Name: DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 DNA 손상 감지를 위한 세미인공 분자 기계 조립 및 활용 방법을. 백신아토포아이소머라제를 이용한 이중 표지 센서로 조직 섹션의 DNA 절단을 시각화하고 암 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 국립 신경 장애 연구소 및 행정, 건강의 국립 연구소 (VVD)로부터 신경 장애 및 뇌졸중, 국민 ARRA를 통해 보건 연구소 (VVD)과 R21의 국립 연구소에서 R21 NS064403 부여하여 부여 R01NS062842에 의해 지원되었다 바이오 메디컬 이미징 및 생물의 EB006301 국립 연구소, 건강 (VVD)의 국립 연구소.

자신의 준비는 분자 장치의 조립보다 더 많은 시간을 소요하기 때문에 분자 기계 기반의 탐지에 대한 부분 먼저 준비되어야합니다. 구조는 paraformaldehyde - 고정, 파라핀 - 임베디드 조직 블록에서 컷 5 6μm 두께 부분과 잘 작동합니다. 이러한 ProbeOn 플러스 충전 및 precleaned 슬라이드 (피셔 과학) 또는 유사한뿐만 아니라 섹션을 유지 슬라이드 브랜드를 사용합니다. 우리는 최초의 dexamethasone - apoptotic 취급 쥐 thymus 13,14으로 DNase I -와 DNase II 타입 휴식을 모두 포함하고 DNA 손상의 잘 알려진 패턴을 가진 조직을 이용하여하는 것이 좋습니다. 1. 섹션의 준비 <ol><li> 15 분 크실렌의 슬라이드 랙 및 dewax의 섹션을 장소, 추가 5 분 신선한 크실렌 욕조에 전송할 수 있습니다. </li><li> 등급 에탄올 농도 통과하여 Rehydrate : 96% 에탄올 2x5min, 80 % 에탄올 - 5 분​​, 물 - 2x5 분. </li><li> Proteinas과 다이제스트 섹션전자 K. 섹션 당 50μg/mL 솔루션의 100μL를 사용하십시오. humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C)에서 품어 15. 시간은 조직 유형에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. 하드 조직은 더 이상 소화가 필요 할 수도 있습니다. 15-25 분 시간은 일반적으로 사용됩니다. 부족 소화가 약한 신호가 발생할 수 있습니다. 신호 실종 및 섹션 파괴에 반대 결과에 Overdigestion. </li><li> 2x10 분 증류수로 씻어. </li><li> preblocking에 대한 2 % BSA 100 μL 당 섹션을 적용합니다. 상온에서 15 분 (23 ° C)를 품어. 이 시간 동안 분자 기계를 조립. </li></ol> 2. 분자 기계 조립 모든 시약은 평균 크기의 조직과 (10x10mm)에서 하나의 검출에 충분한 25 μL 총 볼륨에 대한 결정됩니다. 필요에 따라 볼륨이 최대 크기를 조정하실 수 있습니다. <ol><li> 이 순서에서 작은 플라스틱 튜브의 통합 : </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;TR&gt; <td><ol><li> Bidistilled 물; </li><li> 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000; </li><li> 66 솔루션 MM - 트리스 HCL, pH를 7.5, 5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP (즉, 정기적으로 T4 DNA ligase의 버퍼); </li><li> Oligonucleotide 일 70 pmoles, </li><li> 215 pmoles (1.76-7.1 μg) VACC TOPO </li><li> 10 대 T4 DNA ligase (500 U / ML) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> pipetting으로 조심스럽게 섞는다. 분자는이 솔루션에서 즉시 자기 조립 구조 실내 온도 (23 ° C)에서 즉시 사용할 수 있습니다. 37 온도를 증가 ° C 블록 라벨의 T4 DNA ligase 기반 구성 요소입니다. </li></ol> 3. 이중 레이블 5&#39;OH 및 5&#39;PO4 DNA의 휴식 시간에 조직 섹션에서 분자 기계를 사용하여 <ol><li> preblocking 솔루션을 기음과 Oligonucleotide 일 70 pmoles, 53 포함 전체 반응 믹스의 25μL 적용 - 215 pmoles (1.76-7.1 μg) VACC를66 MM - 트리스 HCL, 산도 7.5, 5mM MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP, 그리고 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000의 솔루션 TOPO 10 대 T4 DNA ligase (500 U / ML). 단일 FITC 라벨 Oligonucleotide 2 나르는 동일한 시퀀스 oligonucleotide는 DNA 나누기의 단일 유형의 탐지를 위해 대신 사용할 수 있습니다. 이러한 경우에는 상표 반응에서 ligase를 생략하면됩니다. 