Name: 의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 : 예 생체내 RNAi의 Electroporation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 대뇌피질 발달에서 유전자 기능을 평가하는 ex vivo 전기천공 기법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 신경발생과 뉴런 이동을 연구하는 신경발달학 연구에 활용됩니다.

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우리는 pSil-GFP 만들어낸 그림 1의 그림에 대한 박사 Alper Uzun 및 공촛점 현미경을위한 Leduc Bioimaging 시설을 제공하는 박사 Shirin Bonni 감사드립니다. EMM은 버로우즈 Wellcome 기금, NARSAD 젊은 수사관 수상, 그리고 NIH NCRR 코브레 P20 RR018728-01에서 의학을위한 경력 수상에 의해 지원됩니다. SBL은 NIH NCRR 코브레 P20 RR018728-01에 의해 지원되며, PHS NRSA 5T32MH019118-20의 지원을 받았습니다.

1. (아니라 비디오) 문화 솔루션 및 미디어 준비하기 <ol><li> 1X HBSS, 2.5 MM Hepes (pH7.4), 30 MM D-글루코오스, 1 ㎜ CaCl 2, 1 ㎜ MgSO 4와 4 MM NaHCO 3을 포함하는 완전한 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 1 리터를 준비합니다. 이중 증류수 (ddH 2 O)를 추가합니다. 4에 0.2-μm의 필터 및 매장 ° C.로 소독을 필터링 </li><li> 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 이글 매체의 35 ML을 사용하여 슬라이스 문화 매체, 전체 HBSS의 12.9 ML, 20 MM D-글루코오스 (1 M 솔루션의 1.35 ML), 1 ㎜ Glutamax (200 MM 솔루션의 0.25 ML), 페니실린 0.5 ML 준비 - 스트렙토 마이신 100x 주식. 0.2-μm의 필터로 멸균을 필터링한 후 5 % 최종 농도로 혈청 열 inactivated 목마를 추가합니다. </li><li> 1 MG / 멸균 증류수 탈이온수와 ML Laminin 주식 솔루션을 만들어 Laminin 작업 솔루션을 준비합니다. -80에서 0.5 ML eppendorf 튜브에서 100 μL aliquots을 준비하고 동결 ° C. </li><li> 그래서 폴리-L-라이신 작업 준비1 MG / ML 주식 솔루션을 만들기 위해 폴리-L-라이신의 5 MG로 멸균 H 2 O 5 ML를 추가하여 lution. -20 ° C.에서 1 ML aliquots과 프리즈를 준비 </li><li> 멸균 물 12 ML의 최종 볼륨 폴리-L-라이신 1 ML과 laminin의 100 μL를 diluting하여 코팅 용액을 준비한다. 매번 신선이 솔루션을 확인하십시오. </li></ol> 2. Organotypic 슬라이스 삽입을합니다 (동영상) 준비 <ol><li> 한 문화 삽입마다 잘 멸균 포셉을 이용하여 2 백 6 - 웰 플레이트를 준비합니다. 문화 삽입 아래 무균 ddH 2 O 2 ML을 추가합니다. </li><li> 찔린에 멤브레인 처리하지 복용 막 위에 코팅 용액 1 ML을 추가합니다. 37 humidified 배양기에서 하룻밤 품어 ° C에서 5 % CO 2. </li><li> 코팅 미디어를 제거하고 살균 H 2 0 세 번으로 멤브레인 씻는다. 사용하기 전에 건조 삽입하자. ° C 배양기에서 37 슬라이스 문화 매체와 장소의 1.8 ML을 추가합니다. Parafilm과 함께 사용하지 않는 접시 감싸주세요그리고 최대 4 주까지 4 ° C에서 저장합니다. </li></ol> 3. (아니라 비디오) Electroporation 준비하기 <ol><li> electroporation을 위해 RNAi의 구조를 준비합니다. 