인간 단백질 아틀라스 이내 조직 Microarrays, Immunohistochemistry의 염색법과 디지털 제작

본 절차의 전반적인 목표는 Human Protein Atlas와 같은 고처리량 프로젝트에서 여러 조직의 단백질 발현에 대한 정보를 동시에 얻기 위한 효율적인 방법을 사용하는 것입니다. 이는 먼저 포르말린 고정 파라핀 매립 조직의 대표 영역을 선택함으로써 수행됩니다. 다음으로 표시된 영역을 펀칭하고, 선택된 코어들을 단일 파라핀 블록인 조직 마이크로어레이(tissue microarray)로 조립합니다.

그 다음 TMA에서 섹션을 절단하고 면역조직화학 염색을 수행합니다. 마지막으로, 단백질 발현 패턴을 분석하여 그 데이터를 Human Protein Atlas에 게시합니다. 결과적으로, 조직 마이크로어레이와 면역조직화학 염색을 통해 조직 및 세포에서의 단백질 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

단일 조직 파라핀 블록으로 면역조직화학 염색을 수행하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 귀중한 생물학적 재료를 절약할 수 있으며 실험의 재현성이 더 높다는 것입니다. 이 기술의 또 다른 장점은 ENT 비용뿐만 아니라 실험실 처리 시간 또한 단축할 수 있다는 점입니다. 표준화된 길이의 조직 코어를 얻기 위한 이 절차의 시연은 저희 실험실의 실험실 기술자인 Ian call Bay가 맡아 진행하겠습니다.

스타일렛(stylet)에 표시를 합니다. 적절한 펀칭을 위해 파라핀 블록의 각 측면에 2.5~3.0 mm의 여백을 두어 파라핀이 갈라지는 것을 방지하는 것이 좋습니다. 펀치를 고정하고 있는 육각 소켓 나사를 풀고, 펀치 허브의 홈이 플라스틱 V 블록 내의 금속 막대에 밀착되도록 펀치의 위치를 잡습니다.

금속 클립의 가장자리가 수평이 되도록 확인하며 나사를 조입니다. 왼쪽에 수용측 펀치를, 오른쪽에 공여측 펀치를 삽입합니다. XY 조정 노브와 디지털 마이크로미터 판독값을 사용하여 X축과 Y축을 따라 펀치를 이동시킵니다.

기계를 리셋하려면 zero a BS 버튼을 눌러 인치와 밀리미터 단위를 전환하고, inch millimeter 버튼을 누르십시오. 9x8 템플릿에 1mm 펀치를 사용할 때, 수신 펀치가 너무 깊게 내려가 펀치가 손상되는 것을 방지하기 위해 구멍 중심 간의 거리를 측정했을 때 구멍 사이의 간격은 2mm가 되어야 합니다. 홀더에 빈 카세트를 넣고 Z 가이드 왼쪽 상단의 깊이 제한 나사를 사용하여 펀치 압입 최대 깊이를 설정하십시오. 수신 펀치의 하단 위치를 카세트 바닥에서 1mm 위에 오도록 설정하십시오. 조직 절편에서 해당 영역을 선택 및 표시하고 조직 마이크로어레이 제작을 위한 템플릿 설계를 마친 후, 수신 블록을 홀더에 넣고 가장 작은 드라이버를 사용하여 나사를 조이십시오.

파라핀이 카세트에서 떨어지는 것을 방지하기 위해 나사를 과하게 조이지 마십시오. 수신 펀치를 수신 블록 속으로 약 5 mm 정도 아래로 누른 다음, 펀치의 핸들을 사용하여 펀치를 앞뒤로 회전시킵니다. 그 후, 스프링에 의해 펀치가 위로 올라갈 수 있도록 아래로 누르던 압력을 천천히 풉니다.

스타일을 사용하여 펀치를 비우고 파라핀 코어를 폐기하십시오. 그런 다음 터렛을 이동하여 공여자 펀치로 전환하십시오. 다음으로, 수혜자 블록 홀더 위에 공여자 블록이 놓인 공여자 블록 브릿지를 배치하십시오.

관심 영역이 표시된 해당 헤마톡실린-에오신 염색 슬라이드를 사용하여 샘플링할 조직의 위치를 확인하십시오. 왼손으로 공여 블록을 고정하고 오른손으로 펀치를 누릅니다. 이때 스타이렛을 직접 누르지 마십시오. 깊이 제한 장치가 공여 블록에 적합한 위치에서 펀치의 움직임을 차단하지 않으므로, 스타이렛의 두 번째 표시가 보일 때 누르는 것을 멈추는 것이 중요합니다.

