Shriners 소아 연구 센터 종자 기금 (TAF)이 작업을 지원합니다. 우리는 처음에는 그림 1의 스케치를 생산하는 그녀의 도움을 전체 장착 절차와 에이미 A. 김 시연을 위해 박사 영 진의 아들을 인정하고 싶습니다.

1. 동물 과목 1.1. 치료 <ol><li> 모든 동물의 절차는 고통과 불편을 최소화하기 위해 취한 조치로, 지방 기관의 동물 관리 및 윤리위원회의 승인을 보건 가이드라인의 사용 및위원회와 국립 연구소에 따라서 수행되어야한다. </li><li> 우리 쥐들이 12 시간 역방향 빛과 어둠의 사이클에 대한 온도 제어 조건에서 지내게, 수사관 마우스 차우와 물 광고 libitum 동안 시작했다. </li><li> 좌골 신경 호감이 수행될 때 성인 중생의 연구 내용은 마우스 연령 적어도 6 주가 걸릴한다. 이 나이 polyneural 신경근육학 분기점의 가지치기가 자리를 차지할되는 시간을 넘어선 것이다. </li><li> 이 실험에서 우리는 6-8주 오래된 C57BL / 찰스 리버로부터 얻은 6 생쥐를 사용했습니다. 좌골 신경 호감 (예 : 축삭의 성장 속도) 이후에 재생을 비교하면 axonal 중생의 차이가되지 않은 것처럼 마우스 변종이 동일해야합니다다른 근친 변종 15,16 사이 에드. 유전자 조작 생쥐가 사용될 경우 littermate 컨트롤이 가장 적합합니다. </li></ol> 1.2. 외과 준비 <ol><li> 동물 intraperitoneal 주사를 통해 케타민 (100 밀리그램 / kg)과 xylazine (10 밀리그램 / ㎏)의 칵테일을 사용하여 수술에 대한 깊은 anesthetized 있습니다. 각 동물은 또한 수술의 고통을 최소화하기 meloxicam의 피하 주사 (10 밀리그램 / ㎏)받습니다. </li><li> 두 엉덩이쪽에 신중하게 수술 가위 (Roboz, RC-5903) 및 왁스는 나이르 머리 제거 크림 (현지 약국에서 발견)와 함께 완료를 사용하는 면도있다. </li><li> 피부 소독면 스쳐 applicators 및 betadine 수술 스크럽 (피셔 과학, 19066452)를 사용 정화입니다. </li><li> 안과 연고 (피셔 과학, 19082795)은 소독면 스쳐 applicators를 사용하여 눈에 적용됩니다. </li><li> 마우스는 미리 온수 homeot를 보관되었습니다 그 밑에, 깨끗한 스테인레스 강판에 배치됩니다hermic 담요 시스템 (하버드 장치, 507222F). 동물 온도는 37에서 관리하고 있습니다 ° C. </li><li> 모든 사지는 무릎 관절이 신체 (그림 1, 패널)과 직각을 만드는 것이 대칭 때문에 두 다리 위치를 위해 총감독과 함께 아래로 녹화됩니다. </li><li> 수술 부위가 무균 드레이프로 덮혀 있습니다. 모든 악기는 압력솥이나 고온 비드 살균 (파인 과학 도구, 18000-45)와 외과 의사들이 마스크, 가운 및 멸균 장갑을 끼고 소독을하고 있습니다. </li></ol> 2. 재현성 좌골 신경 호감 <ol><li> 준비 후, 중간선 (그림 1)에 걸쳐 반 원형 절개는 피부에서 만들어졌다. 피부는 부드럽게 기본 근육의 해부하고, 절차를 수행하는 동안 밖에 나가 있으여 접혀있다. 그것은 절차를 수행하는 동안 0.1 ML 멸균 식염수 (Hospira, 0409-4888-20)의 애플 리케이션을 사용하여 촉촉한 보관됩니다. </li><li> 대둔근에와 팔뚝 femori의 앞부분은 머리 사이 fascial 비행기 열기S는 좌골 신경 (그림 1, 패널)을 보여준다. 수술 컨트롤은 contralateral 좌골 신경이 노출되어 동원했지만 그대로 남아 있어야합니다. gluteal 근육 그런 다음 다시 반대와 6-0 꼰 실크, 비 흡수성 봉합을 (Roboz, SUT-1073년에서 1011년까지)를 사용하여 봉합합니다. </li><li> 실험적 좌골 신경은 다음 시각화 (그림 1, 패널 B)을 완화하기 위해 자리에 견인기와 같은 방식으로 노출됩니다. 견인기는 사용하기 전에 소독을하고 있습니다. 참고 : 견인기 시스템은 상용 있지만, 그들은 종종 매우 비쌉니다. 우리는 저렴한 하드웨어 용품 및 곤충 핀을 (자료 섹션을 참조)을 사용하여 만족스러운 리트 렉터 시스템을 만들 수있었습니다. </li><li> 좌골 신경은 부드럽게 iridectomy 가위를 사용하여 주위 결합 조직에서 해방됩니다. </li><li> 좋은 45분의 5 (파인 과학 도구, 11251-35) 포셉 사용하여 신경이 슈퍼 벌금 hemostatic 포셉의 아래쪽 턱 (파인 과학이 너무에 배치됩니다혹시, 13020-12). 세 fascicles는 순차적 아니라 서로의 꼭대기 (그림 1, 삽입된 페이지 B)에 정렬됩니다. hemostatic 포셉들은 일각에서 1.5 mm에서 마르크와 함께 새겨져있다. 좌골의 바깥쪽 부분은 호감 전에이 표시가있는 라인에 배치됩니다. 