더블 스트랜드 RNA의 머리 핀의 자형 삽입은 pSilencer 벡터로 복제되었다. 플라스미드가 포함되어 있습니다 : 1) 이중 가닥 RNA 생성하게 만들수있는 U6업자, 그리고 2) GFP 발현 카세트가 CMV 프로 모터에 의해 구동 8,9. 이 플라스미드는 이전 코니시 및 동료 9, 다른 7,8에 의해 설명되었다. Plasmids는 Qiagen 맥시 간이 키트를 사용하여 정제, 1 밀리그램 / ML의 농도로 사용됩니다. </li><li> 그것을 주입하는 동안 DNA를 시각화하기 위해서는 0.5 % 빠른 녹색 염료 솔루션을 준비하고 (일반적으로 빠른 그린의 1 μL와 DNA 20 μL) 주입되는 DNA로 1시 20분에서 사용합니다. 남은 DNA가 빠른 녹색 염료 혼합물은 최대 일주일 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 깨끗한 절개 지역 dissectiNG 도구와 70 %의 에탄올과 v​​ibratome 들어왔습니다. 그것이 얼음 춥다 있도록 완벽한 HBSS를 풀어. 급속한 냉각을위한 물 vibratome에서나 주위 얼음을 포장하여 칠이 vibratome 용기. 전체 HBSS를 사용 3% 낮은 용융 점 아가로 오스를 준비합니다. 1 분 용 마이크로 웨이브. 끓는 동안 피한다. 사용할 때까지 42 ° C ~ waterbath에 두십시오. </li><li> Electroporation 매개 변수는 다음과 같이 설정됩니다. E15 배아 사용에 35 V의 경우, 5 펄스, 100 MS 길이, 펄스 사이의 900 MS 간격. 오래된 동물의 경우 electroporation을 위해, 50 V에 높은 전압을 사용 또는 8 펄스로 펄스의 개수를 증가시킬 수 있습니다. 어린 동물에서 조직 손상을 방지하기 위해 25 중 적은 펄스 또는 최대 2 펄스와 낮은 전압을 사용하여 V. 이러한 매개 변수는 다양하고 경험적으로 동물의 나이에 따라 결정됩니다. </li></ol> 4. 해부 및 Electroporation (동영상) <ol><li> 임신 여성 euthanizing 후, 얼음 추위 전체 HBSS로 배아를 해부. 별처럼그들의 개인 placental 주머 니나 각 배아를 EP. </li><li> 배아를 해부하고 첫 번째 척추 후 머리를 잘라. 얼음 추위 전체 HBSS에 두십시오. </li><li> 주사의 경우 배양 접시 위에 Parafilm의 조각에 머리를 놓습니다. 피질 vesicles의 두 측면 심실을 작성하기 위해 세 번째 뇌실을 통해 빠른 녹색 염료 믹스 : 사용자 정의를 사용하면 해밀턴 주사기 DNA의 8-6에 대한 μL를 주입 (제가 표 참조)했다. 또는 주사는 각 측면 뇌실에 직접 수행할 수 있습니다. </li><li> 전직 생체내 electroporation의 경우, BTX-트위터의 백금 전극을 사용합니다. 당신 지느러미 피질을 위해 머리 즉, 상단을 electroporate하려는 피질의 편으로의 긍정적인 전극을 배치합니다. </li><li> electroporation 후 해부하기 전에 적어도 5 분 동안 얼음에 머리를 품어. </li><li> 얼음 추위 HBSSby은 머리의 측면에 작은 절개를 만들고 머리의 측면 떨어져 피부를 필링으로 뇌를 해부. 와 다음부드럽게 벗겨 버릴 미세 포셉 두뇌에서 PIA. 피질을 손상하지 않도록 돌보는 두개골에서 그대로 두뇌를 제거합니다. </li></ol> 5. (비디오) 삽입 및 Electroporated Cortices의 Sectioning <ol><li> 빙판에 놓여 대형 금형에 3퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스를 전송합니다. 