전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가
2012년 2월 22일
이 보고서에서는 마우스 좌골 신경을 파멸시키는 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽게 사용할 수 hemostatic 집게를 사용하여 쉽고 reproducibly 전체 좌골 신경 호감을 생산하고 있습니다. 또한 좌골 신경 호감 후 신경 재생의 분석에 적합한 근육 전체가 마운트를 준비하는 방법을 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 좌골 신경 파쇄의 간단하고 재현 가능한 방법과 좌골 신경 파쇄 후 근육 재신경 분포에 대한 전체 마운트 분석을 입증하는 것입니다. 이것은 먼저 좌골 신경을 노출시킴으로써 이루어지며, 신경에 대한 좋은 접근을 보장하기 위해 외과적 견인기의 적절한 배치를 포함합니다. 다음으로, 지혈 겸자로 신경을 부수고 숯으로 신경을 표시하십시오.
그런 다음 뒷다리에서 좌골 신경에 의해 신경이 분포된 개별 근육을 제거합니다. 마지막 단계는 면역 염색 후 전체 마운트 분석을 위해 개별 근육을 절개하는 것입니다. 궁극적으로, 결과는 재현 가능한 좌골 신경 파쇄를 간단하게 수행할 수 있으며 근육 구멍 마운트를 사용하여 후속 재생을 분석할 수 있음을 보여줍니다.
이 절차의 주요 장점은 좌골 신경을 분쇄하고 이후에 축삭 재생을 점수화할 수 있는 간단하고 재현 가능한 기술을 제공한다는 것입니다. 수술 후 통증을 최소화하기 위해 복강내 주사를 통해 케타민 1kg당 100mg과 자일라진 1kg당 10mg의 칵테일을 사용하여 수술을 위해 마우스를 마취하여 이 절차를 시작합니다. 마우스는 또한 멜록시캄 1kg당 10mg의 피하 주사를 받습니다.
다음으로, 수술용 이발기를 사용하여 양쪽 뒷다리를 조심스럽게 면도합니다. 그런 다음 완전한 고갈을 위해 모발 제거 크림을 바르십시오. 멸균 면 팁 어플리케이터와 Betadine 수술용 스크럽으로 피부를 청소하십시오.
그 후, 멸균 솜 팁 어플리케이터로 눈에 안과 연고를 바르십시오. 예열된 호메오 테마 담요 위에 깨끗한 스테인리스 강판에 마우스를 놓고 동물의 온도를 섭씨 37도로 유지합니다. 그런 다음 모든 팔다리를 테이프로 붙입니다.
무릎 관절이 몸과 직각을 이루도록 뒷다리를 대칭으로 조심스럽게 배치합니다. 그런 다음 현미경 아래에서 멸균 드레이프로 수술 부위를 덮습니다. 정중선을 가로질러 반원형으로 절개합니다.
밑에 있는 근육 조직에서 피부를 부드럽게 분리하고 때때로 접습니다. 시술 중 수술 부위를 촉촉하게 유지하기 위해 약 0.1ml의 멸균 식염수를 바르십시오. 다음으로, 대둔근과 대퇴이두근의 앞쪽 머리 사이의 근막면을 엽니다.
외과적 통제를 위해 좌골 신경을 드러냅니다. 반대쪽 좌골 신경은 노출되고 동원되어야 하지만 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다. 그런 다음 둔근 조직을 쉬게 하고 봉합합니다.
견인기와 같은 방식으로 실험용 좌골 신경을 노출시킵니다. 시각화를 용이하게 합니다. 홍채 절제술 가위를 사용하여 주변 결합 조직에서 좌골 신경을 부드럽게 제거합니다.
그런 다음 미세한 5 45 겸자를 사용하여 신경을 초미세 지혈 겸자의 아래쪽 턱에 놓고 3 개의 근막을 서로 겹치지 않고 인접하게 정렬합니다. 지혈 겸자는 끝에서 1.5mm 떨어진 곳에 표시가 새겨져 있습니다. 분쇄하기 전에 좌골 신경통의 가장 바깥쪽 부분을 이 표시와 일치하게 놓습니다.
