Name: CYP2D6 동물 모델 : 마우스에 면역 간염을 유발하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 CYP2D6 아데노바이러스를 이용한 마우스 자가면역 간염 모델 개발 방법을. 이 기법은 만성 간 염증과 면역 반응을 연구하여 인간 질병 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 괴테 대학 병원 프랑 크푸르트와 UC에 대한 독일 연구 재단의 교부금에 의해 지원됩니다

<ol><li>Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of autoimmune hepatitis.</a> Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).</li>
<li>Czaja, A. J., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+Diagnosis%2C+Pathogenesis+and+Management+of+Autoimmune+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis.</a> Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">New animal models for autoimmune hepatitis.</a> Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).</li>
<li>Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Animal models for autoimmune hepatitis.</a> Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of autoimmune hepatitis.</a> Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Holdener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+to+the+natural+human+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+by+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection.</a> J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).</li>
<li>Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKM-1+autoantibodies+recognize+a+short+linear+sequence+in+P450IID6%2C+a+cytochrome+P-450+monooxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase.</a> J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).</li>
<li>Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+human+cytochrome+P-450db1+in+autoimmune+hepatitis+type+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).</li>
<li>von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+and+autoimmunity%3A+making+the+barren+field+fertile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile.</a> Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Forbes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morbidity+and+mortality+rates+associated+with+serial+bleeding+from+the+superficial+temporal+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).</li>
<li>Ehser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+rather+than+identity+beaks+T+cell+tolerance+in+the+CYP2D6+mouse+model+for+human+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+of+the+anti-CYP2D6+antibody+response+in+patients+with+autoimmune+hepatitis+and+in+the+CYP2D6+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model.</a> J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Ando, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cytotoxic+T+lymphocytes+are+directly+cytopathic+for+their+target+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo.</a> J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).</li>
<li>Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+regulation+of+autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis.</a> Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).</li>
<li>Limmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+induce+organ-specific+autoimmunity+by+breaking+of+tolerance%3A+importance+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment.</a> Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).</li>
<li>Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break+of+T+cell+ignorance+to+a+viral+antigen+in+the+liver+induces+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis.</a> J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).</li>
<li>Derkow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+priming+of+CD8+and+CD4+T-cells+in+animal+models+of+autoimmune+hepatitis+and+cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis.</a> Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).</li>
<li>Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+type+2+autoimmune+hepatitis%3A+Xenoimmunization+with+human+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens.</a> Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).</li>
<li>Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+breaks+tolerance+for+a+neo-self+antigen+in+liver%3A+a+transgenic+murine+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis.</a> J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+triggers+for+autoimmunity%3A+is+the+%27glass+of+molecular+mimicry%27+half+full+or+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty.</a> J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).</li>