이것은 균일 너비 호감을 보장하고, 분쇄 력으로 인해 평평 때 신경이 hemostatic 포셉의 문턱 넘어 연장되지 않습니다. 신경이 포셉 팁 초월해 경우 신경이 부분적으로만 짓눌린됩니다. </li><li> 호감은 좌골 신경의 경로를 대략 스레드에 의해 측정된대로, 세 번째 발가락부터 45mm에서 신경에 수직 이루어집니다. 신경은 hemostatic 포셉 3 클릭에 15 초간 한번 짓눌린있다. 치료는 신경을 운동하지 가져옵니다. hemostats가 다시 오픈하면, 전체 신경이 호감이가는 사이트에서 반투명이어야합니다. </li><li> 에서 미리 빠져있다 hemostatic 포셉의 두 번째 쌍 (첫번째와 동일)분말 탄소 (피셔 과학, C272-500)은 호감 사이트를 표시하는 데 사용됩니다. 신경은 3 클릭에 15 초간 같은 호감이 사이트에 짓눌린있다. 마킹 없음 탄소는 초기 호감의 경계 넘어 확대해서는 안됩니다. 호감이 사이트의 정확한 마킹이 필요한 경우에 특히 중요합니다. 사용하기 전에 탄소 분말은 두 시간 동안 자외선에 노출 소독을하고 있으며, 이후 무균 기술을 사용하여 처리됩니다. <ol><li> 면 탄소의 포셉을 미리 찍어하지만 외과 사이트에서 널리 탄소를 배제, 포셉은 분말 탄소에 오픈하고 나서 부드럽게 (그러나 클릭하지 않음) 폐쇄 다물고, 그리고 hemostats의 외부에있는 탄소는 멸균 거즈를 사용하여 소멸된다 . 포셉는 분쇄 표면이 균일하게 가루 탄소로 코팅되어 있는지 확인하기 위해 적어도 3 배 배율 하에서 선택되어 있는지 확인하십시오. 필요하다면, 그들은 다시 감소하고 피곤합니다. </li></ol></li><li> gluteal 근육은 다시 반대와 contralateral 측면과 같은 방식으로 봉합된다. </li><li> 마지막으로, 피부 절개는 9mm 반사 클립 (; : 500,345 Applier 세계 정밀 계측기, 500,346)를 사용하여 닫힙니다. 9mm 반사 클립 운동, 작은 반사 클립 또는 6-0 봉합 (Roboz, SUT-1073년부터 1011년까지)을 제한하려면 판단될 경우 대신 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 수술 케어 <ol><li> 그들은 운동의 흔적을 보여주 ° C까지 절차에 따라 동물 37 손난로에 표시됩니다. </li><li> 그들은 다음 물과 음식 히드로겔 및 침수 식품의 형태로 바닥에 쉽게 액세스할 수있는 그들의 집을 케이지로 다시 이동됩니다. </li></ol> 4. 세미 씬 준비 <ol><li> pentobarbital의 과다 복용 (300 밀리그램 / ㎏)에 이어 다리 근육은 좌골 신경 *을 폭로 제거됩니다. 현장에 남아있는 신경으로, 뒷다리 및 엉덩이 부분은 30 분 동안 얼음에 0.1 M 인산 완충액의 2 % paraformaldehyde와 2 % 글루 테르 알데히드에 열중하고 있습니다. * 전체 마운트 근육 준비를 완료하면 근육이 수확입니다좌골 신경을 노출하기 전에 에드. </li><li> 신경 신중 근위 끝에만을 처리하기 위해 총감독으로 제거됩니다. 그렇다면 신경이 세 개의 추가 시간 동안 동일한 정착액에 사후 고정입니다. </li><li> 고정 후 신경이 0.1 M 인산 완충액으로 세 번 씻어서있다. </li><li> 신경은 1 시간 0.1 M 인산 완충액으로 2 % 오스뮴의 tetroxide에 열중하고 있습니다. </li><li> 신경 그러면 점차 농축 에탄올의 연속 침지 (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 %, 100 %, 100 %)에 의해 탈수있다. 각 침지은 15 분입니다. </li><li> 탈수 신경은 세 분마다 프로필렌 산화물에 두번 incubated있다. </li><li> 그러면 신경이 프로필렌 옥사이드의 1:1 혼합물에 열중하고 (보통 하룻밤) 적어도 6 시간 동안 812 어젯 서비스하고 있습니다. </li><li> 그러면 신경이 프로필렌 옥사이드의 2시 1분 혼합물에 잠겨과 하룻밤 812 어젯. </li><li> 마지막으로, 신경이 6 시간 동안 순수 퍼가기 812에 잠겨 후 적절한 금형 및 바에 포함된48 시간 동안 60 ° C에서 ked. </li><li> 1.0 μm의 섹션은 toluidine과 청색 유리 나이프와 스테인드 함께 Ultracut UCT ultramicrotome (Leica)를 사용 호감 사이트에서 설정된 거리에서 말초 신경 유세에서 해고된다. 얇은 부분은 또한 전자 현미경에 의한 ultrastructure의 시험 생산 수 있습니다. </li></ol> 5. 