금형의 하단보다 빠르게 금형의 하단 아래로 가라앉고에서 머리를 방지할 수있는 응고하기 시작합니다. 부드럽게, 알았어 포셉 Kimwipe 또는 여과지로 여분의 버퍼를 제거 후 하나씩 함께 머리를 전송합니다. 아가로 오스와 뇌 조직 사이의 최대 인터페이스를 보장하기 위해 금형 내부의 소용돌이 머리에 10 μL pipet 팁을 사용합니다. </li><li> 모든 머리를 보장하는 동양 두뇌가 같은 방향으로하고 아가로 오스에 대해 동일한 수준입니다. 아가로 오스는 약 5 분 동안 응고하자. 후각 전구가 서되도록 아가로 오스 블록을 부착하는 본딩 접착제 (미친 접착제)를 사용합니다. 블록이 첨부되면, 즉시 전 추가CE 감기의 HBSS와 반드시 개별 조각을 만드는 아가로 오스 잘라 각 뇌를 얻을 수 있습니다. </li><li> , 블록을 썰어 저속 (반 최대 약)에 vibratome의 속도를 설정하고 가장 높은 설정에 날개 진동 주파수를 설정합니다. 250 μm의 두께 코로나 슬라이스를 생성합니다. 구부러진 미세 주걱을 사용하여 조각을 검색하고 벌금 브러시 또는 집게로 조직 우물로 전송할 수 있습니다. </li><li> 조직 문화 후드에 코팅된 인서트로 조각을 전송. 전송이 용이하도록 각 인서트로 슬라이스 문화 미디어 500 μL를 추가합니다. 최대 5 조각까지가 삽입마다 배치될 수 있습니다. 조각의 위로부터 초과 미디어를 제거하고 37 ° C에서 humidified 인큐베이터에서 부화. </li></ol> 6. 문화 Organotypic 조각의 분석 (동영상) <ol><li> 건강한 조각을 유지하기 위해서는 신선한 미디어는 미디어 매번의 절반을 대체하여 멤브레인 밑에 적어도 매일 추가됩니다. </li><li> D 이후 조각을 분석하기 위해서는문화 esired 일, 멤브레인에서 슬라이스를 수정. ° C에서 세 번 10 분, 각 시간을 37 1X 인산염 완충액 식염수 (PBS)으로 씻는다. 다음, 4 ° C에 또는 상온에서 1 시간을위한 야간 4 % Paraformaldehyde (PFA)로 수정 프로그램입니다. </li><li> 조각이 다른 세포 마커로 분석하거나 electroporated 및 비 electroporated 세포를 시각화하는 혼자 Hoechst 물들일 수있다. Permeabilize와 10 % 염소 혈청, 부드러운 진동과 1X PBS에 0.​​1 %의 트리톤과 함께 실온에서 2 시간을위한 조각을 차단합니다. </li><li> 상온에서 1 시간 동안 Hoechst와 청바지, 때마다 부드러운 진동과 함께 1X PBS로 10 분들과 3 회 씻는다. </li><li> 조각은 메스와 멤브레인를 잘라 마운트하고, 서리 낀 유리 조각을 포함 멤브레인를 전송하는 멋진 집게를 사용하는 것은 물 챔버에서 슬라이드. 최대 5 조각은 유리 슬라이드마다 배치될 수 있습니다. 여분의 물을 제거하고, 각 뇌 슬라이스에 Flourmount 용액 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 뇌 조각 위에 coverslip을 배치하고를 제거Y 공기 거품이. 공촛점 현미경을 사용하여 슬라이스를 분석합니다. </li></ol> 7. Organotypic 조각의 대체 파라핀의 임베딩합니다 (동영상) <ol><li> Organotypic 조각도이를 위해 세밀한 형태학의 분석을 위해 파라핀을 위해 임베디드 수 organotypic 조각이 들어있는 막은 PFA는 위에서 설명한 것처럼 4%에서 수정하실 수 있습니다. </li><li> 고정 조각은 1퍼센트 아가로 오스 (37 ° C로 미리 예열)에 임베디드, 그리고 30 분 동안 얼음에서 확정됩니다. 아가로 오스 블록 그런 다음 30 분 동안 4 ° C에서 4퍼센트 PFA에서 사후 해결할 수 있습니다. </li><li> organotypic 슬라이스를 포함하는 아가로 오스 블록 후 파라핀에 포함된하고 이전 10 설명된대로 immunofluorescence을위한 처리됩니다. </li></ol> 8. 