이것은 균일한 폭의 파쇄를 보장하고 파쇄력으로 인해 평평해질 때 신경이 지혈 겸자의 턱 너머로 확장되지 않도록 합니다. 신경이 겸자 끝을 넘어 확장되면 신경은 부분적으로만 부서집니다. 미리 담근 두 번째 지혈 겸자를 사용하고 탄소를 분말로 만들어 분쇄 부위를 표시합니다.
세 번의 클릭으로 15초 동안 같은 분쇄 부위의 신경을 분쇄합니다. 어떤 탄소 표시도 초기 파쇄의 경계를 넘어서는 안 됩니다. 이는 집게를 탄소에 미리 담그고 수술 부위에 널리 퍼진 탄소를 방지하기 위해 크러쉬 부위를 정확하게 표시해야 하는 경우 특히 중요합니다.
탄소 분말로 집게를 엽니다. 그런 다음 부드럽게 닫으십시오. 멸균 거즈를 사용하여 지혈기 외부의 탄소를 닦아냅니다.
최소 3배 배율로 집게를 확인하여 분쇄 표면이 분말 탄소로 균일하게 코팅되어 있는지 확인하십시오. 필요한 경우, 반대쪽과 같은 방식으로 둔근 조직을 다시 담그고 닦고 휴식을 취하고 봉합합니다. 마지막으로 9mm 반사 클립을 사용하여 절개 부위를 닫습니다.
움직임을 제한하는 9개의 밀리미터 반사 클립이 발견되면 더 작은 반사 클립 또는 6개의 자동 봉합사를 사용할 수 있습니다. 대신 마우스를 희생한 후 4개의 근육을 제거하십시오. 뒷다리의 경골 전방 신근 digitorum longus, peroneus longus 및 soleus는 결합 조직을 통해 검은 사드로 코팅 된 접시에 조심스럽게 고정합니다.
그런 다음 PBS로 헹굽니다. 그런 다음 4% 파라폼 알데히드에 30분 동안 고정합니다. 검은 사드로 코팅된 페트리 접시의 각 근육을 절개하려면 홍채 절제술 가위를 사용하여 힘줄을 제거합니다.
그 후, 내부 근육 섬유를 벗겨내어 근육을 얇게 합니다 종판 밴드를 포함한 근육의 외부 표면을 조심스럽게 보존합니다. 그런 다음 생성된 근육을 벡터 쉴드와 22 x 40mm 유리 커버 슬립으로 투명 매니큐어로 양면을 밀봉하는 플러스 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드에 제대로 장착되면 nplate 밴드가 커버 슬립과 접촉해야 합니다.
다음은 왼쪽 뒷다리의 제자리에서 파쇄 부위의 예입니다. 크러쉬 부위는 블랙 카본으로 표시됩니다. 별표는 허벅지 근육 조직에 신경을 공급하고 유용한 랜드마크 역할을 하는 경골 신경의 한 가지를 표시합니다.
크러시 수술 중 좌골 신경의 경골 분열은 파란색, 비골 및 녹색, 비골 및 노란색으로 윤곽이 그려집니다. 이 반박형 부분은 지혈 겸자로 수행되는 완전한 분쇄를 보여줍니다. 화살촉은 여기에서 부서진 섬유를 나타냅니다.
각진 집게로 수행된 불완전한 분쇄는 다른 반 지느러미 섹션에 표시됩니다. 화살촉은 다시 부서진 섬유를 나타내고 화살표는 보존된 축삭을 나타냅니다. 이것들은 전체 마운트 근육에서 렌더링 된 이미지입니다.
결합 조직을 제거하고 얇아진 후, 각 근육에 nplate 밴드의 윤곽이 그려집니다. 여기에 표시된 것은 수스 전체 마운트 근육입니다. 좌골 신경 파쇄 후 14일.
