다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

이 프로토콜은 만능 인간 배아 줄기 세포를 캡슐화하고 3D 시스템에서 도파민 뉴런으로 분화하는 데 최적화되어 있습니다. 먼저, 콜로니를 암석 억제제 또는 RI로 처리하고, 알긴산나트륨과 혼합된 acuate를 사용하여 캡슐화 장치를 통과한 단일 세포에 연관시킵니다. RI 처리를 3일 동안 계속하고, 캡슐화된 세포를 PA 6개 세포에 이식하고 28일 동안 분화합니다.

궁극적으로 유전자 및 단백질 발현 분석은 도파민 뉴런 생성 효율이 더 높은 것으로 나타났습니다. 기존 2D 분화 프로토콜에 비해 이 특정 기술의 주요 장점은 3D 환경에서 이러한 세포를 증식시키고 분화하려고 시도하며 3D 환경은 세포가 고밀도 방식으로 증식할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 또한 분화를 위해 더 나은 세포 간 상호 작용을 할 수 있는 기회를 제공합니다.

셋째, 트랙에서 더 나은 차별화 효율성을 제공합니다. 또한 이 특정 기술은 3D 환경에서 증식할 수 있는 다른 유형의 세포에도 적용할 수 있다는 점을 덧붙이고 싶습니다. 예를 들어, 이 특정 기술은 세포 사멸을 방지하고 배양 접시에서 세포가 분리되는 것을 방지하는 특정 암석 억제제를 사용하여 최적화되었다는 것을 기억하십시오.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 이 기술이 일반적으로 조직 배양에서 수행되지 않기 때문에 처음에는 어려움을 겪을 것입니다. 다음 캡슐화 기술은 R 억제제 유형의 알긴산, 알긴산 농도 및 캡슐화 장치 설정의 적용에 대한 Dr.Dean Dr.Chad의 요약 연구를 기반으로 최적화되었습니다. 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Jamie와 Kim은 이제 이 프로토콜을 시연할 것입니다.

멸균 50 밀리리터 튜브 와류에 정제 된 알긴산 나트륨 275 밀리그램에 멸균 0.1 % 젤라틴 용액 25 밀리리터를 첨가하여 알긴산 분말을 부분적으로 용해시킵니다. 그런 다음 튜브를 10배 G의 오비탈 믹서에 하룻밤 동안 놓습니다. 다음으로, 알긴산 용액에 9% 멸균 염화나트륨을 첨가합니다.

30초 동안 볼텍스를 사용한 다음 95배 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 알긴산 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 먼저 어두운 환경에서 10마이크로몰의 암석 억제제가 보충된 배양 배지로 인간 배아 줄기세포를 전처리합니다.

섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 이제 DPBS로 세포를 두 번 세척하여 세포를 효소로 제거합니다. 아큐테인을 첨가하고 10분 동안 배양합니다.

섭씨 37도에서 세포 스크레이퍼로 세포를 부드럽게 채취하여 15ml 튜브로 옮깁니다. 동일한 양의 SL 매체로 Accutane을 중화하십시오. 그런 다음 40미크론 필터를 통해 중화된 세포를 새 50ml 원심분리기 튜브에 통과시킵니다.

이제 혈구 분석기를 사용하여 세포를 열거합니다. 원심 분리로 세포를 펠렛화하고 supinate를 조심스럽게 버립니다. 그런 다음 예열로 세포를 한 번 씻으십시오.

0.9%염화나트륨. 게인을 원심분리하고 supinate를 버리십시오. 인간 배아 줄기 세포를 캡슐화하려면 Resus가 예열 전 알긴산 용액으로 세포를 현탁시키는 것으로 시작합니다.

이렇게 하려면 20ml 주사기를 부드러운 플라스틱 튜브에 부착하고 주사기에 알긴산염을 흡입합니다. 그런 다음 기포를 생성하지 않고 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다. 이제 세포를 주사기로 흡인합니다.

플라스틱 튜브를 버리고 주사기를 캡슐화 기계에 부착합니다. 비드 발생기, 주사기 펌프, 기류 측정기 및 염화칼슘 침전 수조의 기기 설정으로 진행합니다. 캡슐화 기계의 끝과 페트리 접시 수거 지점 사이에 10cm의 간격이 있는지 확인합니다.