대표 결과 organotypic 조각의 murine 피질과 문화 electroporation의 도표 표현은 그림 1에 표시됩니다. 이 방법은 rapi를위한 유용한 전략입니다의 연결을 개발 11에 관련된 유전자의 기능의 D 평가. DNA electroporated의 양과 electroporation에서 배아 단계에 따라 transfection 효율이 달라집니다. 조각은 적어도 8시간 포스트 electroporation과 세포 문화 neurogenic 이벤트 (증식, 이주, 그리고 초기의 연결을 분화)의 정상적인 순서를 받게 될 것이다 GFP를 표현하기 시작합니다. 그림 2는 pSilencer-GFP 컨트롤을 표출하는 electroporated 뇌의 슬라이스를 보여줍니다 벡터와 하나의 연결을 progenitors, 마이 그 레이션 뉴런과 슬라이스의 차별화된 뉴런을 관찰하실 수 있습니다. 그들이 세포막에 좋은 미디어 에어 인터페이스에 유지하고 있으며 문화에 적어도 5 일 이내에 사용할 수있는 Organotypic 조각은 긴 것처럼 그들의 형태를 유지합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> 1 그림. 전직 생체내의 electroporation과 organotypic 슬라이스의 삽화문화 분석. E14.5 배아 밖을 해부하고, 개별적으로 사출 사이트를 시각화하기 위해 빠른 녹색 색소가 섞인 DNA에 주입하고 있습니다. 측면 심실을 채우기 위해 그림에 또는 제 3 뇌실에 묘사된대로 DNA가 측면 심실 모두에서 주입 수 있습니다. 주사 후, 두뇌는 두뇌의 원하는 측면에 긍정적인 전극을 배치 평방 파도 electroporator로 electroporated있다. 두뇌는 3퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스와 vibratome를 사용 sectioned에 포함됩니다. 250 μm의 뇌 조각은 0.4 μm의 삽입에 위치하고 주일까지 배양해 있습니다. GFP는 8 시간 포스트 transfection 후 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> 그림 2. electroporated 뇌 슬라이스의 분석. Electroporated 뇌 조각이 Hoescht 위해 물들어 있었다. 등 부분의 피질 심실 구역 (VZ)에서 electroporated의 연결을 progenitors를 보여줍니다. corti의 뉴런칼 플레이트 (CP)는 한계 구역 (MZ)로 구분된 있습니다. 흰색 화살표가 이주 뉴런을 보여줍니다. 이 경우, 두뇌는 E15.5에 주입되었고 pSilencer GFP 제어 벡터와 electroporated. 섹션 4 일 electroporation 후 피질 explants를 나타냅니다. 스케일 바 100 μm의. 문제 해결 : <ol><li> 낮은 transfection 효율 : 최소 1 μg / μL에 사용된 DNA의 농도를 조정합니다. 필요한 사용 엔도 무료 Quiagen 키트는 DNA를 정화하는 경우에는 항상 맥시의 초등학교에서 매우 깨끗한 DNA를 사용합니다. </li><li> 한 원하는 아닌 다른 뇌 영역에 transfected 세포가 : 전극이 electroporated되는 두뇌의 측면에 대한 긍정적인 전극의 위치에 정확하게 위치하고 있는지 확인합니다. </li><li> 매일 변경 매체와 조각 미디어에 떠되지 않도록 : Organotypic 조각은 형태를 잃게 </li><li> 그들이 바이올렛에 절단되는대로 조각은 아가로 오스 그만 좀bratome : 낮은 용융 점 아가로 오스에 머리를 삽입하면 좋은 인터페이스가 만들어되었는지 확인하십시오. </li></ol>