화살표는 축삭돌기에 의해 다시 신경이 분포된 신경근 접합부 영역을 나타냅니다. 다음은 탈신경성 신경근 접합부의 시연입니다. 갭 43 positive schwan cell process는 화살촉으로 표시됩니다.
이 탈신경화된 신경근 접합부에서 축삭돌기가 보이지 않습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 정적 신경을 재현 가능하게 분쇄하고 재생 분석을 위해 근육 호르몬 마운트를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 보고서는 마우스 좌골 신경을 압박하고 근육 재신경화를 분석하는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 기술은 완전한 신경 압박을 달성하기 위해 쉽게 구할 수 있는 지혈 클램프를 사용하며, 재생 분석을 위한 근육 전체 마운트 준비를 포함합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 재생 의학
- 근육 생리학
배경
- 좌골 신경 손상은 중요한 운동 결손으로 이어질 수 있습니다.
- 신경 재생을 이해하는 것은 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다.
- 전체 마운트 분석은 근육 재신경화에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 기존 방법은 재현 가능성과 접근성이 부족할 수 있습니다.
연구 목적
- 좌골 신경 압박에 대한 재현 가능한 방법을 보여주기 위해.
- 신경 재생의 후속 분석을 위한 근육 전체 마운트를 준비하기 위해.
- 연구자들이 쉽게 채택할 수 있는 간단한 프로토콜을 제공하기 위해.
사용된 방법
- 수술용 리트랙터를 사용하여 좌골 신경을 노출합니다.
- 지혈 클램프로 신경을 압박하고 연탄으로 표시합니다.
- 좌골 신경으로 신경을 받는 뒷다리의 개별 근육을 제거합니다.
- 면역 염색 후 전체 마운트 분석을 위해 근육을 해부합니다.
주요 결과
- 이 방법은 일관되고 완전한 좌골 신경 압박을 가능하게 합니다.
- 근육 전체 마운트는 재생을 위해 효과적으로 분석할 수 있습니다.
- 결과는 신경 수리 연구를 위한 이 접근 방식의 타당성을 입증합니다.
- 발견 사항은 근육 재신경화 과정의 이해에 기여합니다.
결론
- 이 방법은 신경 손상을 연구하는 연구자들에게 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.
- 전체 마운트 분석은 근육 재신경화를 평가하는 귀중한 기술입니다.
- 프로토콜은 다양한 연구 환경에서 쉽게 구현할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method provides a reproducible model for studying peripheral nerve regeneration, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical neuroscience programs. By standardizing sciatic nerve crush and quantifying reinnervation via whole mount muscle analysis, it supports target validation and assay development for neuroprotective or neuroregenerative candidates. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking axonal growth to functional reinnervation readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses on axonal regeneration and Schwann cell interactions in a genetically tractable model.
- Operational Value: Uses widely available transgenic mouse lines to dissect molecular mechanisms of nerve repair with high reproducibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-ready outputs (e.g., neuromuscular junction reinnervation) for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Standardizes crush site marking and muscle preparation to ensure assay consistency across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by modeling axonotmesis, a clinically relevant peripheral nerve injury.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through longitudinal, structure-function correlation of regeneration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing a disease-relevant system for evaluating biologics or small molecules aimed at enhancing nerve repair.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by enabling precise measurement of axonal regeneration kinetics.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable dependent variables (e.g., reinnervated endplate bands) for compound effect assessment.
- Analytics: Generates statistical outputs from whole mount imaging that allow comparison of regeneration efficacy across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using a rodent model predictive of human peripheral nerve lesion responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for repeated use in target de-risking and lead optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of axonal-Schwann cell-basal lamina interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized crush force, site marking, and muscle whole mount protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, histology-based regeneration metrics early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroregenerative candidates based on functional reinnervation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, tissue dissection, and immunofluorescence staining.
- Depends on access to stereomicroscopes, hemostatic forceps, and imaging systems for whole mount analysis.
- Necessitates cross-team standardization of crush duration, marking technique, and muscle fixation timing.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the need for terminal procedures and skilled handling to maintain crush consistency and marking fidelity.
