Name: 다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 인간 배아 줄기세포를 알긴산 마이크로캡슐에 캡슐화하여 3D 환경에서 도파민성 신경세포로 분화시키는 최적화된 기법입니다. 이 방법은 세포 간 상호작용을 강화하고 이식 시 면역 격리를 가능하게 합니다.

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이 작품은 의학 NHMRC 프로그램 권한 부여 # 568969 (PSS) 및 학부, 뉴 사우스 웨일스 대학, 줄기 세포 사업 (KSS)에 의해 지원됩니다.

아래 절차의 모든 클래스 II Biosafety 내각 안에서 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 사용하는 시약과 장비는 아래 테이블에 나열되어 있습니다. 1. 1.1 %의 알긴산의 준비 (W / V) <ol><li> 나트륨 알지네이트요 투석의 0.275 g을 추가 (높은 글루쿠론산 함량 ≥ 60 %, 점도&gt; 200 MPA의 및 내독소 ≤ 100 유럽 연합 (EU) / G) 무균 50 ML 관과 (0.5g 이전 대비 25 ML 멸균 0.1 % 젤라틴 용액을 추가 gelatin/500 ML 밀리 Q H 2 O 및 autoclaving에 의해 해산). </li><li> 부분적으로 알지네이트요 가루를 해산하기 위해 약 30 초간 소용돌이 튜브 그러면 하룻밤 사이에 10 XG에 궤도 믹서에 튜브를 삽입 (실온). </li><li> 알지네이트요 솔루션의 25 ML에 9% 멸균 NaCl (NaCl/50 ML 밀리 Q H 2 O 4.5 g)의 2.778 ML을 추가합니다. 5 분 95 XG의 원심 분리에 의해 다음에 약 30 초간 소용돌이 튜브를. </li><li> 4에서 알지네이트요 솔루션을 저장 °; 단기 저장 (1-2개월) 또는 -20 ° C에서 장기 보관 (년 정도)에 대한 C #. </li></ol> 2. CaCl 2 강수 목욕의 작성 <ol><li> 밀리 Q H 2 O로 1 리터에 CaCl 2 14.7 g. 2 시간 2 O와 HEPES의 2.38 g을 용해 </li><li> 7.4로 산도 수준을 조정합니다. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 솔루션을 소독. </li><li> 강수량 목욕은 실온 (6-12 개월)에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 솔루션 Decapsulating의 작성 <ol><li> Dulbecco의 인산 500 ML에 염분 (D-PBS)를 버퍼, 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 50 ML 및 1M HEPES 5 ML에 추가합니다. </li><li> 20 분 동안 121에서 0.22 μm의 필터 또는 압력솥 ° C를 사용하여 소독. </li><li> 실온 (6-12 개월)에 decapsulating 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 4. 세럼 교체 (SR) 중간의 작성 <ol><li> 이전 캡슐에, 드로 사전에 SR 매체를 준비특정 시약 및 장비의 테이블에 scribed. </li></ol> 5. 바위 억제제의 준비 (Y-27632) <ol><li> 인간 D-PBS의 (HSA) 알부민 혈청 5 MM 솔루션을 만드는 0.1 %에서 Y-27632 분말을 희석. </li></ol> 6. 봉지를위한 hESC의 작성 <ol><li> 37 ° C (빛으로부터 보호)에서 두 시간 동안 바위 억제제 (RI)의 10 μm의로 보충 culturing 미디어와 세포를 사전 처리합니다. </li><li> RI 치료 후 37 ° C. 10 분 accutase와 효소 회 D-PBS로 세포를 씻어 문화 판에서 세포를 이동시키다 </li><li> 부드럽게 피펫 또는 셀 스크레이퍼로 세포를 데리고 15 ML 튜브에 수집합니다. 