의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 : 예 생체내 RNAi의 Electroporation

다음 실험의 전반적인 목표는 유기형 절편을 사용하여 대뇌 피질 발달에서 유전자 기능을 신속하게 평가하는 것입니다. 이는 플라스미드(plasmids), 코엑스(coex), 발현 및 억제성 RNA 및 A GFP 마커를 murn 대뇌 피질에 도입함으로써 달성됩니다. 짧은 전기 폭발이 뇌에 가해져 플라스미드 DNA가 신경 전구 세포를 형질 주입할 수 있도록 합니다.

다음으로, 뇌를 해부, 삽입 및 절편화하여 생체 외 신경 형태 형성을 거칠 수 있는 유기형 절편을 생성합니다. 유기형 절편은 GFP 표지된 세포를 직접 관찰하여 이동 또는 형태학적 결함이 있는 피질 뉴런 하위 집단을 검색할 수 있습니다. 안녕하세요, 오늘 브라운 대학의 분자생물학과에 있는 제 연구실에 오신 것을 환영합니다, Dr.Liza와 두 명의 학생, Kat Zer와 Mark Seba는 신경 발달 연구에 매우 유용한 기술인 생체 외 전기천공법 기술과 유기형 슬라이스 배양을 시연할 것입니다.

이 방법은 신경 발생, 신경 세포 이동 및 신경 형성을 포함한 신경 발달의 다양한 측면에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 분석은 IBU 환경과 거의 근사치로 수행되기 때문에 기능을 알 수 없는 유전자에 대한 형질전환 또는 녹아웃 동물 생성에 대한 저렴한 비용과 빠른 대안을 제공합니다. 마지막으로, 생체 내 전기 작동 기술과 비교하여, 이러한 생체 전기 작동 실험의 성공은 숙련 된 수술, 기술 개발에 의존하지 않으며 더 짧은 교육 시간과 기술로 수행 할 수 있습니다.

임신한 암컷 쥐를 안락사시킨 후, 배아를 얼음처럼 차갑고 완전한 HBSS로 해부하여 각각의 태반 자루에 보관합니다. 다음으로 차가운 HBSS 용액에서 자루에서 배아를 꺼내고 주사를 위해 첫 번째 척추뼈 후 머리를 잘라낸 다음 맞춤형 해밀턴 주사기를 사용하여 페트리 접시 위에 있는 파라폼 종이 조각에 머리를 놓습니다. 6-8 마이크로 리터의 DNA 빠른 녹색 혼합물을 제 3 심실을 통해 주입합니다.

거기에서 혼합물은 피질 소포의 양쪽 측면 심실을 채울 것입니다. 전기천공을 위해 BTX 핀셋 백금 전극이 사용됩니다. 전기천공될 피질의 측면을 향해 양극을 놓습니다.

예를 들어, 전극은 머리 위에 있어야 합니다. 높은 transfection 효율을 위해 항상 DNA의 농도를 마이크로리터당 1마이크로그램으로 조정하고 Maxi prep에서 분리된 DNA를 사용하십시오. 필요한 경우 내독소가 없는 키트를 사용하여 전기천공법 후 DNA를 정제합니다.

머리를 해부하기 전에 얼음 위에서 최소 5분 동안 배양합니다. 전기천공법을 할 때 어린 배아의 뇌가 손상되지 않도록 적절한 양의 전기 펄스와 전류를 사용하는 것이 매우 중요합니다. electroporation 후에, 조직은 아주 허약하게 됩니다.

피부와 학교가 피질 소포의 수막을 잡아당길 수 있으므로 매우 조심스럽게 해부하는 것이 중요하며, 이는 두개골에서 제거될 때 피질 소포를 손상시킬 수 있습니다. 5분 후, 차가운 상태에서 뇌를 해부한다. HBSS는 머리 측면을 작게 절개하고 머리 옆의 피부를 벗겨내는 것으로 시작합니다.

다음으로, 가는 집게로 뇌에서 피아를 부드럽게 떼어냅니다. 두개골에서 온전한 뇌를 제거합니다. 완료되면 뇌를 얼음처럼 차가운 HBSS에 보관하고 조직을 내장할 준비를 합니다.

3%의 낮은 융점으로 금형을 채우기 시작합니다. 아그로스. 곰팡이가 곰팡이 바닥 근처에서 굳어지도록 곰팡이를 얼음 위에 놓습니다. 첫째, 뇌가 지지되고 중심을 유지하도록 합니다.

이제 가는 집게로 HBSS에서 뇌를 부드럽게 제거하고 김 물티슈 또는 여과지로 여분의 완충액을 흡수한 다음 뇌를 낮은 융점으로 설정합니다. 아그로스. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 곰팡이 내부의 뇌를 소용돌이치게 하여 아그로스와 조직 사이의 접촉을 최대화합니다. 모든 뇌가 이식된 상태에서 각 뇌를 틀 내에서 거의 동일한 방향과 깊이로 배치합니다.