전체 마운트 근육 준비 <ol><li> 첫 번째 생쥐는 pentobarbital의 과다 복용 (300 밀리그램 / ㎏)로 희생되고 두 다리는 무릎에서 제거됩니다. </li><li> 뒷다리에있는 네 개의 근육이 분석을 위해 제거됩니다 : tibialis 앞부분 (TA), 신근 digitorum longus의 (편집 판단리스트), soleus 및 peroneus longus. </li><li> 모든 근육은주의 절개를 통해 제거하고 검은 sylgard (피셔 과학, NC9492579) 코팅 접시 자신의 결합 조직을 통해 박혀있다. 그들은 30 분간 4 % paraformaldehyde에 PBS에서 씻어서 다음 해결됩니다. </li><li> TA는 다음 10월 (피셔 과학, 14-3에 박혀 PBS에서 씻어서 있습니다73-65), 그리고 신속하게 아세톤과 드라이 아이스 목욕에 얼어 붙 어서. <ol><li> 그것은 -80 ° C에서 전체 마운트 준비가 실패할 경우에 얇은 sectioning 위해 저장됩니다. 일반적으로 조교가 적절한 온 마운트에 비해 너무 두께입니다. </li></ol></li><li> 편집 판단리스트, soleus 및 peroneus longus은 0.1 M 글리신 * (피셔 과학, AC12007-0010, PBS에 희석)에 배치 PBS에서 3 × 10 분 동안 씻어서하고 30 분 후, 다시 PBS에서 3 × 10 분 씻어서. 그들은 다음, -20에서 정확히 5 분간 얼음 차가운 100 % 메탄올 ° C에서 침묵 PBS에서 3 × 10 분 씻어서, 그리고 알파 - bungarotoxin (PBS에 1:200 희석) 30 분 fluorescently 복합 목욕을하고 있습니다. 근육은 2 % BSA에 1 시간 블록 (KPL, 50-61-00)와 0.2 % 트리톤 X-100 (도트 과학 법인, 9002-93-1) 다음 PBS에서 3 × 10 분 동안 씻어서있다 같은 2% BSA/0.2 %의 트리톤 블록에 희석 일차 항체의 칵테일에서 4 ° C에서 출렁 이는 동안 PBS에서 *와 하룻밤 incubated. * 미군 병사ycine 및 차단 솔루션은 근육 수확과 같은 날에 만들어 사용하기 전에 실온에서 30~60분 동안 흔들 수 있습니다. <ol><li> , 마우스 단클론 시냅스 소포 마커 (SV2 DSHB, 1:1000 희석)와 rhodamine 복합 알파, axons과 신경근육학 시냅스를 기념하기 위해, 마우스 단클론 neurofilament 마커의 조합 (1:1000 희석 Covance, SMI-312R)를 사용 - bungarotoxin (시그마 - 올드 리치, 1:200 희석). 반응 Schwann 세포를 표시하기 위해 우리는 토끼 반 GAP-43 (Novus 체액, NB300-143, 1 / 500 희석)을 사용합니다. 일차 항체는 IgG1 나눠 봤는데요 특정 플루오레신 복합 염소 항 마우스 이차 항체와 DyLight 649 복합 당나귀 안티 - 토끼 (1:200 희석 잭슨 ImmunoResearch)과 시각입니다. </li></ol></li><li> 그 다음날은 근육은 3 × 10 분 동안 PBS에서 씻어서 및 이차 항체에 incubated (2 % BSA/0.2 %의 트리톤 차단 솔루션)를 1:200 희석된다. 그들은 다음 PBS, 구경에 2 × 10 분 씻어서있다그리고 또 10 분 동안 PBS에서 헹굼, 5 분 DAPI에 침지 (탈이온수 300 NM로 희석 Invitrogen, D3571)에 의해 llowed. </li><li> 각 근육 그러면 검은색 sylgard (피셔 과학, NC9492579) 코팅된 배양 접시에서 해부한다. 인테리어 근육 섬유 (그림 3, 패널 AC)를 물러나고하여 처음에는 힘줄 근육 속으로 삽입 지점에서 제거하고 근육 thinned있다. 케어는 endplate 밴드 (그림 3, 패널 DF)를 포함하여 근육의 외부 표면을 유지하기 위해 가져옵니다. 그 결과 근육이 vectashield (벡터 연구소, H-1000) 및 22 플러스 슬라이드 (피셔 과학, 12-550-15)에 탑재되어 투명 매니큐어 날인 X 40mm 유리 coverslips (피셔 과학, 12-548-5C) 양면에. 제대로 endplate 밴드 연락처 coverslip 슬라이드에 장착합니다. </li></ol> 6. 중생을 측정 <ol><li> 중생이 세 근육 (peroneus, 편집 판단리스트 및 soleus)에 추정 수 있습니다. 우리는 종종 예십사일 신경 호감 후 아민 재생, NMJs의 상당한 비율이 다시 innervated되는 한 번에. 둘 다 이전하고 나중 포인트는 요청을 받고 과학적 질문에 따라도 적합합니다. 각 근육에서 전체 endplate 밴드의 재 innervation을 면밀히 검토합니다. 전용 욕실 얼굴 표면 NMJs가 채점됩니다. 이러한 방식으로, 근육 당 최소한 200 NMJs 신속하게 검사 수 있습니다. </li><li> 근육을 입증하려면 다시 innervation 우리는 &#39;다시 innervation 비율 &quot;을 결정합니다. 