1시 1분 비율로 SR 매체와 accutase를 무력화. </li><li> 단일 세포 현탁액을 준비하려면 40 μm의 필터를 사용하여 무력화 세포를 필터링하고 신선한 50 ML의 원심 튜브에 수집합니다. </li><li> hemacytometer를 사용하여 솔루션의 세포의 총 수를 계산합니다. </리&gt; <li> 세포 현탁액에게 5 분 95 XG을 원심 조심스럽게 나중에 뜨는 버리고. 사전 예열 0.9 % NaCl로 세포를 씻으십시오. 5 분 95 XG를 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li></ol> 7. 세포의 캡슐화 <ol><li> 14G X 2 &quot;IV 카테터의 부드러운 플라스틱 튜브에 부착된 1 ML의 주사기를 준비합니다. 이것은 그림 1에서와 같이 주사기 펌프에로드되도록 세포 현탁액을 대기음하는 데 사용됩니다. </li><li> 1,250,000 세포 / ML의 알지네이트요의 밀도에 미리 예열 알지네이트요 솔루션 세포 Resuspend. 천천히 주사기에 혼합하고 거품을 생성하지 마십시오. </li><li> 그림 1에서와 같이 비드 발생기, 주사기 펌프 및 공기 유량계를 설정합니다. 이러한 장치의 자세한 내용은 특정 시약 및 장비의 테이블에 나열되어 있습니다. </li><li> 주사기로 aspirated 세포로 정맥 주사 카테터의 플라스틱 튜브를 버리고 캡슐 머신에 주사기를 첨부합니다. 10cm 간격이있다는 것을 확인<html> 십대 초반은 캡슐 머신의 끝과 수거 지점 그림 1과 같이. </li><li> 20 ML / HR, 공기 흐름 8 L / 분의 속도 및 100 kPa (캡슐의 크기는 공기 유량을 변경하여 변경할 수있다)의 압력에서 주사기 펌프를 설정하여 세포를 캡슐. </li><li> 캡슐을 안정화하기위한 7 분을위한 사전 예열 강수량 목욕 20 ML 가득 배양 접시 (100 X 15mm)로 캡슐화된 세포를 수집합니다. </li><li> 0.9 % NaCl의 20 ML 가득한 50 ML의 원심 튜브에 부드러운 흡인에 의해 캡슐화된 세포를 전송합니다. </li><li> 캡슐은 튜브의 바닥에 정착하도록 허용하는 것은 부드럽게 뜨는 버리고. 0.9 % NaCl로 세척 과정을 반복합니다. </li><li> 문화 플라스크에 RI (10 μm의), 이체로 보완하고 37 ° C / 5% CO 2에서 incubated 사전 예열 culturing 매체에 캡슐화된 세포를 Resuspend. </li></ol> 8. DA 뉴런에 캡슐화된 hESC의 분화 ve_content &quot;&gt; 캡슐 hESC는 분화 이전 3 일간 RI으로 처리됩니다. <ol><li> 종자 마우스 stromal 세포주의 1.0 × 10 4cm 2 회 0.1 %의 젤라틴 코팅 T75 술병과 조건 24 시간 분화하기 전에 검찰 신경 분화 매체 (자료 표)에 PA6 세포. 밀도에서 PA6 세포 </li><li> 50 ML의 원심 튜브에 캡슐을 전송하고 그들이 튜브의 바닥에 정착하실 수 있습니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 PA6 세포 바른 DA 신경 분화 매체에 캡슐을 resuspend. </li><li> 문화 일 4 미디어 변화와 매일 함께 28일 대한 PA6 세포 단일층 (7.5 × 10 5 PA6 세포 당 9 X 10 6 hESCs)와 캡슐 hESC는 그 이후 (매체마다의 절반 밖에 변경). </li><li> PA6 세포와 문화 3 주가 지난 후, 100 NG / ML 쉬이잇 나머지 주 100 NG / ML FGF8a 함께 검찰 신경 분화 미디어를 보완. </리&gt; </ol> 9. 캡슐화된 hESC의 Decapsulation <ol><li> 15 ML의 원심 튜브에 캡슐을 대기음들을 튜브 하단에 정착하실 수 있습니다. 그렇다면 신중하게 뜨는 버리고. </li><li> 두번 D-PBS로 캡슐 씻으십시오. 다음 뜨는을 제거 캡슐은 튜브의 아래쪽에 정착하자. </li><li> 캡슐 5 ML decapsulating 솔루션을 추가합니다. 4-5 분 상온에서 사전에 인큐베이션에 대한 열망을 통해 철저하게 정지를 섞습니다. </li><li> 3 분 95 XG에 decapsulated 세포를 원심 분리기와 뜨는 버리고. </li><li> 3 분 95 XG에서 원심 분리에 의해 다음에 D-PBS로 세포 펠렛 씻으십시오. 