아로스는 약 5분 안에 굳어질 것입니다. 따라서 빨리 작업하십시오. 얼음 위에서 5분을 더 배양하여 아로스가 완전히 굳어지도록 합니다.

블록을 장착하기 전에 과도한 부분을 다듬으십시오. 그런 다음 빠르게 접착되는 플라스틱 접착제를 사용하여 아그로스 블록을 서로 부착하고, 스택의 각 뇌는 후각 전구가 위로 향하도록 배치해야 합니다. 블록이 부착되면 각 뇌가 비브라토에 의해 절단되도록 아로스를 다듬습니다.

그런 다음 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS에 담그십시오. 블록을 자르려면 비브라토스 속도를 최대 속도의 약 절반인 저속으로 설정하고 블레이드 진동 주파수를 가장 높은 설정으로 설정합니다. 그런 다음 250미크론 두께의 코로나 절편을 생성하고, 구부러진 미세한 주걱을 사용하여 절편을 회수한 다음 미세한 브러시나 집게로 조직 웰로 옮깁니다.

조직이 어그로스에서 떨어지면 조직 배양 후드에서 조직 아그로스 접촉이 충분히 형성되지 않았으며, 웰당 1.8밀리리터의 슬라이스 배양 배지가 있는 6웰 플레이트를 준비하고 각각에 라미닌 폴리티 라이신의 유기형 삽입 코드를 배치합니다. 500마이크로리터의 슬라이스 배양 배지를 유기형 슬라이스 인서트 상단에 추가합니다. 그런 다음 각 삽입물에 최대 5개의 슬라이스를 옮깁니다.

다음으로, 슬라이스 상단에서 여분의 배지를 제거하여 슬라이스가 형태를 최대한 보존하고 세포 사멸을 최소화하도록 합니다. 건강한 액체 공기 계면을 유지하고 슬라이스가 매체에 떠다니지 않는 것이 중요합니다. 마지막으로, 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도의 슬라이스를 배양합니다.

격일로 멤브레인 아래에 있는 매체 부피의 절반을 교체하십시오. 절편은 매체에 떠 있어서는 안 되며, 전기천공된 구조체를 발현하는 뉴런은 원하는 배양 일 후 전기천공 후 8시간 이내에 시각화할 수 있습니다. 분석을 위해 멤브레인의 슬라이스를 고정합니다.

각 유기 타이픽 인서트를 따뜻한 PBS로 5분 동안 세척합니다. 총 3번의 PBS 세척을 수행한 다음 섭씨 4도에서 1시간 동안 4%파라폼 알데히드로 조직을 고정합니다. 고정 후 조직은 세포 마커로 분석하거나 단순히 후크 염색으로 염색할 수 있습니다.한 시간 후 한 번의 XPBS로 10분 세척으로 슬라이스를 세척합니다.

그런 다음 10% 염소 세럼 용액에 실온에서 2시간 동안 슬라이스를 투과성 1 XPBS에 넣고 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 고리로 티슈를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 염색합니다. 기다리는 동안 부드럽게 흔들면서 한 번의 XPBS에서 10분 동안 세 번 세척하여 얼룩을 제거합니다.

젖빛 유리 슬라이드를 슬라이드에 놓은 후 티슈를 목욕시킬 수 있을 만큼 충분히 깊은 수실에 놓습니다. 슬라이스를 마운트합니다. 먼저 메스로 멤브레인을 잘라냅니다.

둘째, 가는 집게를 사용하여 최대 5개의 멤브레인 결합 조각을 물에 잠긴 각 슬라이드로 옮깁니다. 셋째, 각 슬라이드에서 여분의 물을 제거합니다. 넷째, 각 뇌 조각에 바닥 장착 용액 한 방울을 바릅니다.

마지막으로 슬라이스 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓고 기포를 제거합니다. 그런 다음 절편은 전기천공된 DNA의 양과 배아 단계에 따라 현미경 검사를 할 준비가 됩니다. electroporation에서 transfection 효율은 다양하다는 것이 밝혀졌습니다.

P silencer를 사용한 transfection 8시간 후, GFP 벡터 세포는 GFP를 발현하기 시작했습니다. 더 긴 배양 기간 동안 세포는 증식, 이동 및 초기 신경 세포 분화를 포함한 정상적인 일련의 신경인성 사건을 겪습니다. 이 슬라이스는 이 절차를 시도하는 동안 미디어 에어 인터페이스가 잘 유지되는 경우 5일 동안 형태를 유지했습니다.

동물을 안락사시키는 순간부터 2시간 이내에 절편을 멤브레인 삽입물에 넣는 순간까지 전체 실험을 수행하여 이 절차에 따라 세포 사멸을 최소화하는 것이 중요합니다. 유기형 용해에 외인성 인자를 추가하는 것과 같은 다른 방법은 다양한 신경 발달 메커니즘에서 다양한 성장 인자 또는 약리학적 제제의 역할은 무엇입니까?