DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

본 절차의 전체적인 목적은 조직 절편에서 두 가지 주요 유형의 DNA 단절을 표지하는 이중 표지 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 센서는 ZI와 루민(Rumine)으로 이중 표지된 30 뉴클레오타이드 DNA 올리고뉴클레오타이드와 자가 조립되는 효소인 vaccinia topo isomerase one(또는 vac topo)으로 구성됩니다. VAC topo가 30 뉴클레오타이드에 결합하면 기계적 작동이 시작되며, topo가 인식 서열의 3' 말단에서 올리고뉴클레오타이드를 절단하여 vac topo가 활성화된 fitzy 표지 단위와 아민 표지된 자유 헤어핀을 생성합니다.

말단 3'-hydroxyl이 있는 경우, 유닛들의 수명은 짧으며 빠르게 원래의 구조물로 재조립된 후 이후에 절단됩니다. 추가적인 분자 내 DNA 절단이 없는 경우, 이 두 유닛은 주기적으로 계속해서 분리되고 다시 결합합니다. 분자 센서를 DNA 손상이 있는 조직 절편에 적용하면, Fitz 표지 검출 유닛이 5'-hydroxyl을 가진 평활 말단 DNA 절단 부위에 선택적으로 부착됩니다.

R-도메인 표지 검출 장치는 5' 말단 인산화 둔탁 말단 절단 부위에 결합합니다. T4 DNA Ligase가 존재하면, 형광 현미경을 통해 세포 내 DNA 1 및 DNA 2 유형 DNA 절단의 존재와 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. TUNEL과 같은 기존의 DSB 검출 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 특이성이 더 높으며, 세포 자율적 단계와 식세포 단계의 세포 사멸을 모두 표지함으로써 추가적인 정보를 제공한다는 점입니다.

나노기술 관점에서 이 센서는 실제 생물학적 구조와 아키텍처를 독성이 없는 분자 규모 장치 구축에 적용하는 바이오 기반 접근 방식을 보여줍니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 고활성의 Toro SOM 제제를 사용해야 하고, proteinase K에 의한 과소화를 방지하기 위해 섹션 처리를 정확하게 수행해야 성공할 수 있으므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 위한 조직 섹션은 분자 장치를 조립하기 전에 준비해야 합니다. paraldehyde에서 절단한 5~6 µm 두께의 섹션을 준비합니다.

파라핀 고정 포매 조직 블록을 권장합니다. 조직 절편이 있는 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣고 15분 동안 자일렌에서 왁스를 제거합니다. 15분 후, 새로운 자일렌 배스로 옮겨 5분 동안 추가로 처리합니다.

슬라이드를 다음과 같은 단계별 에탄올 농도에 통과시켜 절편을 재수화합니다. 96% ethanol에 5분씩 두 번, 80% ethanol에 5분간 처리한 후, 물에 통과시킵니다.

각 5분씩 2회 반복합니다. 재수화 후 단면을 proteinase K로 소화시킵니다. 단면당 50 µg/mL 용액 100 µL를 사용하여 습윤 챔버 내 실온에서 15분 동안 배양합니다. 조직 유형에 따라 소화 시간을 조정해야 할 수 있으나, 과도한 소화는 신호 소실 및 단면 파손을 유발하므로 소화가 완료될 때 주의하십시오.

슬라이드를 증류수로 10분씩 2회 헹굽니다. 프리 블로킹(pre-blocking)을 위해 2% BSA를 도포하고 습윤 챔버 내의 실온에서 15분 동안 배양합니다. 이 시간 동안, 이 비디오의 다음 장면에 나오는 것과 같이 분자 기계를 조립하십시오.

분자 기계 조립에 필요한 모든 시약은 일반적인 크기의 조직 절편에서 1회 검출하기에 충분한 총 부피 25 microliters에 맞게 조정되었습니다. 필요에 따라 작은 플라스틱 튜브에서 부피를 늘릴 수 있습니다. 증류수를 사용하여 다음 시약들을 순서대로 혼합하십시오.