반복합니다. </li><li> decapsulated 세포가 더 단일층으로서 교양이나 스트림 분석에 사용 될 수 있습니다. </li></ol> 10. 대표 결과 알지네이트요의 microcapsules의 직경 400-500 μm의입니다. 캡슐 내에서 세포의 수가 estimat였다실행 당 캡슐 총 나눈 세포의 총 수를 계산하여 에드. 따라서 캡슐 당 약 5.0 X 10 4 세포 추정되었다. 이것에서 우리는 캡슐에 포함할 수있는 세포의 최대 개수는 약 1.0 × 10 5 것을주지. 캡슐 hESC의 생존 능력은 carboxyfluorescein의 디아 세 테이트 succinimidly 에스테르 (CFDA) / propidium의 요오드화물 (PI) 분석을 사용하여 결정&gt; 80 % (그림 2)과 같다. 우리는 1.1 %까지 2.2 %에서 알지네이트요 농도를 줄임으로써 및 바륨 염화에서 염화칼슘으로 강수량 목욕을 변경하여 hESC의 캡슐의 조건을 최적화했습니다. 이러한 조건에서 우리는 1.1 %의 칼슘 알지네이트요로 캡슐되었습니다에만 세포가 살아남을 수 있다고 보여주었다, 분아 따위에 의해 중식 및 체외 1 EBS를 형성하고 있습니다. 추가 조건을 최적화하려면 culturing 미디어 및 RI의 효과는 Y-27632는 조사되었다. 그림 2와 3에 표시된대로 데이터는 RI의 prevente을 증명D 분리 - 유도 apoptosis와 세포 생존 및 홍보 클러스터 형성 1,6을 유지. 또한, hFF-CM + RI에서 배양해 캡슐 hESC의 생존 능력은 RI의 보완없이 다른 그룹보다 훨씬 높은이었다 있으나 이것은 SR + RI에서 배양해 캡슐 hESC에 크게 다르지 않아했습니다. 마찬가지로, BrdU 분석을 사용하여 세포 증식은 클러스터 (그림 3)로 발전 단일 셀은 25 %에서 75 % 증가했다. TUNEL에 의한 Apoptosis 분석은 hFF-CM에서 검색할 클러스터 TUNEL에 대해 대부분 부정했다 반면 SR 매체에서 배양해 microcapsules에서 단일 세포 (데이터가 표시되지 않음) apoptotic라고 밝혔다. 어느 정도, bFGF와 보충 hFF-CM은 또한 Y-27632의 부재에서 생존과 캡슐 hESCs의 확산을 촉진. 그러나 Y-27632과 치료를 캡슐화하기 전에 (2 시간)과 이후 (추가 4 일간) 띄게 향상된 생존, 증식 및 캡슐의 hESC의 클러스터 형성1.1 %의 칼슘 알지네이트요의 microcapsules 인치 이전에 우리는 캡슐 hESC이 성공적으로 확정 endoderm 1로 차별 수있다 보여주었다. 여기서는 검찰 뉴런으로 캡슐 hESC를 차별화하기 위해 3D 플랫폼으로 세포 캡슐의 응용 프로그램을 조사했다. 캡슐에 embryoid 기관 (EB)를 형성 hESC는 차별화된 직접 있었는데 설명한 조건 하에서 decapsulation에 90 % 이상의 생존 능력과 문화로부터 2-3 일 후에 (그림 4) 프로 그레시브의 연결 형태를 보여주었다. neuroprogenitor 표시, PAX6과 검사의 연결 마커, TH는 차별화 7 일 (그림 5A) 이후 최대 - 규제 동안 유전자 발현 분석 pluripotent 표식의 아래쪽 규정, OCT4을 보여주었다. Immunofluorescent 염색법은 차별 hESC 하루 7 시에 PAX6 양성 (&gt; 80 %)하지만 OCT4 음수가 있다고 밝혔다. 또한 차별화된 hESC 21 일 후에 TH - 양성 (&gt; 90 %) 뉴런을 (그림 5B) 보여주었다. 서양 얼룩 분석도 보여주었다PAX6 표현 동안 일 14 일부터 번째 표현의 상향 조절 (그림 5C)는 21 일 이후에 아래쪽 규제. 비교에서는 전지 (사전 차별화에 대한 예 : RI 3 일간 2 시간 RI 사후 처리를위한 사전 치료) (&gt; 80 PAX6-긍정 세포의 높은 비율을 유지 유사한 조건 하에서 (2D) 2 차원 환경에서 배양해 %) 분화 기간에 걸쳐 및 캡슐화 (그림 5A 및 C)에서 제공하는 3D 환경에서와 같이 TH 양성 세포 (&lt;60 %)으로 차별화에서와 같이 효율이 아니었다.