분모는 α-bungarotoxin 구속력과 Schwann 세포 GAP-43 immunoreactivity에 의해 표시된대로 denervated 신경근육학 분기점의 번호입니다. 분자는 neurofilament/SV2 immunoreactivity로 표시된 재 innervated NMJs의 번호입니다. 필요한 경우 NMJs는 두 부분 (SV2에 의한 α-bungarotoxin의 불완전 커버 리지) 또는 완전 (SV2에 의한 α-bungarotoxin의 완전한 범위) 다시 innervated으로 분류됩니다. 다시 innervated 및 denervated NMJs의 예를 들어 그림 3, 패널 G와 H는보고. </li></ol> 7. 대표 결과 <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig1.jpg" /> 그림 1. 신경 호감 중요한 뒷다리의 해부학 도식. A.이 반 원형의 피부 절개가 근본적인 근육을 공개하였습니다. B. gluteal 근육은 (위의 단계 2.4)로 구분하고, 좌골 신경이 발표되었습니다. 화살표는 대략적인 호감이 사이트를 나타냅니다. 견인기 게재 위치는 일반적인 가이드로 표시되며, 호감이가는 사람을위한 hemostatic 포셉의 좌골과 접근 시각을 완화하기 위해 각각의 수술 중에 조정됩니다 B는 (삽입된 페이지). 막 호감 전에 hemostatic 포셉의 아래턱에있는 좌골 배치 (단계 위의 2.5). 별도 fascicles는 호감을하는 동안이 아닌 수직으로 그들이 수평으로 인접해있다는 것을 입증하는 라벨이 있지만됩니다. 비록 세 fascicles이 다이어그램에 표시된하고, 하나도 사분의 일 분책, peroneal의 관절 지점을 볼 수 있습니다. 좌골 신경의 분기 패턴의 상세한 해부 그림은 호감 지점 말초 fascicles 들어, 쥐, 그림 188 17 그린의 해부학을 참조하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig2.jpg" /> 그림 2. 조각 좌골 신경의 현장과 toluidine 푸른 스테인드, 세미 얇은 부분의 탄소 표시된 호감 사이트. A. 원래의 장소에 호감 사이트 (왼쪽 뒷다리)의 예. 블랙 카본은 호감이가는 사이트를 나타냅니다. 별표는 허벅지의 근육을 innervates 및 호감 수술시 유용한 랜드마크 역할을 tibial 신경의 지점을 표시합니다. 좌골 신경의 tibial 부문은 청색, 녹색의 peroneal에 명시된 바와 같이, 노랑. B. 세미 얇은 섹션 sural은 hemostatic 강제로 수행 완전한 호감을 입증하고 있습니다PS. 직각 포셉 수행할 불완전한 호감을 보여주 C. 세미 얇은 부분. 두 이미지에서 degenerating myelin 분석 자료가 화살촉으로 표시됩니다. 패널에서 C의 화살표가 보존 myelin 프로필의 예를와 겪었던 axons의 클러스터를 표시합니다. 스케일 바는 10 μm의입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig3.jpg" /> 그림 3 전체 마운트 근육의 약도와 대표 NMJs AC :.. 편집 판단리스트 (A) peroneus의 longus (B), 그리고 뒷다리의 탈퇴 이후 soleus (C) 근육의 거라구 이미지. 표시된 근육이 오른쪽 뒷다리부터입니다. 무릎 및 발목의 해부 학적 방향도 참조용으로 제공됩니다. 힘줄 흰색 물들고과 근육 위에 위치했을 때 단단한 검은 라인에 요약되어 있습니다. 그들은 근육 아래에 연장 때 그들은 검은 점선에 요약되어 있습니다. 베인은 빨간색 점선 라인에 표시됩니다.근육은 같은 파란색 화살표로 표시 컷 사이트에서 떨어져 벗겨하고, 이후 thinned있다. 숱이 후, 근육은 고정된 힘줄 중에 남아 주위를 절단하여 핀에에서 분리된 DF가 :. 거라구 이미지는 전체 마운트 근육의 결합 조직 및 숱이 이후의 제거 후. endplate 밴드는 각 근육에 설명되어 있습니다 GH :. 십사일 다시 innervated (G)와 denervated (H) 신경근육학의 분기점을 보여주는 좌골 신경 호감 후 Soleus 전체 마운트 근육. 위의 섹션 5.5.1에​​서 설명한 것처럼이 패널에서는 NMJs, axons 및 Schwann 세포는 시각입니다. 아세틸콜린 수용체는 axons 녹색 빨간색이며, Schwann 세포는 파란색으로 처리합니다. 패널 G에서 화살표가 축삭으로 다시 innervated되었습니다 NMJ의 영역을 나타냅니다. 패널에서 H의 화살촉은 GAP-43 양성 Schwann 세포 프로세스를 나타냅니다. axons의 부재를 적어 둡니다. 스케일 바는 10 μm의입니다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