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</ol>

우리는 공개 할게 없다.

이중 좌초된 RNA 헤어핀 8과 4는 몇 가지 뚜렷한 장점을 제공 organotypic 조각 문화 인코딩 plasmids의 전직 생체내의 electroporation을 포함한 이러한 방법. 첫째, 이러한 방법은 RNAi 파생 phenotypes의 신속한 평가를 위해 수 있습니다. 이중 좌초된 RNA의 머리핀을 운전 U6 프로 모터를 포함하는 동일한 pSilencer 벡터의 표현 카세트 인코딩 GFP의 포함은 RNAi 벡터와 electroporated 세포의 신속한 식별 및 특성을 허용합니다. 시간 효율성뿐만 아니라, 이러한 방법은 여러 한방 라인의 세대에 비해 매우 비용 효과적입니다. 둘째, 동물과 electroporation의 성공의 생존을 보장하는 이상 훈련 및 기술 개발을 필요로 생존 electroporation 기술 12에 비해, 방법은 여기서 설명은 짧은 훈련 시간과 기술이 함께 수행할 수 있습니다. 생체내 생존의의urgeries 또한 동물 (어미...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 해밀턴 주사기 </td><td> 해밀턴 </td><td> 80,008 </td><td> 0.5 인치 길이 31 게이지, PT-4 (포인트 beveling 수준), 10μl 부피 </td></tr><tr><td> 플래티넘 tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5mm 크기 </td></tr><tr><td> ECM830 electroporator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX Footswitch </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> ECM830 electroporator 함께 사용하기위한 </td></tr><tr><td> 블레이드 마이크로톰 진동 </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 삽입과 함께 사용하기 위해 잘 요​​리 </td><td> 매 </td><td> 353,502 </td><td> 삽입에 맞게 노치를 포함 </td></tr><tr><td> 조직 문화에 삽입 </td><td> 매 </td><td> 353,090 </td><td> 0.4 마이크로 미터 </TD&gt; </tr><tr><td> 빠른 그린 </td><td> 시그마 </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 아가로 오스 </td><td> 어부 </td><td> BP165-25 </td><td> DNA 학년 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> 기저 중간 이글 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> 칼슘과 MG없이 10X HBSS </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES없는 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

의 연결을 morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 murine 대뇌 피질에서&gt; rnai의 electroporation

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

대뇌 피질은 고등인지 기능을 연결해줍니다. 이 여섯 계층 구조는 마지막으로 태어난 뉴런은 뇌의 1의 표면을 향해 첫 번째 태어난 뉴런 지났 마이 그 레이션하는 동안 첫 번째 태어난 뉴런은 뇌실에 가깝게 유지하는 내부 - 먼저, 외부 - 지난 방식에 생성됩니다. 의 연결을 마이 그 레이션이 이외에, 정상적인 대뇌 피질의 기능을위한 핵심 프로세스의 연결을 morphogenesis 3의 규정입니다. 의 연결을 morphogenesis는 기본 문화권의 체외에서 공부 할 수 있지만,이 프로세스가 조직 환경에서 규제하는 방식으로부터 배울 것이 많이 있습니다. 우리는 대뇌 피질 4,6의 organotypic 조각에의 연결을 마이 그 레이션 및 / 또는 morphogenesis을 분석하는 기법을 설명합니다. pSilencer 수정된 벡터는 이중 좌초된 머리 핀의 자형으로 RNA를 몰고 U6업자와 B를 구동 GFP 단백질을 암호화 별도의 표현 카세트를 모두 포함하는 데 사용됩니다또 CMV 프로 모터 7-9. 우리의 접근법은 후보 유전자의 특정 최저시 neurite 가지 결함의 신속한 평가를 허용하고 성공적으로 neurite의 파생물 8 규제에 대한 화면에 사용되었습니다. 세포만을 집합은 RNAi 구조를 표현하므로, organotypic 조각은 잠재 phenotypes의 모자이크 분석을 위해 수 있습니다. 이 분석은 생체내 환경의 가까운 근사치에 완료되기 때문에 더구나, 그것은 미지의 대뇌 피질 기능의 유전자에 대한 낮은 비용과 유전자 변형 또는 녹아웃 동물의 생성에 대한 빠른 대안을 제공합니다. 마지막으로 생체내의 electroporation 기술에 비해, 전직 생체내의 electroporation 실험의 성공 여부는 능숙하게 수술 기술 개발에 의존 아니므로 짧은 훈련 시간과 기술이 함께 수행할 수 있습니다.