펀치의 핸들을 천천히 한 번 회전시킵니다. 공여 블록 브릿지 위에 공여 블록을 고정한 상태에서 아래로 가했던 압력을 해제합니다. 브릿지와 공여 블록을 제거합니다.

공여체 펀치가 이전에 뚫어놓은 구멍과 일직선으로 정렬되었는지 확인하십시오. 세트 나사를 사용하여 펀치 위치를 조정하십시오. 공여체 펀치와 수용체 블록의 구멍이 정렬되지 않은 경우, 펀치 끝이 수용체 블록 구멍의 상단에 닿을 때까지 펀치를 조심스럽게 아래로 밀어 내리십시오.

이 상태를 유지하면서, 스타일렛을 사용하여 조직 코어를 구멍 안으로 밀어 넣으십시오. 코어 표면은 블록 표면과 일직선이 되어야 합니다. 터렛을 다시 수신 펀치 위치로 이동시키십시오.

XY 조절 노브를 사용하여 다음 위치로 이동하고, 어레이가 완성될 때까지 수용 블록에서 샘플을 펀칭하는 과정을 반복합니다. 수용 블록을 제거하려면 홀더의 나사를 풉니다. 블록을 유리 슬라이드 위에 뒤집어 놓은 후 적절한 랙에 배치하고, 42 °C에서 40분 동안 블록을 굽습니다.

오븐에서 슬라이드와 블록을 꺼내고, 유리 슬라이드를 부드럽게 문질러 블록의 표면을 평평하게 만듭니다. 유리 슬라이드가 부착된 블록을 냉각판 위에 10분 동안 둡니다. 블록에서 유리 슬라이드를 제거합니다.

이제 블록 제작이 완료되어 절편 제작이 가능합니다. 절편 제작 후, 관심 단백질에 대한 항체를 사용하여 조직 마이크로어레이를 염색하고 디지털화합니다. www.proteinatlas.org 웹사이트에 접속하여 휴먼 프로테인 아틀라스(Human Protein Atlas)에서 해당 단백질을 검색하십시오.

관심 단백질의 ensemble id, UniProt accession number 또는 HGNC 이름(예: insulin)을 입력하십시오. 해당 단백질을 클릭한 후 하단의 정상 조직 및 기관 요약(normal tissue and organ summary) 섹션으로 스크롤하십시오. 개요에서는 췌장에서의 단백질 발현 상태를 보여줍니다.

탭을 클릭하십시오. 더 많은 조직 데이터가 표시됩니다. 장기별로 분류된 정상 조직 뷰가 화면에 나타납니다.

췌장을 클릭하여 동일한 단백질을 표적으로 하는 세 가지 항체에 대한 IHC 결과를 확인하십시오. 이미지를 클릭하면 췌장의 고해상도 이미지를 볼 수 있습니다. 이 그림에서는 조직 마이크로어레이의 품질 예시가 표시되어 있으며, 행과 열 사이 및 파라핀 가장자리에 충분한 공간이 있고 직선으로 적절하게 정렬된 어레이를 확인할 수 있습니다. 여기에서 일부 코어는 가장자리에 너무 가깝게 위치하여, 아마도 섹셔닝 과정에서 문제가 발생했을 가능성이 있습니다.

이 조직 마이크로어레이는 너무 오래 건조되어 적절한 템플릿 없이 붕괴되었습니다. 여기서는 직선으로 정렬된 열을 가진 적절하게 절단된 절편이 hematoxylin과 eosin으로 염색된 모습입니다. 무디거나 오염된 칼날은 여기에서 보이는 것처럼 찢어짐이나 이와 같은 압착된 절편을 유발할 수 있습니다.

림프절의 Germinal center 세포는 여기서 보는 바와 같이 배경 염색 없이 특이적인 세포질 염색을 나타내는 최적으로 적정된 항체 반응을 보여줍니다. 1차 항체의 농도가 너무 낮거나 면역 염색된 조직에 표적 단백질이 존재하지 않는 경우, 음성 또는 약한 염색이 나타납니다. 이 조직 절편은 1차 항체의 농도가 너무 높아 과염색된 상태입니다.

어두운 색상은 스필오버(spillover), 교차 반응 및 위양성으로 인해 세포 내 위치를 결정하는 데 어려움을 줍니다. 이 영상을 시청하고 나면 조직 마커 어레이를 제작하는 방법과 면역조직화학 염색을 수행하여 단백질 발현을 분석할 때 이를 사용하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 또한, 인간 조직 및 세포에서의 단백질 발현을 확인하기 위해 Human Protein Atlas를 탐색하는 방법도 잘 이해하게 될 것입니다.