우리는 호감이 사이트의 정확한 마킹과 함께 안정적으로 완전한 좌골 신경 호감을 얻을 수있는 방법을 제시했습니다. 이전에 언급했듯이, 좌골 신경 호감은 마우스 및 쥐의 말초 신경 손상의 일반적인 모델입니다. 호감의 각 방법의 장점과 단점을 가지고 있지만, 우리는이 방법을 쉽게 특수 장비 (예 : 특수 클램프 등)을 최소로 표시되었다 완전한 호감을 생산 발견. 호감 방법 마우스 좌골 신경 호감에 사용되는 가장 일반적인 악기가 5 호 직각 포셉 때문 이예요. 이런 방법을 사용하여 완전한 호감을 얻을 수 있지만, 우리는이 악기는 특히 새 사용자의 손에, 변수 호감을 (신경을 찢어 너무 작은 힘이 떠나 겪었던 axons 혹은 너무 큰) 생산 것으로 나타났습니다. 호감을 생성하는 데 사용되는 다른 덜 일반적인 방법은 작은 동맥류 클립, 액체 질소로 차게 포셉, 그리고 speciall 포함y...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 (설명 / 수량) </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 번호 0000 블레이드와 미니 클리퍼 </td><td> Roboz </td><td> RC-5903 </td></tr><tr><td> 나이르 헤어 리무버 (9온스) </td><td> 교회 드와이트 유한 주식 회사 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Betadine 외과 스크럽 (1갤런) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 19066452 </td></tr><tr><td> 안과 연고 (일온스) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 19082795 </td></tr></tbody></table> 외과 도구 : <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 (설명 / 수량) </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> FST 250 핫 비드 살균기 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 18000-45 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> 아이리스 가위 (11cm 길이) </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 500,216 </td></tr><tr><td> 포츠 - 스미스 포셉 (직선, 18cm, 1x2 치아) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11024-18 </td></tr><tr><td> 맥퍼슨 - Vannas 가위 (5 밀리미터 블레이드) </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14124-G </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 집게 - Dumoxel 표준 팁 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-30 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 45분의 5 집게 - Dumoxel 표준 팁 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11251-35 </td></tr><tr><td> 울트라 파인 Hemostats (직선, 부드러운 내부 표면) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 13020-12 </td></tr><tr><td> 분말 활성 탄소 (500 G) </td><td> 피셔 과학 </td><td> C272-500 </td></tr><tr><td> C-1 니들 (무균, 실크, 블랙, 꼰와 크기 6-0 봉합비 흡수성, 18 &quot;길이; 36 박스) </td><td> Roboz </td><td> SUT-1073년부터 1011년까지 </td></tr><tr><td> 목표 클립 Applier (9mm 클립의 경우) </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 500,345 </td></tr><tr><td> 9mm 스테인레스 목표 클립 (100/box) </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 500,346 </td></tr></tbody></table> 동물 케어 : <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 (설명 / 수량) </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 0.9 %의 나트륨 염화물 주입 (방부제 무료, 20 ML) </td><td> Hospira </td><td> 0409-4888-20 </td></tr><tr><td> 유연한 프로브를 갖춘 Homeothermic 담요 시스템 (매체, 115 VAC, 60 Hz에서) </td><td> 하버드 장치 </td><td> 507222F </td></tr></tbody></table> 외과 PlatforM 및 견인기 : (지역 철물점에서 구입) <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 (설명 /) </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 플랫폼 (가공된; ~ 12 &quot;x12&quot;1 개 / 8 &quot;) </td><td> 일 </td></tr><tr><td> 버튼 자석 (예 : 이클립스 E825) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 스테인레스 볼트 (3 &quot;긴, 단추 자석에 의해 결정 직경) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 너트 (볼트 들어갈 크기) </td><td> 9 </td></tr><tr><td> 고무 밴드 (라이트 장력) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 곤충 핀 (끝 모두가 후크를 형성 구부 러) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> 세미 된 것 같아 : <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 (설명 / 수량) </td><td> 공급 &lt;/ strong&gt;을 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (1 ㎏) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> 나트륨 인산 이염 무수 (500g, 인산 버퍼를 준비하는 데 사용됩니다) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> 나트륨 인산 일염기의 무수 (1kg, 인산 버퍼를 준비하는 데 사용됩니다) </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> 글루 타 알데히드 (50 %, 10 × 10 ML) </td><td> 테드 펠라 주식 회사 </td><td> 18,431 </td></tr><tr><td> 오스뮴의 Tetroxide (4 % 수용액, 10 × 10 ML) </td><td> 테드 펠라 주식 회사 </td><td> 18,465 </td></tr><tr><td> 프로필렌 산화물 (450 ML) </td><td> 테드 펠라 주식 회사 </td><td> 18,601 </td></tr><tr><td> 퍼가기 812 (키트, 하드 블록 / 높은 이미지 대비를위한) </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 14,120 </td></tr><tr><td> ToluidiNE 블루 (25 G) </td><td> 테드 펠라 주식 회사 </td><td> 19,451 </td></tr></tbody></table> 전체 마운트 근육 준비 및 Immunohistochemistry : <table border="1"><tbody><tr><td> 이름 (설명 / 수량) </td><td> 공급 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde (1 ㎏) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> 나트륨 인산 이염 무수 (500g, 인산 버퍼를 준비하는 데 사용됩니다) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> 나트륨 인산 일염기의 무수 (1kg, 인산 버퍼를 준비하는 데 사용됩니다) </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> 10% BSA의 희석제 / 차단 솔루션 (200 ML) </td><td> Kirkegaard &amp; 페리 연구소 주식 회사 </td><td> 50-61-00 </td></tr><tr><td> 트리톤 X-100 (100 ML) </td&gt; <td> 다트 과학 법인 </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> 글리신, 98 % (1kg) </td><td> 피셔 과학 </td><td> AC12007-0010 </td></tr><tr><td> 조직 - 테크 Cryo 10 월 컴파 운드 (12시, 4 오즈의 마법사 &#39;병) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 14-373-65 </td></tr><tr><td> Sylgard DOW 170 (2파운드 키트) </td><td> 피셔 과학 </td><td> NC9492579 </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 곤충 핀, 사이즈 1 (100/pkg) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 26001-40 </td></tr><tr><td> Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 밀리그램) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> T0195-.5MG </td></tr><tr><td> SMI-312 (0.1 ML)에 대해 마우스 단클론 항체 </td><td> Covance </td><td> SMI-312R </td></tr><tr><td> SV2 (0.1 ML)에 대해 마우스 단클론 항체 </td><td> 발달 연구 하이 브리 도마 은행 (DSHB) </td><td> SV2 </td></tr><tr><td> 토끼 폴리GAP-43 반대 clonal 항체 </td><td> Novus 체액 </td><td> NB300-143 </td></tr><tr><td> Flourescein 복합 염소 안티 - 마우스 IgG, 특정 Fcγ 서브 클래스 1 </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=115-095-205&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">11 5-095-205</a> </td></tr><tr><td> DyLight 649 복합 돈키 안티 - 토끼 IgG </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=711-495-152&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">711-495-152</a> </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate, 10 밀리그램) </td><td> Invitrogen </td><td> D3571 </TD&gt; </tr><tr><td> Vectashield 장착 중형 (10 ML) </td><td> 벡터 연구소 </td><td> H-1000 </td></tr><tr><td> Superfrost 플러스 현미경 슬라이드 (화이트, 사이즈 : 75 X 25mm, 144 팩) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Fisherfinest 프리미엄 커버 안경 (크기 : 40 X 22mm, 1 온스 팩.) </td><td> 피셔 과학 </td><td> 12-548-5C </td></tr></tbody></table>