또한 이런 상황에서 50mM 트리스 - HCL, 산도 7.4의 솔루션 15 % PEG - 8000는 T4 DNA ligase의 버퍼 대신 사용할 수 있습니다. </li><li> 플라스틱 coverslip와 humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C)에서 1 시간을위한 품어. 빛과 보호합니다. 16의 온도를 낮추는 ° C의 ligase 기반의 신호를 감소, 37의 온도 증가 ° C 완전히 ligase 기반의 신호를 제거합니다. ligase의 부분 억제 때로는 topoisomerase의 준비를 도입 오염 물질로 인해 가능, 반응 혼합물에 발생합니다. 따라서, 더 이상 부화 (2~4시간)이 필요 수도 있습니다 특히의ligase - 라벨 쉬는 ignificant 번호는 존재한다. ligase 및 topo 신호 모두 많은 경우,이 단계에서 관찰 될 수 있지만 ligase 신호 VACC TOPO 및 듀얼 표시된 Oligonucleotide없이 반응 믹스의 다시 응용 프로그램에 의해 더욱 강화된 수 있지만 머리핀 모양의 oligonucleotide (Oligonucleotide 3)이 포함된 수 (35 MG / ML)와 T4 DNA ligase (250 U / ML). 향상시키기 위해 신호는 5 단계로 이동하십시오 개선하지 않고 반응을 보려면, 3 단계로 진행합니다. </li><li> 부드럽게 실온에서 물을 포함하는 Coplin 항아리에 세로 슬라이드를 immersing하여 coverslips를 제거합니다. 초과 물을 기음. </li><li> VACC TOPO와 Oligonucleotide 일없이 반응 믹스 25 μL을 적용하지만, Oligonucleotide 세를 포함하여 ligase 신호를 강화 : 66 MM - 트리스 HCL, pH를 7.5, 5 밀리미터 MgCl 2, 0.1 MM dithioerythritol, 1 ㎜ ATP, 그리고 15 % 폴리에틸렌 글리콜 - 8000, 5 대 T4 DNA ligase 35 MG / ML Oligonucleotide 3 (무딘 머리 핀의 자형으로 종료). 라벨 솔루션 CA의 총 부피N은 큰 섹션을 수용까지 확장할 수 있습니다. 플라스틱 coverslip와 humidified 챔버의 실내 온도 (23 ° C) 18 HR (야간)를 품어. </li><li> 부드럽게 실온에서 물을 포함 Coplin 항아리에 세로 슬라이드를 immersing하여 coverslips를 제거합니다. 다음 증류수 섹션 3x10 분 씻으십시오. </li><li> 나트륨 중탄산염 버퍼와 린스. 알카라인 솔루션은 산도 민감하고 상당히 산도 7 아래의 감소 FITC 형광을 향상 린스. </li><li> antifading 솔루션 (DAPI로 Vectashield), coverslip와 부분을 커버하고 형광 현미경을 사용하여 신호를 분석할 수 있습니다. 5&#39;OH로 두 번 스트랜드의 DNA 휴식 시간은 녹색, 5&#39;PO 4 나누기를 형광 빛이 나겠 - 레드 (그림 2) 형광합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> 그림 1. 세미 인공 분자 기계는 다음 두 가지 유형의를 감지현장에서 DNA 손상. VACC TOPO는 이중 머리핀 32 메르에 바인딩하면 형광 기계 자체 - 조립. 기계를 통해 두 검출기 단위로 분할 자체로 작업을 시작 topoisomerase 만들어진 인식 순서의 3 &#39;끝에 했네요. FITC - 레이블이 붙은 장치가 지속적으로 분리와 rhodamine - 레이블 단위로 religates 순환 과정에서이 결과를. 감지 DNA 브레이크가 발생되기 전까지이 지속. 이러한 대안 수용체 (5&#39;OH 뭉툭한 끝 DNA 휴식) 조직 섹션에있는 경우, FITC 부분은 그것을 ligate 것입니다. 나머지 rhodamine 부분은 T4 DNA ligase의의 도움으로 5 &#39;PO 4 DNA 뭉툭한 끝 휴식에 연결합니다. 따라서 DNA 나누기 두 가지 유형의 동시에 감지됩니다. <img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> 그림 2. 분자 기계 이중 라벨 DNA 나누기 두 종류의dexamethasone - 처리 thymus의 조직 섹션 인치 DNase의 무딘 엔드 DNA의 휴식 시간은 I -와 DNase II - 타입은 apoptosis를 겪고 thymic 피질 영역에서 감지됩니다. 녹색 형광 세포질 (5&#39;OH DNA 나누기)은 apoptotic thymocytes의 핵 물질을 소화 외피 macrophages을 표시합니다. 이 신호는 VACC TOPO에 의해 생산, 그리고 5&#39;OH 더블 스트랜드 휴식 11,12를 포함하는 DNA와 phagolysosomes에 localizes 있습니다. 적색 형광 (5&#39;PO 4 나누기) macrophages에 의해 빨아들이는하지 apoptotic thymocytes의 레이블 핵. thymocytes의 거대한 숫자가 동시에, 5&#39;PO 4 번 스트랜드 나누기의 생성과 함께 apoptosis를 받아야 ligase 기반의 라벨로 시각. 이러한 휴식은 고리 모양의 패턴을 형성, 핵 주변에 위치하고 있습니다. 모든 세포의 핵은 DAPI (파란색 형광)과 counterstaining에 의해 시각입니다.

