의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :

다음 실험의 전반적인 목표는 기관 배양 슬라이스를 사용하여 대뇌 피질 발달 과정에서 유전자 기능을 신속하게 평가하는 것입니다. 이는 억제성 RNA와 GFP 마커를 발현하는 플라스미드를 생쥐 대뇌 피질에 도입함으로써 달성됩니다. 뇌에 짧은 전기 펄스를 가하여 플라스미드 DNA가 신경 전구 세포로 형질전환되도록 합니다.

다음으로, 뇌를 박리, 포매 및 절편화하여 ex vivo에서 신경세포 형태 형성(neuronal morphogenesis)이 가능한 장기 배양 절편(organotypic slices)을 제작합니다. GFP로 표지된 세포를 직접 관찰함으로써, 장기 배양 절편 내에서 이동성 또는 형태적 결함이 있는 피질 신경세포 하위 집단을 탐색할 수 있습니다. 안녕하세요, 브라운 대학교 분자생물학과 연구실에 오신 것을 환영합니다. 오늘은 Liza 박사와 두 명의 학생인 Kat Zer, Mark Seba가 신경 발달 연구에 매우 유용한 기술인 ex vivo 전기천공법(electroporation)과 장기 배양 절편 배양법을 시연하겠습니다.

이 방법은 신경발생, 신경세포 이동 및 신경세포 형태 형성 등 신경 발달의 다양한 측면에서 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 분석은 IBU 환경과 매우 유사한 조건에서 수행되므로, 기능이 알려지지 않은 유전자에 대해 형질전환 또는 녹아웃 동물을 생성하는 방식보다 비용이 저렴하고 신속한 대안을 제공합니다. 마지막으로, in vivo 전기 천공법과 비교했을 때, 이러한 vivo 전기 천공 실험의 성공 여부는 숙련된 수술 기법이나 기술 습득에 의존하지 않으며, 더 짧은 훈련 시간과 기술로도 수행이 가능합니다.

임신한 암컷 마우스를 안락사시킨 후, 배아를 각각의 태반낭에 담긴 상태로 얼음처럼 차가운 complete HBSS로 적출합니다. 다음으로 차가운 HBSS 용액 내에서 배아를 태반낭에서 꺼내고, 주입을 위해 첫 번째 경추 뒤쪽에서 머리 부분을 절단합니다. 맞춤 제작된 Hamilton 주사기를 사용하여 배아의 머리를 페트리 접시 위의 파라폼 종이 조각 위에 올립니다. 제3뇌실을 통해 6~8 µL의 DNA fast green mix를 주입합니다.

그 후, 혼합물은 피질 소포의 양측 뇌실을 모두 채우게 됩니다. 전기천공법을 위해 BTX 트위저 백금 전극을 사용합니다. 전기천공을 수행할 피질 쪽으로 양극 전극을 배치하십시오.

예를 들어, 등쪽 피질의 경우 전극을 머리 상단에 위치시켜야 합니다. 높은 형질전환 효율을 위해 DNA 농도는 항상 1 µg/µL로 조정하고, Maxi prep으로 분리한 DNA를 사용하십시오. 필요한 경우, 전기천공법 이후 DNA를 정제하기 위해 endotoxin free kit를 사용하십시오.

해부를 시작하기 전, 머리 부분을 얼음 위에서 최소 5분 동안 배양하십시오. 어린 배아 뇌의 손상을 방지하기 위해 전기천공법을 수행할 때 적절한 횟수의 전기 펄스와 전류를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 전기천공 후에는 조직이 매우 취약해집니다.

피부와 두개골이 피질 소포의 뇌수막을 잡아당길 수 있으며, 이는 두개골에서 분리할 때 피질 소포에 손상을 줄 수 있으므로 매우 주의 깊게 해부를 진행하는 것이 중요합니다. 5분 후, 차가운 HBSS 내에서 뇌를 적출합니다. 머리 측면에 작은 절개를 넣고 머리 양측의 피부를 벗겨내는 것부터 시작하십시오.

다음으로, 정밀 핀셋을 사용하여 뇌에서 연질막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 두개골에서 온전한 뇌를 꺼냅니다. 작업이 완료되면 뇌를 얼음처럼 차가운 HBSS에 보관하고 조직 임베딩을 준비합니다.

몰드에 3% 저융점 아가로스(low melting point agarose)를 채우기 시작합니다. 아가로스가 몰드 바닥 부근에서 응고될 수 있도록 몰드를 얼음 위에 놓습니다. 이때 뇌 조직이 지지된 상태로 중앙에 위치하도록 유지하십시오.

이제 미세 핀셋을 사용하여 HBSS에서 뇌를 조심스럽게 꺼내고, 킴와이프나 여과지로 과잉 버퍼를 흡수한 후, 저융점 Agros에 뇌를 넣습니다. 그다음 피펫 팁을 사용하여 몰드 내부에서 뇌를 회전시켜 Agros와 조직 간의 접촉을 최대화합니다. 모든 뇌를 옮긴 후, 각 뇌가 몰드 내에서 거의 동일한 방향과 깊이로 위치하도록 조정합니다.