그런 다음 주사기 펌프를 시간당 10밀리리터로 설정합니다. 분당 8리터의 공기 흐름 속도와 100킬로 파스칼의 압력. 캡슐화된 세포를 7분 동안 예열 침전 수조에 수집합니다.

그런 다음 부드러운 흡인으로 20 밀리리터의 0.9 % 염화나트륨이 들어있는 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 캡슐을 튜브 바닥에 가라 앉히고 수피 네이트를 부드럽게 버린 다음 0.9 % 염화나트륨으로 한 번 씻습니다. 캡슐화된 세포를 암석 억제제가 보충된 예열 전 배양 배지에 재현탁시킵니다. 배양 플라스크에 옮겨 담고 3일 동안 배양합니다.

0.1% 젤라틴으로 코팅된 T 75 플라스크에 마우스 기질 라인 PA 6개 세포를 파종하고 24시간 동안 도파민 신경 분화 배지를 조절합니다. 캡슐을 50ml 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. supinate를 버리고 캡슐을 PA six cell condition dopaminergic neural differentiation에 재현탁시킵니다.

매체 문화. 캡슐화된 인간 배아 줄기세포를 PA 6세포 단층으로 21일 동안 투여했습니다. 미디어를 보충 할 때 변경 합니다.

매번 배지의 절반만이 도파민성 신경 분화에서 PA 6 세포를 계속 배양합니다. 배지는 일주일 동안 유도 인자를 보충했습니다. 먼저 캡슐을 흡인하고 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

캡슐이 바닥에 가라앉으면 supinate를 버리십시오. DPBS로 두 번 세척하고 supinate를 버리십시오. 그런 다음 5ml의 디캡 울룰라팅 용액을 넣고 현탁액을 철저히 혼합합니다.

실온에서 5분 동안 배양합니다. 펠릿을 원심분리한 후 디캡 세포와 DPBS로 두 번 세척하면 디캡 세포를 단층 배양으로 사용하거나 즉각적인 다운스트림 분석을 위해 계속 사용합니다. 일반적인 제제에서 알긴산 마이크로캡의 직경은 400 - 500 미크론입니다.

여기서, C-F-D-A-P-I 분석법입니다. 결과는 80%에서 녹색 생존 가능한 캡슐화 세포를 결정합니다.서로 다른 시점에서 캡슐화된 인간 배아 줄기 세포의 생존력, 증식 및 세포사멸 분석은 배양 조건을 최적화하는 데 도움이 됩니다. 흥미롭게도, 암석 억제제 효과는 해리에 의한 세포사멸을 방지하고 H-F-F-C-M 플러스 ri에서 배양된 캡슐화된 인간 배아 줄기 세포의 우수한 성장을 나타내며 세포 생존력을 유지합니다.

이 예시는 세포 캡슐화를 3D 플랫폼으로 적용하여 캡슐화된 인간 배아 줄기 세포를 도파민 뉴런으로 분화합니다. 예상한 바와 같이, 배아체의 크기는 dec 캡슐화 세포가 시간이 지남에 따라 증가하며, 배양 2-3일 후 90% 이상의 생존율로 진행성 신경 형태를 보여줍니다. 유전자 발현 분석은 만능 마커 OCT 4의 하향 조절을 나타냅니다.

중요한 것은 신경전구세포(neuro progenitor marker) PAC 6과 도파민성 신경세포(dopaminergic neuronal marker) th가 분화 7일 후에도 상향 조절된 상태를 유지한다는 것입니다. 추가로 분화된 인간 배아 줄기 세포는 21일 후 90% TH 이상의 양성 뉴런을 나타냅니다. Western loss analysis는 3D 대 2D 세포 배양 시스템에서 TH 및 PAC six의 유리한 발현 패턴을 확인합니다.

이 기술을 숙달하면 2시간 안에 효과적으로 수행할 수 있습니다. 캡슐화 전후에 암석 억제제로 세포를 처리하는 것을 잊지 마십시오. 변이 유도제 또는 억제제는 향후 실험을 위해 3D 분화 프로토콜을 맞춤화할 수 있습니다.

인간의 ESL을 캡슐화하고 3D 환경에서 구별하거나 여러 질병, 특히 파킨슨병에 대한 세포 치료 가능성을 위한 이 특별한 기술입니다.