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

마우스 배아의 줄기 세포와 hESC를 사용하여 여러 연구 biomaterials 및 조직 공학 2,3에서 3D 문화 시스템의 이점을 증명하고있다. 우리는 바륨 알지네이트요보다 칼슘 알지네이트요에서 캡슐 때 hESC는 상당한 높은 생존 능력을 보여주 이후 바륨 알지네이트요에 비해 hESC 전파와 차별을 공부하기 적합한 3D 플랫폼으로 칼슘 알지네이트요의 microcapsules를 사용했습니다. 이 문화 시스템은 또한 고밀도 세포 배양과 영양분과 멤브레인 7 전체 산소의 교환이 가능합니다. 캡슐 내에서 자연 차별화는 이전에 관찰되었고 그것이 같은 undifferentiated hESC은 캡슐 내에 분아 따위에 의해 번식이 계속된다고 가정되며, 세포가 캡슐 및 양식 teratoma 1 결국 브레이크 아웃한다면. 캡슐의 또 다른 임상 응용 프로그램은 호스트 수신자로부터 이식된 세포의 면역 보호 기능을 제공하는 것입니다. 그것은 예상되는 hESC와 일의 이식MHC 클래스의 표현...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 노트 </td></tr><tr><td> 알긴산 (MVG UP Pronova) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4,200,101 </td><td> 높은 글루쿠론산 함량 ≥ 60 %, 점도&gt; 200 MPA의 및 내독소 &lt;100 EU / G </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0.9 % NaCl </td><td> 박스터 헬스케어 </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> 타입 J1 비드 발생기 </td><td> Nisco 엔지니어링 INC </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> 멀티 페이저 주사기 펌프 </td><td> 새로운 시대 펌프 시스템 INC </td><td> 모델 NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-흐름 의료 유량계 </td><td> 개스콘 시스템</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> 머크 </td><td> 688,000 </td><td></td></tr><tr><td> 알부민 혈청 인간 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G X 2 &quot;IV 카테터 </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> 마네 - DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> SR 매체 (기저)의 경우 </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> SR 매체 (2 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> 마네 세럼 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> SR 매체 (20 %)에 대한 </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> SR 매체 (2.5 U / ml) 쇼핑을 위해 </td&gt; </tr><tr><td> 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> SR 매체 (1X)의 경우 </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> SR 매체 (0.1 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> SR 매체 (5 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> 글래스고 최소 필수 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> DA 신경 분화 매체 (기저)의 경우 </td></tr><tr><td> 마네 세럼 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> DA 신경 분화 매체 (10 %)에 대한 </td></tr><tr><td> 나트륨 pyruvate </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> DA 신경 분화 매체 (1 ㎜)의 경우 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> DA N의 경우eural 차별 매체 (0.1 ㎜) </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> DA 신경 분화 매체 (0.1 ㎜)에 대한 </td></tr><tr><td> 소닉 고슴도치 (쉬이잇) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> DA 신경 분화 (100 NG / ML)의 경우 </td></tr><tr><td> Fibroblast 성장 인자 8A (FGF8a) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 4745-F8-050 </td><td> DA 신경 분화 (100 NG / ML)의 경우 </td></tr></tbody></table>

다른 lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hesc)의 전파 및 차별 화를위한 3d 플랫폼으로서 알긴산의 microcapsule