<ol><li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li>
<li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Pol+expeditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+machines%3A+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li>
<li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li>
<li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+machines%2C+Maxwell%27s+demon+and+living+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li>
<li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+as+a+molecular+machine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li>
<li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+molecular+machines%3A+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel%28II%29+scorpionate+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li>
<li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+KE+%22Nanosystems%3A+Molecular+Machinery%2C+Manufacturing+and+Computation%22">Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation</a>. , Wiley. New York. (1992).</li>
<li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreitas%2C+RA+%22Nanomedicine%3A+basic+capabilities%22">Nanomedicine: basic capabilities</a>. , Landes Bioscience. Austin. (1999).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%3A+designs+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis%3A+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li>
<li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Letters%22%5BJournal%5D)">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li>
<li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3%27+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li>
<li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li>
<li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+RAL+%22Soft+Machines%3A+Nanotechnology+and+life%22">Soft Machines: Nanotechnology and life</a>. , Oxford University Press. USA. (2007).</li>
<li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trashing+the+genome%3A+Role+of+nucleases+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에서는, 우리는 이중 라벨의 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 센서는 생체 분자 엔진, 인공 구성 요소와 연결된 바이러스 인코딩된 단백질 VACC의 TOPO에 의한 분자 기계입니다. 표시 개발 무독성 분자 규모의 장치 12,15의 디자인에 생물 학적 구조, 아키텍쳐 및 세포의 실제 부품과 구성 요소를 채택 옹호 생체 활성화된 접근 방식을 exemplifies. 1 :이 방법은 생체내의 nanosensors의 분야에 내재된 두 가지 문제를 해결합니다. 전통 nanomaterials를 사용하여 나노 구조 정말 균일하고 재현성 만드는 어려움 및 2. 잠재적인 독성 및 나노 프로브, 입자 및 기타 고도로 분산된 nanomaterials의 높은 생물 학적 반응. 센서는 DNA 손상 라벨의 새로운 기능에 다시 직접 인공 구성 요소와 자연 - 발생 분자 기계를 통합합니다. 이러한 통합 제품은 SE입니다MI - 인공 분자 기계는 새 작업을 타겟으로. topoisomerase...