15% polyethylene glycol 8,000, T4 DNA Ligase 버퍼, 이중 표지된 올리고뉴클레오타이드, vaccinia topoisomerase I 및 T4 DNA Ligase를 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 분자 구조체는 이 용액 내에서 거의 즉시 자가 조립되며, 상온에서 즉시 사용할 수 있습니다. DNA 절단 부위의 표지 절차를 시작하려면, 슬라이드에서 사전 블로킹 용액을 흡입하여 제거합니다.

각 섹션에 전체 반응 혼합물 25 µL를 도포합니다. 섹션 위에 플라스틱 커버슬립을 덮고 슬라이드를 습윤 챔버에 넣습니다. 챔버를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단한 후, 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

1시간의 배양 후 ligase 및 topo 신호가 모두 관찰될 수 있지만, 많은 경우 ligase 신호를 더욱 강화할 수 있습니다. 신호를 강화하려면 vac topo와 oligonucleotide one을 제외하고 oligonucleotide three와 T four DNA Ligase가 포함된 반응 혼합물을 다시 도포한 뒤, 절편 위에 플라스틱 커버 슬립을 덮고 습윤 챔버에서 18시간 동안 배양하십시오. 다음 날 실온에서 슬라이드를 실온의 물이 담긴 coplan jar에 수직으로 조심스럽게 담가 커버 슬립을 제거하십시오.

그 후 절편을 증류수로 10분씩 3회 세척합니다. 소듐 바이카보네이트 완충액으로 절편을 헹굽니다. 이 알칼리성 용액 헹굼 단계는 pH에 민감하며 pH 7 미만에서 현저히 감소하는 fitzy 형광을 강화합니다.

마지막으로, 대조 염색을 위한 핵 염색제가 포함된 DPI 함유 항퇴색 용액으로 절편을 덮은 후 커버슬립을 씌웁니다. 이제 절편을 형광 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. 이 그림은 dexamethasone 처리된 흉선 조직 절편으로, 분자 기계가 세포 사멸이 진행 중인 흉선 피질 영역의 DNA 1 및 DNA 2 유형의 평활 말단 DNA 절단을 검출한 모습입니다. 녹색 세포질 형광은 DNA 2 유형의 절단을 나타내며, 피질 대식세포가 사멸하는 흉선 세포의 핵 물질을 소화하는 모습이 관찰됩니다.

이 신호는 vac topo에 의해 생성되며, 5' 말단 하이드록시기를 포함하는 DNA가 있는 FGA 리소좀에 국소화됩니다. 이중 가닥 절단은 DNA의 한 가지 유형의 절단을 표시하는 적색 형광으로 나타나며, 대식세포에 의해 포식되지 않은 세포사멸 흉선세포의 핵을 나타냅니다. 수많은 흉선세포가 동시에 세포사멸을 일으킵니다.

리게이즈 기반 표지를 통해 시각화된 5개의 프라임 인산염 이중 가닥 절단 생성과 함께 나타납니다. 이러한 절단은 핵 주변부에 위치하며 고리 모양의 패턴을 형성합니다. 모든 세포 핵은 dpi 대조 염색을 통해 파란색으로 시각화되었습니다.

이 절차를 수행하는 동안, 서로 다른 용액을 첨가하는 사이에 절편이 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한 모든 효소 제제는 절편에 첨가하기 전까지 얼음에 보관하고, 형광 프로브는 라벨링 반응 및 현상 과정 동안 빛으로부터 보호하십시오. 이 기술을 통해 헤테로 세포 분해의 모든 단계를 시각화할 수 있었습니다.

이 센서는 나노 규모의 입자, 프로브 및 기계 설계에 적용된 그린 나노기술 접근 방식의 한 사례입니다. 이 방식은 인공 구성 요소와 천연 분자 기계 부품을 결합합니다. 그 목적은 고분산된 나노 물질의 독성과 부정적인 생물학적 반응성을 제거하는 것입니다.