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

그들이 무기한 문화 확대와 신체의 모든 세포 유형으로 구분되기 수 있기 때문에 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 세포 대체 요법에 대한 매력적인 대안 원본으로 떠오르고있다. biomaterials 다양한 형태의도 줄기 세포 틈새는 1-3 흉내낸 microenvironment를 제공하기 위해 줄기 세포 배양에 사용되었습니다. 후자는 캡슐과 같은 3 차원 (3D) 환경 4 제공하여 특정 lineages뿐만 아니라 조직의 조직으로 휴대 전화 상호 작용, 세포 증식 및 분화를 촉진하는 것이 중요합니다. 세포 캡슐의 원리는 3D 문화 2 반 투과 세포막의 굴레 안에서 살아있는 세포의 함정 수사가 포함됩니다. 항체와 캡슐 기공 크기보다 큰 호스트에서 면역 세포가 5를 제외하고 반면 이러한 세포막은 영양소, 산소와 세포막에 걸쳐 자극의 교환하실 수 있습니다. 여기서는 사전문화적인 접근을 유도하고 알지네이트요의 microcapsules을 사용하여 3D microenvironment에 hESC 검찰의 뉴런을 차별화. 우리는 캡슐 hESC의 생존을 향상시키기 위해 문화 조건 2를 수정했습니다. 우리는 이전에 보여준 그 크게 향상 3D 플랫폼 p160-Rho-연결된 코일 - 코일 키나제 (바위) 억제제, Y-27632과 인간 태아의 fibroblast 바른 혈청 대체 매체 (hFF-CM)의 추가 캡슐 hESC의 생존 있는 세포가 최종 endoderm의 마커 유전자에게 1 표명했다. 우리는 지금 검찰의 뉴런으로 hESC하고 효율적인 분화의 번식이 3D 플랫폼을 사용 해왔다. 단백질과 유전자 표현 분석은 검찰의 연결을 분화의 마지막 단계 후 티로신 hydroxylase의 증가 표현 (TH), DA 뉴런을위한 마커, 2 주 후에&gt; 100 폴드을 보여주었다. 우리는 알지네이트요의 microcapsules을 사용하여 Google 3D 플랫폼 확산을 공부 유용할 수있는 가상과 차별 감독각종 lineages에 hESC니다. 이 3D 시스템은 분화의 과정 중에 hESC에서 피더 세포의 분리를 허용하며 향후 이식시 면역 - 절연을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

인체 배아줄기세포(hESC)는 배양을 통해 확장 가능하므로 세포 대체 요법을 위한 매력적인 대안적 자원으로 부상하고 있습니다...