<ol><li> 크실렌 </li><li> 80 96 % 에탄올. </li><li> 증류수에 (BSA) 소 혈청 알부민의 2 % 솔루션입니다. </li><li> Oligonucleotide 1 : 이중 머리핀, 이중이 플루오레신 및 tetramethylrhodamine으로 표시 : </li></ol> GCG AT 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT는 R TT - 3 &#39;; F - FITC - DT, R - Tetramethylrhodamine - DT. 이러한 BODIPY TR, rhodamine 또는 TAMRA 같은 다른 빨간 이동 fluorophores은 R 대신 tetramethylrhodamine에 사용할 수 있습니다. 또는 당신은 Oligonucleotide 2 사용할 수 있습니다 -. 플루오레신으로 표시 더블 머리 핀의 자형으로 단일 (DNA 나누기의 하나의 유형 (DNase II 타입 전용)의 검출을위한 단일 형광단 운반 탐사선이 상당히 저렴하고 편리한 때마다 단일 DNA 나누기의 유형은 표시되어야하는 것입니다 : 5&#39; - AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T - 3 &#39;; F - FITC - DT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotide 3. Tetramethylrhodamine - DT - R, 5&#39; - GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC - 3 &#39;T4 DNA ligase와 함께 현장의 결합 신호에의 향상을 위해 무딘 엔드 rhodamine - 라벨이 머리핀 </li><li> 우두 DNA topoisomerase L (VACC TOPO) - 3,000 U / μL (생생한 기술). 초기 실험에서 우리는 반응 믹스의 모든 25 μL 당 VACC TOPO의 215 pmoles (7.1 μg)를 사용합니다. 그러나, topoisomerase 농도는 상당히 감성의 손실없이 줄일 수 있습니다. 우리는 나중에 유사한 결과를 섹션당 VACC TOPO (섹션당 반응 믹스 25 μL의 1.76 μg)의 4 배 낮은 금액을 사용합니다. 880 NG (반응 믹스 25 μL)로 효소의 양을 줄이는 것은 약한 신호와 VACC TOPO의 8.8 NG 결과는 감지 신호를 생산하지 않습니다. </li><li> T4 DNA ligase 5 U / μL (Roche는). 이 고도로 집중 ligase 준비 우리가 실험 조건에서 최고의 신호를 제공합니다. </lI&gt; <li> T4 DNA ligase 10 X 반응 버퍼 : 660 MM 트리스 - HCL, 50 MM MgCl 2, 10 MM의 dithioerythritol, 10 MM ATP, 산도 7.5 (20 ° C) (Roche는). 반응 버퍼 ATP는 쉽게 해동 - 냉동의 반복 사이클에서 파괴됩니다. 나누어지는는 다음 위치에서 작은 15-20 μL 부분과 저장소에있는 버퍼 - 20 ° C. 한번 사용합니다. </li><li> bidistilled 물에 PEG - 8000 (시그마)의 30 % (W / V)이 솔루션입니다. 15% 반응 믹스에서 PEG - 8000 강력하게 볼륨 제외하여 성분의 효과적인 농도를 증가, 검색을 자극. </li><li> 증류수의 Proteinase K (Roche는) 20 밀리그램 / ML 재고 솔루션입니다. 에 저장 - 주식에서 준비 PBS의 반응을 사용 50mg/mL 솔루션, 20 ° C.. 재사용하지 마십시오. </li><li> DAPI (벡터 연구소)와 Vectashield. </li><li> 나트륨 중탄산염 버퍼 : 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH를 8.2. </li><li> 22x22mm 또는 22x40mm 유리 또는 플라스틱 coverslips. 플라스틱 coverslips들은 같은 반응 동안 좋습니다 아르섹션에서 제거할 쉽게 다시. </li></ol>