대뇌 피질의 발달에서 유전자의 기능의 신속한 평가를 실시하기 위해, 우리는 관련된 방법을 설명<em&gt; 예 생체내</emplasmids의&gt; electroporation 억제 RNA (RNAi)와 murine 배아 피질에서 GFP를 공동 표현. 이 프로토콜은 neurogenesis,의 연결을 마이 그 레이션 및 dendrite와 축삭의 파생물을 포함하여의 연결을 morphogenesis 등 neurodevelopment의 다양한 측면의 연구를 의무이다.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

대뇌피질은 고등 인지 기능을 지시합니다. 이 6층 구조는 내부에서 외부 순으로 생성되며, 이 과정에서 ...

다음 실험의 전반적인 목표는 기관 배양 슬라이스를 사용하여 대뇌 피질 발달 과정에서 유전자 기능을 신속하게 평가하는 것입니다. 이는 억제성 RNA와 GFP 마커를 발현하는 플라스미드를 생쥐 대뇌 피질에 도입함으로써 달성됩니다. 뇌에 짧은 전기 펄스를 가하여 플라스미드 DNA가 신경 전구 세포로 형질전환되도록 합니다.다음으로, 뇌를 박리, 포매 및 절편화하여 ex vivo에서 신경세포 형태 형성(neuronal morphogenesis)이 가능한 장기 배양 절편(organotypic slices)을 제작합니다. GFP로 표지된 세포를 직접 관찰함으로써, 장기 배양 절편 내에서 이동성 또는 형태적 결함이 있는 피질 신경세포 하위 집단을 탐색할 수 있습니다. 안녕하세요, 브라운 대학교 분자생물학과 연구실에 오신 것을 환영합니다. 오늘은 Liza 박사와 두 명의 학생인 Kat Zer, Mark Seba가 신경 발달 연구에 매우 유용한 기술인 ex vivo 전기천공법(electroporation)과 장기 배양 절편 배양법을 시연하겠습니다.이 방법은 신경발생, 신경세포 이동 및 신경세포 형태 형성 등 신경 발달의 다양한 측면에서 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 분석은 IBU 환경과 매우 유사한 조건에서 수행되므로, 기능이 알려지지 않은 유전자에 대해 형질전환 또는 녹아웃 동물을 생성하는 방식보다 비용이 저렴하고 신속한 대안을 제공합니다. 마지막으로, in vivo 전기 천공법과 비교했을 때, 이러한 vivo 전기 천공 실험의 성공 여부는 숙련된 수술 기법이나 기술 습득에 의존하지 않으며, 더 짧은 훈련 시간과 기술로도 수행이 가능합니다.임신한 암컷 마우스를 안락사시킨 후, 배아를 각각의 태반낭에 담긴 상태로 얼음처럼 차가운 complete HBSS로 적출합니다. 다음으로 차가운 HBSS 용액 내에서 배아를 태반낭에서 꺼내고, 주입을 위해 첫 번째 경추 뒤쪽에서 머리 부분을 절단합니다. 맞춤 제작된 Hamilton 주사기를 사용하여 배아의 머리를 페트리 접시 위의 파라폼 종이 조각 위에 올립니다. 제3뇌실을 통해 6~8 µL의 DNA fast green mix를 주입합니다.그 후, 혼합물은 피질 소포의 양측 뇌실을 모두 채우게 됩니다. 전기천공법을 위해 BTX 트위저 백금 전극을 사용합니다. 전기천공을 수행할 피질 쪽으로 양극 전극을 배치하십시오.예를 들어, 등쪽 피질의 경우 전극을 머리 상단에 위치시켜야 합니다. 높은 형질전환 효율을 위해 DNA 농도는 항상 1 µg/µL로 조정하고, Maxi prep으로 분리한 DNA를 사용하십시오. 필요한 경우, 전기천공법 이후 DNA를 정제하기 위해 endotoxin free kit를 사용하십시오.해부를 시작하기 전, 머리 부분을 얼음 위에서 최소 5분 동안 배양하십시오. 