이 프로토콜은 다능성 인간 배아 줄기세포를 3D 시스템 내에서 캡슐화하여 도파민성 신경세포로 분화시키기 위해 최적화되었습니다. 먼저, 콜로니를 ROCK 억제제(RI)로 처리하고, 이를 알긴산나트륨과 혼합하여 단일 세포로 분리한 후 캡슐화 장치에 통과시킵니다. RI 처리를 3일 동안 지속한 다음, 캡슐화된 세포를 PA 6 세포로 옮겨 28일 동안 분화시킵니다.최종적으로, 유전자 및 단백질 발현 분석 결과 도파민성 뉴런 생성 효율이 더 높게 나타났습니다. 기존의 2D 분화 프로토콜과 비교하여 이 특정 기술의 주요 장점은 세포를 3D 환경에서 증식 및 분화시킨다는 점이며, 이러한 3D 환경은 세포가 고밀도로 증식할 수 있는 기회를 제공합니다. 또한, 이는 분화를 위한 더 나은 세포 간 상호작용을 가능하게 합니다.셋째로, 향후 분화 효율을 더 높일 수 있습니다. 또한, 이 특정 기술은 3D 환경에서 증식시킬 수 있는 다른 유형의 세포에도 적용 가능하다는 점을 덧붙이고 싶습니다. 아울러, 이 기술은 세포 사멸을 방지하고 세포가 배양 접시에서 떨어지는 것을 막아주는 특정 ROCK 억제제를 사용하여 최적화되었다는 점을 기억하시기 바랍니다.일반적으로 이 방법이 생소한 연구자들은 이 기술이 조직 배양에서 흔히 수행되지 않기 때문에 초기에 어려움을 겪을 수 있습니다. 다음의 캡슐화 기술은 R 억제제 유형의 alginate 적용, alginate 농도 및 캡슐화 장치 설정에 관한 Dean 박사와 Chad 박사의 요약 연구를 바탕으로 최적화되었습니다. 이제 저희 연구실의 박사 과정 학생인 Jamie와 Kim이 이 프로토콜을 시연하겠습니다.멸균된 0.1% 젤라틴 용액 25 milliliters를 정제된 알긴산 나트륨 275 milligrams가 들어 있는 멸균된 50 milliliter 튜브에 넣고, 볼텍스(vortex)하여 알긴산 분말을 부분적으로 용해시킵니다. 그다음 튜브를 오비탈 믹서(orbital mixer)에 놓고 10 times G에서 하룻밤 동안 반응시킵니다. 이어서 알긴산 용액에 9% 멸균 염화나트륨을 첨가합니다.30초 동안 볼텍싱한 후 95 ×g에서 5분간 원심분리합니다. 알긴산 용액을 4 °C에서 보관하십시오. 먼저 암실 환경에서, 10 µM의 ROCK 억제제가 첨가된 배양 배지로 인간 배아 줄기 세포를 전처리합니다.37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 세포를 효소적으로 분리하기 위해 DPBS로 두 번 세척합니다. accutane을 첨가하고 10분 동안 배양합니다.37 °C에서 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 조심스럽게 수확한 후 15 mL 튜브로 옮깁니다. SL 배지를 Accutane과 동일한 부피로 넣어 Accutane을 중화시킵니다. 그런 다음 중화된 세포를 40 µm 필터에 통과시켜 새로운 50 mL 원심분리 튜브에 담습니다.이제 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 원심분리를 통해 세포를 침전시킨 후, 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 미리 데워둔 완충액으로 세포를 한 번 세척합니다.0.9% 염화나트륨. 원심분리하여 상층액을 제거하십시오. 인간 배아줄기세포를 캡슐화하려면, 우선 예열된 알긴산 용액으로 세포를 재부유시키십시오.이를 위해, 20 milliliter 주사기를 부드러운 플라스틱 튜브에 연결하고 알긴산염을 주사기로 흡입합니다. 그런 다음 기포가 생기지 않도록 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 이제 세포를 주사기로 흡입합니다.플라스틱 튜브를 폐기한 후 캡슐화 기기에 시린지를 장착하십시오. 비드 생성기, 시린지 펌프, 공기 흐름 측정기 및 염화칼슘 침전조의 기기 설정을 진행하십시오. 캡슐화 기기의 끝단과 페트리 접시 수집 지점 사이에 10 centimeter 간격이 있는지 확인하십시오.다음으로, 시린지 펌프를 10 milliliters per hour로 설정하십시오. 공기 유량은 eight liters per minute, 압력은 100 kilo pascals로 설정합니다. 캡슐화된 세포를 미리 데워둔 침전조에 7분 동안 수집하십시오.그 다음, 완만하게 흡입하여 20 mL의 0.9% Sodium chloride가 들어 있는 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 캡슐이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고 0.9% Sodium chloride로 한 번 세척합니다. 이어서 락-억제제(rock inhibitor)가 첨가되어 미리 데워둔 배양액에 캡슐화된 세포를 재현탁합니다. 배양 플라스크로 옮겨 3일 동안 배양합니다.마우스 기질 세포주 PA six 세포를 0.1% 젤라틴으로 코팅된 T 75 플라스크에 접종하고, 도파민성 신경 분화 배지로 24시간 동안 배양하여 조건화합니다. 캡슐을 50 mL 원심분리 튜브로 옮기고 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 둡니다. 상층액을 제거하고 PA six 세포 조건화 도파민성 신경 분화 배지에 캡슐을 재현탁합니다.배지 배양. 캡슐화된 인간 배아 줄기세포를 PA 6 세포 단층과 함께 21일 동안 배양합니다. 배지를 보충할 때 배지를 교체하십시오.도파민성 신경 분화 과정에서 PA 6 세포를 계속 배양하기 위해 매번 배지의 절반만 교체합니다. 유도 인자가 첨가된 배지를 일주일 동안 처리합니다. 먼저 캡슐을 흡입하여 15 mL 원심 분리 튜브로 옮깁니다.캡슐이 바닥에 가라앉으면 상층액을 버립니다. DPBS로 두 번 세척하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 5 mL의 적혈구 제거 용액(decapululating solution)을 넣고 현탁액을 충분히 혼합합니다.실온에서 5분 동안 배양합니다. 펠렛을 원심 분리한 후, decap 세포를 회수하고 DPBS로 2회 세척한 다음, 해당 decap 세포를 단층 배양에 사용하거나 즉시 하위 분석을 진행합니다. 전형적인 준비 과정에서 알지네이트 마이크로캡슐의 직경은 400에서 500 microns 사이입니다.여기서는 C-F-D-A-P-I 분석법을 사용하였습니다. 결과에 따르면, 80%의 생존 분석에서 캡슐화된 세포의 녹색 생존 세포가 확인되었으며, 다양한 시점에서 캡슐화된 인간 배아줄기세포의 생존력, 증식 및 세포사멸을 분석하여 배양 조건을 최적화하였습니다. 흥미롭게도, rock 억제제의 효과가 해리 유도 세포사멸을 방지하고 세포 생존력을 유지시켰으며, H-F-F-C-M 및 ri가 첨가된 배지에서 배양된 캡슐화 인간 배아줄기세포의 성장이 더욱 우수함을 나타냈습니다.본 예제에서는 세포 캡슐화를 3D 플랫폼으로 적용하여 캡슐화된 인간 배아줄기세포를 도파민성 뉴런으로 분화시킵니다. 예상대로 캡슐화된 세포 내 배아체의 크기는 시간이 경과함에 따라 증가하며, 배양 2~3일 후에는 90% 이상의 생존율과 함께 점진적인 뉴런 형태를 나타냅니다. 유전자 발현 분석 결과, 다능성 마커인 OCT four의 발현이 하향 조절되는 것으로 나타납니다.중요한 점은, 신경 전구세포 마커인 PAC six와 도파민성 신경세포 마커인 th가 분화 7일 후에도 계속 상향 조절된다는 것입니다. 추가로 분화시킨 인간 배아 줄기세포는 21일 후 TH 양성 신경세포가 90% 이상임을 나타냅니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 2D 세포 배양 시스템 대비 3D 시스템에서 TH와 PAC six의 유리한 발현 패턴을 확인하였습니다.이 기술을 숙달하면 2시간 이내에 효과적으로 수행할 수 있습니다. 캡슐화 전후에 락(rock) 억제제로 세포를 처리해야 함을 기억하십시오. 향후 실험을 위해 변이 유도제나 억제제를 사용하여 3D 분화 프로토콜을 맞춤 설정할 수 있습니다.이 특정 기술은 인간 ESL을 캡슐화하여 3D 환경에서 분화시키거나, 다수의 질환, 특히 파킨슨병의 세포 치료 가능성을 위해 사용됩니다.