dna 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

자연스럽게 발생하는 생체 분자 기계는 모든 살아있는 세포에서 작업과 디자인 1-6 다양한 표시됩니다. 그러나 방향 운동, 즉 분자 모터 수있는 장치에 대한, 그들의 스케일 다운 기계 부품 (바퀴, axels, 펜던트 등) 7-9에서 인공 분자 기계 센터의 개발. 이것은 관성과 운동량 보존 이러한 장치에 대한 필수적인 물리적 속성, nanoworld 환경 10 사용할 수없는 경우에도 매크로 시스템을 imitates. 기계 macromachines 계획에 따라 생물 학적 분자의 진화에 개발한 메커니즘을 사용하지 않는 대체 디자인, nanoworld의 특정 조건을 활용할 수 있습니다. 게다가, 나노 디자인의 목적을 위해 실제 생물 학적 분자를 채택하면 나노 제품 포즈 수있는 잠재적인 위험을 줄여줍니다. 여기는, 하나의 바이오 기반 구조의 조립 및 애플 리케이션을 설명인공 구성 요소와 자연 - 발생 분자 기계를 결합하여 EMI - 인공 분자 장치. 보기의 enzymology 지점에서, 우리의 구조는 디자이너 형광 효소 - 기질 복합 특정 유용한 기능을 수행하기 위해 함께 들어가게된다. 그 하나의 12가 들어 있으므로이 어셈블리는 정의에 의해 분자 기계입니다. 그러나, 설계 부분와의 통합 - 형광 듀얼 머리 핀의 자형 - DNA 손상 12 라벨링의 새로운 작업에 다시 번 지휘하고 있습니다. 우리의 구조는 32 메르 DNA와 효소 우두 topoisomerase I (VACC TOPO)의 밖으로 조립. 기계 후 두 찬란 표시 검출기 단위 (그림 1)를 조작하기 위해 자신의 소재를 사용합니다. 단위 중 하나는 (녹색 형광) covalently의 3&#39;end와 다른 장치 (적색 형광)에 연결된 VACC TOPO가 터미널 3&#39;OH와 함께 무료로 머리핀입니다시킵니다. 단위도 잊혀하고 신속 이후 recleaves 원래 구조로 다시 재조 립.DNA의 부재에서는 순환 방식으로 연속적으로 분리하여 religate이 두 단위 나옵니다. DNA 손상, topoisomerase 운반 검출기 단위 선택 찬란를 라벨, 5&#39;OH (DNase II 타입 나누기) 11,12과 무딘 엔드의 DNA 휴식에 부착과 조직 섹션에. T4 DNA ligase에이 솔루션 13,14에있는 경우 oligonucleotide 절단 후 형성 둘째, 효소 - 무료 머리핀은 5&#39;PO 4 무딘 엔드 휴식 (DNase I - 타입 휴식) 11,12에 ligate 것입니다. T4 DNA ligase의가 조직의 섹션 또는 5&#39;PO 4 무딘 엔드 휴식과 DNA를 포함하는 솔루션에 추가되면, ligase 준 안정 효소 - DNA의 단지를 형성, 5&#39;PO 네 DNA 종료와 함께 반응. 무딘 종료된 헤어핀 따라서 5&#39;PO 4 무딘 엔드의 DNA 나누기를 라벨, DNA에 ligase와 covalently 연결 헤어핀를 방출이 단지와 상호 작용합니다. 이 개발 일에 새로운 실용적인 접근 방식을 exemplifies전자 분자 기계의 설계 및 고정 세포 및 조직에서 apoptosis와 DNA 손상의 검출에 유용한 센서를 제공합니다.

우리는 topoisomerase 단백질에 의해 구동되는 분자 규모의 장치의 조립 및 응용 프로그램을 보여줍니다. 구조는 끝이 두 가지 다른 fluorophores을 첨부하여 조직 섹션에서 DNA 나누기의 두 가지 주요 유형의 레이블 생체 분자 센서이다.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

천연 생체 분자 기계는 모든 살아있는 세포 내에서 작동하며 다양한 설계를 보여줍니다 1-6. 그러나 인공 분자...