아가로스(agarose)는 약 5분 후에 응고됩니다. 따라서 신속하게 작업하십시오. 얼음 위에서 5분 더 배양하여 아가로스가 완전히 응고되도록 합니다.

블록을 고정하기 전에 과도한 aros 부분을 다듬으십시오. 그런 다음 속결성 플라스틱 접착제를 사용하여 aros 블록들을 서로 부착하며, 적층된 각 뇌의 후각구(olfactory bulbs)가 위쪽을 향하도록 배치해야 합니다. 블록 부착이 완료되면, 각 뇌가 vibrato에 의해 절단될 수 있도록 aros를 다듬으십시오.

그런 다음 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS에 담급니다. 블록을 절단하려면 vibratome의 속도를 최대 속도의 약 절반 정도로 낮게 설정하고, 칼날 진동 주파수를 가장 높은 설정으로 맞춥니다. 그런 다음 250 micron 두께의 관상면 절편을 제작하고, 굽은 미세 스패튤라를 사용하여 절편을 회수한 후 미세 붓이나 핀셋으로 조직 웰로 옮깁니다.

조직이 agros에서 빠져나온 경우, 조직 배양 후드 내에서 조직과 agros의 접촉이 충분히 형성되지 않은 것이므로, 6-웰 플레이트의 각 웰에 1.8 milliliters의 슬라이스 배양 배지를 준비하고, 각 웰에 laminin polylysine이 코팅된 organotypic insert를 배치합니다. organotypic 슬라이스 insert 상단에 500 microliters의 슬라이스 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음, 각 insert에 최대 5개의 슬라이스를 옮깁니다.

다음으로, 슬라이스의 형태를 최대한 유지하고 세포 사멸을 최소화하기 위해 슬라이스 상단의 과잉 배지를 제거합니다. 건강한 액체-공기 계면(liquid air interface)이 유지되고 슬라이스가 배지에 떠오르지 않도록 하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 슬라이스를 습도가 조절되는 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다.

이틀마다 막 아래 배지 부피의 절반을 교체하십시오. 슬라이스가 배지 위에 떠다니지 않도록 해야 합니다. 전기천공된 컨스트럭트를 발현하는 뉴런은 전기천공 후 이르면 8시간 만에 시각화할 수 있습니다. 원하는 배양 일수가 지난 후, 분석을 위해 막에 있는 슬라이스를 고정하십시오.

각 유기 전형 삽입물을 따뜻한 PBS로 5분 동안 세척하십시오. 총 3회 PBS 세척을 수행한 후, 4% paraformaldehyde를 사용하여 4°C에서 1시간 동안 조직을 고정합니다. 고정 후에는 세포 마커로 조직을 분석하거나 단순히 hooks stain으로 염색할 수 있습니다. 1시간 후, 1X PBS로 10분씩 3회 슬라이스를 세척하십시오.

그런 다음 1X PBS에 희석한 10% 염소 혈청 용액에서 절편을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 투과화합니다. 이어 조직을 hooks로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 염색합니다. 대기하는 동안 1X PBS로 10분씩 3회 부드럽게 흔들어 씻어내어 염색약을 제거합니다.

조직을 슬라이드 위에 올린 후 충분히 잠길 수 있는 깊이의 수조에 프로스티드 글라스 슬라이드를 배치합니다. 절편을 부착하기 위해, 먼저 메스로 막을 절개하여 분리합니다.

둘째, 미세 핀셋을 사용하여 최대 5개의 막 결속 슬라이스를 물에 잠긴 각 슬라이드로 옮깁니다. 셋째, 각 슬라이스에서 과잉의 물을 제거합니다. 넷째, 각 뇌 슬라이스에 플로어 마운트 용액(floor mount solution)을 한 방울씩 도포합니다.

마지막으로, 슬라이스 위에 커버글라스를 조심스럽게 덮고 기포를 제거합니다. 그러면 전기천공된 DNA의 양과 배아 단계에 따라 현미경 관찰이 가능한 상태가 됩니다. 전기천공 시, 형질전환 효율은 서로 다른 것으로 나타났습니다.

P silencer와 GFP 벡터로 형질전환한 지 8시간 후, 세포에서 GFP가 발현되기 시작했습니다. 더 긴 배양 기간 동안 세포는 증식, 이동, 초기 신경 분화를 포함한 일반적인 신경 발생 과정을 거칩니다. 이 절차를 수행하는 동안 배지의 공기 접촉면이 잘 유지된다면, 이러한 절편들은 5일 동안 형태를 유지했습니다.

동물을 안락사시킨 시점부터 절편을 멤브레인 인서트에 배치하는 시점까지 전체 실험 과정을 2시간 이내에 완료하는 것이 중요하며, 이는 해당 절차 이후의 세포 사멸을 최소화하기 위함입니다. 다양한 성장 인자나 약리학적 제제가 여러 신경 발달 기전에서 어떤 역할을 하는지와 같은 질문에 답하기 위해, 오가노타이픽 절편에 외인성 인자를 첨가하는 것과 같은 추가 실험을 수행할 수 있습니다.