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 3차원 골격 내에서 인간 신경 줄기 세포의 발달과 분화를 보여줍니다. 골격의 라미닌 코팅은 세포 부착을 촉진하고, 성장 인자를 사용하지 않는 신경 매질은 세포가 신경 전구 세포로 분화되도록 유도하여 다공성 구조 내에서 여러 방향으로 프로세스를 확장하여 3차원 배양을...

다공성 스캐폴드를 사용하여 인간 신경 줄기 세포를 3D 배양으로 분화

이 비디오에서는 인간 배아 줄기 세포를 신경 오가노이드로 만드는 단계적 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 신경 로제트 형성을 유도한 다음 조절된 성숙 및 소수성 막에서 최종 배양하여 완전히 발달된 신경 오가노이드를 달성하는 것을 포함합니다.

인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells)를 신경 오가노이드(Neural Organoids)로 분화하고 성숙시키다

프로토콜 정보는 두 번째 고조파 발생 나노 입자와 생체 표지 인간 배아 줄기 세포 제공됩니다. 다 광자 현미경과 심장 클러스터로 분화하여 hESC의 조사에 대한 방법론도 제시된다.

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다.  이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다.  이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

세포외 매트릭스 리간드는 폴리아크릴아미드 하이드로겔에 패턴화되어 밀폐된 콜로니에서 인간 배아 줄기 세포의 배양을 준수기판에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 견인력 현미경 검사법 및 생화학 적 분석을 결합하여 조직 기하학, 세포 생성 힘 및 운명 사양 간의 상호 작용을 검사 할 수 있습니다.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

이 원고는 hESC 분화 시 활성A및 CHIR99021을 최종 엔도덤(DE)으로 분화하여 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 기능성 간세포와 같은 세포(HLC)로 분화하기 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 헤파토세포와 같은 세포 유도를 위한 효율적인 방법

이 기사는 동축 유동 초점 장치를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 캡슐화를 설명합니다. 우리는이 미세 유체 캡슐화 기술이 hPSC 구상체의 효율적인 형성을 가능하게한다는 것을 보여줍니다.

인간 다능성 줄기 세포 구상체를 운반하는 코어-쉘 마이크로캡슐의 미세유체 제조

배우세요 인간 배아 줄기세포를 알긴산 마이크로캡슐에 캡슐화하여 3D 환경에서 도파민성 신경세포로 분화시키는 최적화된 기법입니다. 이 방법은 세포 간 상호작용을 강화하고 이식 시 면역 격리를 가능하게 합니다.

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