어린 배아 뇌의 손상을 방지하기 위해 전기천공법을 수행할 때 적절한 횟수의 전기 펄스와 전류를 사용하는 것이 매우 중요합니다. 전기천공 후에는 조직이 매우 취약해집니다.피부와 두개골이 피질 소포의 뇌수막을 잡아당길 수 있으며, 이는 두개골에서 분리할 때 피질 소포에 손상을 줄 수 있으므로 매우 주의 깊게 해부를 진행하는 것이 중요합니다. 5분 후, 차가운 HBSS 내에서 뇌를 적출합니다. 머리 측면에 작은 절개를 넣고 머리 양측의 피부를 벗겨내는 것부터 시작하십시오.다음으로, 정밀 핀셋을 사용하여 뇌에서 연질막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 두개골에서 온전한 뇌를 꺼냅니다. 작업이 완료되면 뇌를 얼음처럼 차가운 HBSS에 보관하고 조직 임베딩을 준비합니다.몰드에 3% 저융점 아가로스(low melting point agarose)를 채우기 시작합니다. 아가로스가 몰드 바닥 부근에서 응고될 수 있도록 몰드를 얼음 위에 놓습니다. 이때 뇌 조직이 지지된 상태로 중앙에 위치하도록 유지하십시오.이제 미세 핀셋을 사용하여 HBSS에서 뇌를 조심스럽게 꺼내고, 킴와이프나 여과지로 과잉 버퍼를 흡수한 후, 저융점 Agros에 뇌를 넣습니다. 그다음 피펫 팁을 사용하여 몰드 내부에서 뇌를 회전시켜 Agros와 조직 간의 접촉을 최대화합니다. 모든 뇌를 옮긴 후, 각 뇌가 몰드 내에서 거의 동일한 방향과 깊이로 위치하도록 조정합니다.아가로스(agarose)는 약 5분 후에 응고됩니다. 따라서 신속하게 작업하십시오. 얼음 위에서 5분 더 배양하여 아가로스가 완전히 응고되도록 합니다.블록을 고정하기 전에 과도한 aros 부분을 다듬으십시오. 그런 다음 속결성 플라스틱 접착제를 사용하여 aros 블록들을 서로 부착하며, 적층된 각 뇌의 후각구(olfactory bulbs)가 위쪽을 향하도록 배치해야 합니다. 블록 부착이 완료되면, 각 뇌가 vibrato에 의해 절단될 수 있도록 aros를 다듬으십시오.그런 다음 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS에 담급니다. 블록을 절단하려면 vibratome의 속도를 최대 속도의 약 절반 정도로 낮게 설정하고, 칼날 진동 주파수를 가장 높은 설정으로 맞춥니다. 그런 다음 250 micron 두께의 관상면 절편을 제작하고, 굽은 미세 스패튤라를 사용하여 절편을 회수한 후 미세 붓이나 핀셋으로 조직 웰로 옮깁니다.조직이 agros에서 빠져나온 경우, 조직 배양 후드 내에서 조직과 agros의 접촉이 충분히 형성되지 않은 것이므로, 6-웰 플레이트의 각 웰에 1.8 milliliters의 슬라이스 배양 배지를 준비하고, 각 웰에 laminin polylysine이 코팅된 organotypic insert를 배치합니다. organotypic 슬라이스 insert 상단에 500 microliters의 슬라이스 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음, 각 insert에 최대 5개의 슬라이스를 옮깁니다.다음으로, 슬라이스의 형태를 최대한 유지하고 세포 사멸을 최소화하기 위해 슬라이스 상단의 과잉 배지를 제거합니다. 건강한 액체-공기 계면(liquid air interface)이 유지되고 슬라이스가 배지에 떠오르지 않도록 하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 슬라이스를 습도가 조절되는 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다.이틀마다 막 아래 배지 부피의 절반을 교체하십시오. 