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

말초 신경계 (PNS)의 중생은 널리 인간의 질병에 그것의 관련성을함으로써 가능한 CNS 재생 1의 실패를 계몽 PNS의 뉴런에 의해 탑재된 강력한 재생 반응을 이해하는 모두 공부하고 있습니다. 좌골 신경 호감 (axonotmesis)는 설치류 2 말초 신경 손상의 가장 일반적인 모델 중 하나입니다. 그 중생은 3,4 최적 수 있도록 인터럽트에게 반해 모든 axons하지만 Schwann 세포 기저 laminae는 보존됩니다. 이 조사가 정확하게 Schwann 세포 및 기저 laminae 사 모두와 상호 작용하는 성장 축삭의 능력을 공부하실 수 있습니다. 쥐 실험은 일반적으로 신경 호감을 위해 선호하는 동물 모델되었습니다. 그들은 널리 사용할 수 있으며 자신의 lesioned 좌골 신경은 인간의 신경 병변 5,4의 합리적인 근사치를 제공합니다. 쥐의 신경보다 크기가 작은 있지만, 마우스 신경은 많은 유사한 자질을 가지고 있습니다. 가장 중요한 것은 그래도 mous전자 모델 때문에 유전자 변형 라인의 넓은 가용성을 증가 가치는 이제 신경 재생 6, 7에 대한 중요한 개별 분자의 상세한 해부을 허용합니다. 이전 수사관은 단순 직각 포셉, 냉장 포셉, hemostatic 포셉, 혈관 클램프, 그리고 탐정 설계 클램프 8,9,10,11,12 포함한 신경 호감이나 부상을 생산하기 위해 여러 방법을 동원했습니다. 수사관은 또한 봉합, 탄소 입자와 형광 구슬 13,14,1 포함한 부상 사이트를 표시하는 다양한 방법을 동원했습니다. 우리는 정확하고 영구가 좋은 hemostatic 포셉 및 마킹 이후 탄소 호감이 사이트를 방문하여 호감이 사이트의 마킹으로 reproducibly 전체 좌골 신경 호감을 얻는 우리의 방법을 설명합니다. 좌골 신경 호감 절차의 설명의 일환으로 우리는 또한 근육 전체의 비교적 간단한 방법을 포함하는 것은 우리가 이후에 재생을 계량하는 데 사용할 탑재합니다.

이 보고서에서는 마우스 좌골 신경을 파멸시키는 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽게 사용할 수 hemostatic 집게를 사용하여 쉽고 reproducibly 전체 좌골 신경 호감을 생산하고 있습니다. 또한 좌골 신경 호감 후 신경 재생의 분석에 적합한 근육 전체가 마운트를 준비하는 방법을 설명합니다.

말초신경계(PNS)의 재생은 인간 질환과의 관련성 및 강력한 재생 능력을 이해하기 위해 널리 연구되고 있습니다.