이 절차의 전반적인 목표는 조직 절편에서 두 가지 주요 유형의 DNA 절단을 표지하는 이중 표지 DNA 손상 센서를 조립하고 사용하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 센서는 ZI와 Rumine으로 이중 표지된 30 tumor DNA 올리고뉴클레오타이드와 자가 조립되는 효소인 vaccinia topo isomerase one(또는 vac topo)로 구성됩니다. VAC topo가 30 tumor에 결합하면 기계적 작동이 시작되며, topo가 인식 서열의 3' 말단에서 올리고뉴클레오타이드를 절단하여 vac topo 활성 fitzy 표지 단위와 amine 표지 유리 헤어핀을 생성합니다.말단 3'-하이드록시기로 인해, 이 단위들은 수명이 짧으며 빠르게 원래의 구조로 다시 조립된 후 다시 절단됩니다. 추가적인 분자 DNA 단절이 없는 경우, 이 두 단위는 주기적으로 계속해서 분리되고 결합합니다. 분자 센서를 DNA 손상이 있는 조직 절편에 적용하면, Fitz 표지 검출 단위가 5'-하이드록시기를 가진 평활 말단 DNA 단절 부위에 선택적으로 부착됩니다.R 도메인이 표지된 검출기 유닛은 5' 말단 인산화 둔탁 끝 절단 부위(five-prime phosphate blunt ended break)에 결합합니다. T4 DNA Ligase가 존재하면, 형광 현미경을 통해 세포 내 DNA1 및 DNA2 유형 DNA 절단의 존재와 분포를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. TUNEL과 같은 기존의 DSB 검출 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 특이성이 더 높으며, 세포 자율적 및 포식성 세포 사멸 단계를 모두 표지함으로써 추가적인 정보를 제공한다는 점입니다.나노기술 관점에서 이 센서는 실제 생물학적 구조와 설계를 활용하여 무독성 분자 규모의 장치를 제작하는 바이오 기반 접근 방식을 보여줍니다. 일반적으로 이 방법이 생소한 연구자는 고활성 Toro SOM 조제물을 사용하고 proteinase K에 의한 과도한 소화를 방지하기 위해 절편을 적절히 처리해야 하는 점 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 위한 조직 절편은 분자 장치를 조립하기 전에 준비해야 합니다. paraldehyde로 고정한 조직에서 5~6 µm 두께의 절편을 제작합니다.파라핀 고정 조직 블록 사용을 권장합니다. 조직 절편이 놓인 슬라이드를 슬라이드 랙에 넣고 15분 동안 자일렌에서 왁스를 제거합니다. 15분 후, 새로운 자일렌 조에 옮겨 5분 동안 더 처리합니다.슬라이드를 다음의 단계별 에탄올 농도에 통과시켜 절편을 재수화합니다. 96% ethanol에서 5분씩 2회 처리합니다. 80% ethanol에서 5분간 처리한 후, 물로 세척합니다.각 5분씩 두 번 수행합니다. 재수화 후 proteinase K로 절편을 처리합니다. 절편당 50 µg/mL 용액 100 µL를 사용하여 습윤 챔버 내의 상온에서 15분 동안 배양합니다. 조직 유형에 따라 처리 시간을 조정해야 할 수도 있으나, 과도한 처리는 신호 소실 및 절편 훼손을 유발하므로 처리가 완료되면 주의하여 중단하십시오.슬라이드를 증류수로 10분씩 2회 헹굽니다. 프리 블로킹을 위해 2% BSA를 도포하고 가습 챔버 내 실온에서 15분간 배양합니다. 이 시간 동안, 비디오의 다음 장면에 나오는 것과 같이 분자 기계를 조립합니다.분자 기계 조립을 위한 모든 시약은 평균 크기의 조직 절편에서 1회 검출하기에 충분한 총 부피 25 microliters에 맞춰 설정되었습니다. 필요에 따라 작은 플라스틱 튜브에서 부피를 늘릴 수 있습니다. 증류수를 사용하여 다음 시약들을 순서대로 혼합하십시오.15% polyethylene glycol 8,000, T4 DNA Ligase 버퍼, 이중 표지 올리고뉴클레오타이드, vaccinia topoisomerase one 및 T4 DNA Ligase를 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 이 용액 내에서 분자 구조체가 거의 즉각적으로 자가 조립되며, 실온에서 즉시 사용할 수 있습니다. DNA 절단 부위 표지 절차를 시작하려면 슬라이드에서 사전 블로킹 용액을 흡입하여 제거하십시오.각 섹션에 25 µL의 전체 반응 혼합물을 도포합니다. 섹션 위에 플라스틱 커버 슬립을 덮고 슬라이드를 가습 챔버에 넣습니다. 챔버를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호한 후, 실온에서 1시간 동안 배양합니다.1시간의 배양 후에 ligase와 topo 신호가 모두 관찰될 수 있지만, 많은 경우 ligase 신호를 더욱 강화할 수 있습니다. 신호를 강화하려면 vac topo와 oligonucleotide one을 제외하고 oligonucleotide three와 T four DNA Ligase가 포함된 반응 혼합물을 다시 처리한 후, 절편 위에 플라스틱 커버슬립을 덮고 습윤 챔버에서 18시간 동안 배양하십시오. 다음 날 상온에서 슬라이드를 상온의 물이 담긴 coplan jar에 수직으로 조심스럽게 담가 커버슬립을 제거하십시오.그런 다음 절편을 증류수로 10분씩 3회 세척합니다. 중탄산나트륨 완충액으로 절편을 헹굽니다. 이 알칼리성 용액 헹굼 단계는 pH에 민감하며 pH 7 미만에서 현저히 감소하는 fitzy 형광을 강화합니다.마지막으로, 대조군을 위한 DPI가 포함된 항퇴색 용액으로 절편을 덮고 핵을 염색한 후 커버슬립을 덮습니다. 이제 절편은 형광 현미경 관찰 준비가 되었습니다. 이 그림은 덱사메타손을 처리한 흉선 조직 절편으로, 분자 기계가 세포 사멸이 진행 중인 흉선 피질 영역에서 DNA 1 및 DNA 2 유형의 평활 말단 DNA 절단을 검출한 결과입니다. 녹색 세포질 형광은 DNA 2 유형의 절단을 나타내며, 이는 사멸하는 흉선 세포의 핵 물질을 소화하는 피질 대식세포를 표시합니다.이 신호는 vac topo에 의해 생성되며, 5' hydroxyl을 포함하는 DNA가 있는 FGA 리소좀에 국소화됩니다. 이중 가닥 절단은 DNA의 한 가지 유형의 절단을 표시하는 적색 형광으로 나타나며, 대식세포에 의해 포식되지 않은 세포사멸 흉선세포의 핵을 나타냅니다. 수많은 흉선세포가 동시에 세포사멸을 일으킵니다.리가아제 기반 표지로 시각화된 5개의 프라임 인산 이중 가닥 절단 생성과 동반됩니다. 이러한 절단은 핵 주변부에 위치하며 고리 모양의 패턴을 형성합니다. 모든 세포핵은 dpi 대조 염색을 통해 파란색으로 시각화되었습니다.이 절차를 수행할 때, 서로 다른 용액을 추가하는 사이에 절편이 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 또한, 모든 효소 조제물은 절편에 추가하기 전까지 얼음 위에 보관하고, 형광 프로브는 라벨링 반응 및 현상 과정 동안 빛으로부터 보호하십시오. 이 기술을 통해 헤테로 세포 분해의 모든 단계를 시각화할 수 있었습니다.이 센서 자체는 나노 크기의 입자, 프로브 및 기계 설계에 있어 그린 나노테크(green nanotech) 접근 방식의 한 예를 보여줍니다. 이 접근 방식은 인공 구성 요소와 자연적으로 발생하는 분자 기계 부품을 결합합니다. 그 목적은 이러한 고분산 나노 물질의 독성과 부정적인 생물학적 반응성을 제거하는 것입니다.