슬라이스가 배지 위에 떠다니지 않도록 해야 합니다. 전기천공된 컨스트럭트를 발현하는 뉴런은 전기천공 후 이르면 8시간 만에 시각화할 수 있습니다. 원하는 배양 일수가 지난 후, 분석을 위해 막에 있는 슬라이스를 고정하십시오.각 유기 전형 삽입물을 따뜻한 PBS로 5분 동안 세척하십시오. 총 3회 PBS 세척을 수행한 후, 4% paraformaldehyde를 사용하여 4°C에서 1시간 동안 조직을 고정합니다. 고정 후에는 세포 마커로 조직을 분석하거나 단순히 hooks stain으로 염색할 수 있습니다. 1시간 후, 1X PBS로 10분씩 3회 슬라이스를 세척하십시오.그런 다음 1X PBS에 희석한 10% 염소 혈청 용액에서 절편을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 투과화합니다. 이어 조직을 hooks로 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 염색합니다. 대기하는 동안 1X PBS로 10분씩 3회 부드럽게 흔들어 씻어내어 염색약을 제거합니다.조직을 슬라이드 위에 올린 후 충분히 잠길 수 있는 깊이의 수조에 프로스티드 글라스 슬라이드를 배치합니다. 절편을 부착하기 위해, 먼저 메스로 막을 절개하여 분리합니다.둘째, 미세 핀셋을 사용하여 최대 5개의 막 결속 슬라이스를 물에 잠긴 각 슬라이드로 옮깁니다. 셋째, 각 슬라이스에서 과잉의 물을 제거합니다. 넷째, 각 뇌 슬라이스에 플로어 마운트 용액(floor mount solution)을 한 방울씩 도포합니다.마지막으로, 슬라이스 위에 커버글라스를 조심스럽게 덮고 기포를 제거합니다. 그러면 전기천공된 DNA의 양과 배아 단계에 따라 현미경 관찰이 가능한 상태가 됩니다. 전기천공 시, 형질전환 효율은 서로 다른 것으로 나타났습니다.P silencer와 GFP 벡터로 형질전환한 지 8시간 후, 세포에서 GFP가 발현되기 시작했습니다. 더 긴 배양 기간 동안 세포는 증식, 이동, 초기 신경 분화를 포함한 일반적인 신경 발생 과정을 거칩니다. 이 절차를 수행하는 동안 배지의 공기 접촉면이 잘 유지된다면, 이러한 절편들은 5일 동안 형태를 유지했습니다.동물을 안락사시킨 시점부터 절편을 멤브레인 인서트에 배치하는 시점까지 전체 실험 과정을 2시간 이내에 완료하는 것이 중요하며, 이는 해당 절차 이후의 세포 사멸을 최소화하기 위함입니다. 다양한 성장 인자나 약리학적 제제가 여러 신경 발달 기전에서 어떤 역할을 하는지와 같은 질문에 답하기 위해, 오가노타이픽 절편에 외인성 인자를 첨가하는 것과 같은 추가 실험을 수행할 수 있습니다.

methods-for-study-neuronal-morphogenesis-ex-vivo-rnai-electroporation

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

이 프로토콜은 관련 개선 explant 절차를...

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배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

학습하세요 대뇌피질 발달에서 유전자 기능을 평가하는 ex vivo 전기천공 기법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 신경발생과 뉴런 이동을 연구하는 신경발달학 연구에 활용됩니다.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :

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