본 절차의 전반적인 목적은 좌골 신경 손상(sciatic nerve crush)의 단순하고 재현 가능한 방법과 좌골 신경 손상 후 근육 재신경지배(reinnervation)의 전체 마운트 분석법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수술용 리트랙터를 적절히 배치하여 신경에 원활하게 접근할 수 있도록 좌골 신경을 노출시킵니다. 그다음, 지혈 겸자(hemostat forceps)로 신경을 압착하고 숯(charcoal)으로 신경에 표시합니다.그 다음, 뒷다리에서 좌골 신경이 지배하는 개별 근육들을 제거합니다. 마지막 단계는 면역 염색 후 전체 마운트 분석을 위해 개별 근육을 박리하는 것입니다. 결과적으로, 재현 가능한 좌골 신경 압착술을 간단히 수행할 수 있으며, 근육 전체 마운트를 통해 이후의 재생 과정을 분석할 수 있음을 보여줍니다.이 절차의 주요 장점은 좌골 신경을 압착하고 이후 축삭 재생 정도를 평가할 수 있는 단순하고 재현 가능한 기술을 제공한다는 것입니다. 수술 전, 술후 통증을 최소화하기 위해 케타민 100 mg/kg과 자일라진 10 mg/kg의 칵테일을 복강 내 주사하여 마우스를 마취함으로써 이 절차를 시작하십시오. 또한 마우스에게 멜록시캄 10 mg/kg을 피하 주사합니다.다음으로, 수술용 클리퍼를 사용하여 양쪽 뒷다리를 조심스럽게 털을 깎습니다. 그런 다음 완전한 제모를 위해 제모 크림을 도포합니다. 멸균 면봉과 Betadine 수술용 세정액으로 피부를 깨끗이 닦아냅니다.그 후, 멸균 면봉을 사용하여 안구에 안연고를 도포합니다. 마우스를 예열된 홈오테믹(homeo themic) 담요 위의 깨끗한 스테인리스 스틸 판 위에 놓아 동물의 체온을 37 °C로 유지합니다. 그런 다음 모든 사지를 테이프로 고정합니다.무릎 관절이 몸체와 직각을 이루도록 뒷다리를 대칭적으로 조심스럽게 배치합니다. 그 후, 현미경 하에서 수술 부위를 멸균 드레이프로 덮습니다. 정중선을 따라 반원형으로 절개합니다.피부를 하부 근육층으로부터 조심스럽게 분리하고, 수시로 피부를 접어 둡니다. 수술 부위를 촉촉하게 유지하기 위해 약 0.1 milliliters의 멸균 식염수를 도포합니다. 다음으로, 대둔근과 대퇴이두근 전두 사이의 근막면을 엽니다.수술 대조군을 위해 좌골 신경을 노출시킵니다. 반대측 좌골 신경을 노출시키고 가동화하되, 손상되지 않은 상태로 유지해야 합니다. 그런 다음 둔근을 다시 배치하고 봉합합니다.리트랙터를 사용하여 동일한 방식으로 실험용 좌골 신경을 노출시킵니다. 시각적 확인을 용이하게 하기 위해, 홍채 절제 가위를 사용하여 주변 결합 조직으로부터 좌골 신경을 조심스럽게 분리합니다.그런 다음 미세 5 45 핀셋을 사용하여 신경을 초미세 지혈鉗子(hemostatic forceps)의 하단 턱에 배치하고, 세 개의 근막이 서로 겹치지 않게 나란히 정렬합니다. 지혈鉗子의 끝에서 1.5 mm 지점에 표시가 각인되어 있습니다. 압착하기 전, 좌골신경의 가장 바깥쪽 부분이 이 표시와 일직선이 되도록 배치하십시오.이렇게 함으로써 균일한 너비로 압착이 이루어지게 하며, 압착력으로 인해 신경이 납작해졌을 때 지혈 겸자의 턱 바깥으로 신경이 밀려나지 않도록 합니다. 만약 신경이 겸자 팁 바깥으로 확장되면 신경의 일부만 압착됩니다. 미리 카본 분말에 담갔다 뺀 두 번째 지혈 겸자를 사용하여 압착 부위를 표시하십시오.동일한 압착 부위를 세 번의 클릭으로 15초 동안 압착합니다. 탄소 표식이 초기 압착 경계를 벗어나지 않아야 합니다. 압착 부위의 정밀한 표식이 필요한 경우, 포셉을 탄소에 미리 담가 수술 부위에 탄소가 넓게 퍼지는 것을 방지하는 것이 특히 중요합니다.분말 탄소 속에 포셉을 넣고 엽니다. 그런 다음 조심스럽게 닫습니다. 멸균 거즈를 사용하여 지혈鉗(hemostats) 외부에 묻은 탄소를 닦아냅니다.포셉의 분쇄 표면에 탄소 가루가 고르게 코팅되었는지 확인하기 위해 최소 3배율 이상에서 확인합니다. 필요한 경우, 다시 담갔다가 닦아내고 반대측과 동일한 방식으로 둔근을 다시 배치하고 봉합합니다. 마지막으로 9mm 리플렉스 클립을 사용하여 피부 절개 부위를 폐쇄합니다.9 mm 리플렉스 클립(reflex clips)이 움직임을 제한하는 것으로 판단되면, 더 작은 리플렉스 클립이나 6-0 자동 봉합사를 사용할 수 있습니다. 대신, 마우스를 희생시킨 후 네 가지 근육을 제거합니다. 뒷다리의 전경골근(tibialis anterior), 장지신근(extensor digitorum longus), 장비골근(peroneus longus) 및 가자미근(soleus)을 결합 조직을 통해 검은색 사드 코팅 접시에 핀으로 고정하여 조심스럽게 분리합니다.그런 다음 PBS로 헹굽니다. 이어서 4% Paraform aldehyde로 30분 동안 고정합니다. 검은색 sard 코팅 페트리 접시 위에서 각 근육을 박리하기 위해, iridectomy scissors를 사용하여 힘줄을 제거합니다.그 후, 내부 근섬유를 벗겨내어 근육을 얇게 만듭니다. 종판 밴드(endplate bands)를 포함한 근육의 외부 표면을 주의 깊게 보존하십시오. 그런 다음, 결과물을 vector shield와 22 by 40 millimeter 유리 커버슬립을 사용하여 플러스 슬라이드에 마운트하고, 양쪽 두 면을 투명 매니큐어로 밀봉합니다. 슬라이드에 적절히 마운트되었을 때, 종판 밴드가 커버슬립에 접촉되어 있어야 합니다.왼쪽 뒷다리의 생체 내(in situ) 압착 부위 예시입니다. 압착 부위는 검은색 카본으로 표시되어 있습니다. 별표는 대퇴 근육에 분포하며 유용한 지표 역할을 하는 경골 신경의 분지를 나타냅니다.분쇄 수술 중에 좌골 신경의 경골 분지는 파란색으로, 비골 분지는 녹색으로, 그리고 srel은 노란색으로 표시되어 있습니다. 이 반박절 절편은 지혈 겸자로 수행한 완전 분쇄 상태를 보여줍니다. 화살표 머리는 이곳의 분쇄된 섬유들을 가리킵니다.각도가 있는 포셉을 사용하여 불완전하게 압착한 모습이 다른 반-가늘게 자른 단면(semi fin section)에서 확인됩니다. 화살표 머리는 압착된 섬유를 다시 나타내며, 화살표는 보존된 축삭을 나타냅니다. 이들은 전체 마운트 근육에서 렌더링된 이미지들입니다.결합 조직을 제거하고 얇게 만든 후, 각 근육에서 신경종판(nplate) 밴드의 윤곽을 표시합니다. 여기에는 좌측(sous) 전체 마운트 근육이 나타나 있습니다. 좌골 신경 손상 후 14일이 경과한 상태입니다.화살표는 축삭에 의해 재지배된 신경근 접합부의 영역을 나타냅니다. 여기는 탈신경된 신경근 접합부의 시연입니다. Gap 43 양성 슈반 세포 돌기는 화살표 머리로 표시되어 있습니다.이 탈신경된 신경근 접합부에서는 축삭이 보이지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 정적인 신경을 재현 가능하게 압착하고 재생 분석을 위한 근육 호르몬 표본을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