in-vitro-assembly-semi-artificial-molecular-machine-its-use-for

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 박테리오 파지 복제 시스템의 단백질에 의해 매개 개인의 DNA 분자의 실시간 복제를 관찰하는 방법을 설명합니다.

효소 복제 DNA의 직접 관찰 어세을 스트레칭 단일 분자 DNA를 사용하여

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

이 방법론은 나노 입자가 있는 상태에서 DNA 복제 역학의 변화를 분석하는 데 도움이 됩니다. 관심 물질의 세포독성 수준에 따라 다양한 방법론을 채택할 수 있습니다. 또한, DNA 섬유 분석에 도움을 주기 위해 이미지 분석에 대한 설명이 제공된다.

나노 입자에 의해 유도 된 DNA 손상 및 복구 역학을 조사하기위한 DNA 섬유 분석의 시연

다음 프로토콜은 세포주기 동기화 후 RPA2 면역형광 염색을 사용하여 세포주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소를 검출하는 방법을 제시합니다.

세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

당사는 광학 트랩에 고정된 선형 DNA 분자에서 형광 라벨링되고 완전히 재구성된 Cdc45/Mcm2-7/GINS(CMG) 헬리카제의 움직임을 직접 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다.

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

배우세요 DNA 손상 감지를 위한 세미인공 분자 기계 조립 및 활용 방법을. 백신아토포아이소머라제를 이용한 이중 표지 센서로 조직 섹션의 DNA 절단을 시각화하고 암 연구에 활용할 수 있습니다.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

더 많은 동영상 탐색