reproducible-mouse-sciatic-nerve-crush-subsequent-assessment

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Li, Q., et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 압착 부상 후 마우스 좌골 신경의 축삭 재생 과정을 보여줍니다. 분리된 신경은 축삭 성장을 시각화하기 위해 뉴런에서 발현되는 형광 단백질과 함께 이미징을 위해 고정되고 준비됩니다. 낙산화형광 현미경을 사용하여 손상 부위에서 축삭 재생을 추적하여 재성장 정도를 평가합니다.

압착 부상 후 마우스의 좌골 신경의 축삭 재생

출처: Li, Q. et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 축삭 재생을 연구하기 위해 마우스 DRG 뉴런의 전기천공 매개 형질감염을 보여줍니다. DRG 뉴런에 핵산 구조물을 전달하고, 좌골 신경 손상을 유도하고, 축삭 재생을 평가하는 단계를 간략하게 설명합니다.

감각 축삭 재생을 촉진하기 위한 마우스 등근 신경절의 전기천공 매개 형질감염

출처: Dalkin, W., et al. 비골 신경 손상 방법: 신경근 접합부를 복구하는 요인을 식별하고 테스트하기 위한 신뢰할 수 있는 분석법입니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 신경근 접합부(NMJ) 재생을 연구하기 위해 마우스에서 비골 신경 손상을 유도하는 수술 절차를 보여줍니다. 이 절차에는 비골 신경을 노출시키고, 통제된 압력을 가하여 손상을 유도하고, 축삭 재생을 지원하기 위해 신경외막이 손상되지 않도록 하는 것이 포함됩니다. 시간이 지남에 따라 대식세포는 축삭 파편을 제거하여 신경 복구와 NMJ의 재건을 촉진합니다.

신경근 접합부 재생을 연구하기 위해 마우스에서 비골 신경 손상 유도

우리는 쥐의 근육 재신경 분포와 신경근 접합부의 재생을 신뢰성 있게 검사하기 위해 신경 손상 방법을 개발했습니다. 이 기술은 간단하고 재현성이 높은 수술을 통해 총비골 신경을 손상시키는 것입니다.  그런 다음 신근 digitorum longus muscle을 전체적으로 장착하여 평가한 근육 재신경화.

비골 신경 손상 방법 : 신뢰할 수있는 분석은 확인하고 테스트 즉, 수리 신경 근육 학 접합 요인

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

제시된 것은 쥐에서 상이한 유형의 중간 신경(MN) 병변 및 수리를 생성하는 프로토콜이다. 추가적으로, 프로토콜은 몇몇 비침범성 행동 시험 및 생리적인 측정을 사용하여 신경의 기능적 회복을 평가하는 방법을 보여줍니다.

쥐에서 중간 신경 재생을 평가하는 기능적 및 생리적 방법

자동 걸음걸이 분석은 말초 신경 손상 및 척수 타박상 손상의 설치류 모델에서 기능적 회복을 평가하는 실행 가능한 도구입니다. 다양한 실험 모델에서 운동 기능을 평가하기 위해 단 하나의 설정만 필요하지만, 동물의 세심한 하드 및 소프트 웨어 조정 및 훈련이 매우 중요합니다.

주변 신경 또는 척수 타박상 부상으로 설치류의 기능적 회복을 평가하기 위한 자동 걸음걸이 분석

모터 회복의 평가는 실험적인 말초 신경 연구에서 벤치마크 결과 측정으로 남아 있습니다. 쥐의 티볼리스 전방 근육의 동면 파탄력 측정은 경련성 신경 결함의 재구성 후 기능적 결과를 평가하는 귀중한 도구입니다. 방법과 뉘앙스는이 문서에 자세히 설명되어 있습니다.

쥐의 티비아리스 전방 근육의 최대 동면 성 파타닉 힘 측정

우리는 상주 신경 호감 부상 후 쥐의 행동 테스트 배터리를 통해 모터 행동의 평가를위한 프로토콜을 제공합니다.

일방적인 상시 신경 호감 부상 후 쥐에서 모터 행동의 다인 평가

우리는 myelin를 공개하고 나머지 축삭 - 풍부한 자료의 추출 다음 비 axonal 구조를 lyse에 hypotonic 매체 신경 fascicles과 부화 해부에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 절연을위한 프로토콜을 보여줍니다.

쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

학습하세요 마우스 좌골 신경 크러시와 근육 전체 마운트 분석 방법을 통해 재생성을 평가하는 기술을. 이 재현 가능한 프로토콜은 신경 손상 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

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