<li>Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+exhaustion+and+deletion+of+CTL+following+immunization+with+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus.</a> J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).</li>
<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이전 연구에서 실험 형 간염은 주로자가 면역 질환 간 질환에 대해서만 일시적 많은 현재의 모델은 다소 복잡한 질병 유도 프로토콜 (서평 3,5 참조)에 따라 달라집니다 것으로 보도되었다. 예를 들어, 몇몇 모델은 특정 대상 항원을 표현 형질 전환 생쥐를 사용하고 adoptively 표적 항원에 특정한, 대부분 TcR - 유전자 변형, T 세포 14,15을 양도. 종종 livertropic 바이러스, 박테리아 또는 기생충과 추가 감염 질병 16-18를 유도해야합니다. 또는 CYP2D6 19를 포함하여 대상 항원, 인코딩을 plasmids과 DNA-접종이 간염을 유발하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 IL-12과 같은 프로 염증성 크린 시토킨, 인코딩을 plasmids있는 추가 접종은 20 필요합니다. 불행하게도, 몇 가지 예외 15-20 형 간염은 일시적입니다. CYP2D6 모델 6,21는 직접적인 방법 t를 사용단순히 hCYP2D6, AIH-2 7,8의 주요 autoantigen을 표현 아데노 바이러스와 쥐를 감염에 의해 면역 간염을 유발 O. 아데노 바이러스 구조에 의한 CYP2D6의 배달 간의 직접 타겟팅을뿐만 아니라 관용의 분해를 촉진 지역 염증을 모두 보장합니다. 그것은 바이러스 titer뿐만 아니라 행정의 노선이 모두이 모델의 중요한는 것을주의하는 것이 중요합니다. 한편, 광고-2D6은, 따라서, 복제 결함 바이러스 바이러스의 충분한 높은 titer는 간장 내에서 항원의 중요한 금액을 생성하기 위해 필요합니다. 한편, 너무 높은 titer는 치명적인 급성 간경화가 발생할 수 있습니다. 또한, 그것은 아데노 바이러스의 높은 titers에 의한 생쥐의 감염이 면역 반응 22 기능적인 피로로 연결되는 이전에 입증되었습니다. 우리의 모델에서, 우리는 둘 다 만성 세포 침투뿐만 아니라 내선 번호를 얻기 위해서는 정맥 주사와 intraperitoneal 감염의 조합을 사용ensive 섬유증. 우리는 혼자 정맥 주사 감염이 여전히 심한 세포 침윤을 초래하지만, intraperitoneal 주사로 인해 해당 복막 염증을 나타내는 subcapsular 지역에 대한 섬유증은, 콜라겐의 지속적인 subcapsular 축적 (Hintermann &amp; 카누, 준비 원고)에 관여하지 있기 관찰했습니다. 그러나 우리가 광고-GFP 또는 광고 제어 23 평등 바이러스 titers으로 감염 후 간장 별 모양의 세포와 콜라겐 증착의 활성화를 검색하지 않았으므로 관찰된 간장 섬유증은 항원에 특정한된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. CYP2D6 모델과 같은 영구적인 세포 침윤과 간 섬유증 6 특징으로 만성 간염과 같은 인간의 AIH의 1,2의 여러 ​​측면을 반영합니다. 또한, 유사한 에피토프의 특이성과 AIH-2 환자에서 발견 LKM-1 항체에 13 확산과 높은 titer 안티 CYP2D6 항체의 존재는 사전을 나타냅니다일반적인 만성자가 면역 반응의 sence. CYP2D6는 AIH-2의 주요 항원 있지만 더 자주 1 형 AIH 진단을 환자가 인식되지 않습니다. 또한, 그러한 기본 담즙 간경변 (PBC) 또는 기본 sclerosing cholangitis (PSC)와 같은 면역 병인 다른 간 질환에서 고통받는 환자가 특징의 autoantibodies을 생성하는 고유한 간 autoantigens과 그들의 간을 대한 특이성과 소형을 중심으로 서로 다른 병리 학적 특징 (PBC을 보여 ) 또는 대형 (PSC) 담즙 관. 그럼에도 불구하고, CYP2D6 모델 hepatocytes의 면역 파괴를 운전하고 질병을 치료할 수 치료 개입을 평가하는 핵심 선수를 식별할 수 있도록,자가 면역 질환 간 질환 중에 발생으로 만성 간장 염증 과정에 관여 immunopathogenic 메커니즘을 분석할 수있는 기회를 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 23G 바늘 </td><td> BD Biosciences </td><td> 300,800 </td><td></td></tr><tr><td> 27 ½ G 바늘 </td><td> VWR </td><td> 612-0151 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ½ G 바늘 </td><td> BD Biosciences </td><td> 304,000 </td><td></td></tr><tr><td> 알라닌 아미노 전이 효소 테스트 스트립 (GPT / ALT) </td><td> 로슈 진단 </td><td> 10 745 138 202 </td><td></td></tr><tr><td> Aspartate 아미노 전이 효소 테스트 스트립 (알겠습니다 / 대서양 표준시) </td><td> 로슈 진단 </td><td> 10 745 120 202 </td><td></td></tr><tr><td> Anaesthesia 단위 Univentor 400 </td><td> <a href="http://www.agnthos.se" target="_blank" >AgnTho의</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 자료 금형, 일회용 37x24x10 mm의 </td><td> VWR </td><td> 720-0208 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 70mm </td><td> VWR </td><td> 734-0003 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Leica </td><td> CM1850 자외선 </td><td></td></tr><tr><td> Heparinized 모세관 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 3,123,987 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 Superfrost 플러스 슬라이드 </td><td> Menzel Gläser </td><td> J1800AMN​​Z </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer SST 튜브 </td><td> BD Biosciences </td><td> 365,951 </td><td></td></tr><tr><td> Microtiter 번호판, V-바닥 </td><td> VWR </td><td> 391-1924 </td><td></td></tr><tr><td> Reflotron 플러스 </td><td> 로슈 진단 </td><td></td><td> 혈청 대서양 표준시 / ALT의 Determiniation </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> O의 이름을 지정F 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 토끼 항 마우스 방지 콜라겐 유형 I IgG, </td><td> Chemicon </td><td> AB765P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated 염소 항 토끼 IgG </td><td> 벡터 (AXXORA) </td><td> VC-BA-1000-MC15 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-복합 백신 마우스 CD8a 항체 </td><td> 남부 생명 공학 </td><td> 1550-02 </td><td></td></tr><tr><td> PE-복합 백신 마우스 IFNγ 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 554,412 </td><td></td></tr><tr><td> PE-복합 백신 마우스 CD16/CD32 항체 (FcR 블록) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553,141 </td><td></td></tr><tr><td> Aquatex </td><td> VWR </td><td> 1.08562.0050 </td><td></td></tr><tr><td> 아비딘 / 비오틴 차단 키트 </td><td&gt; 벡터 (AXXORA) </td><td> VC-SP-2001-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> 를 Brefeldin </td><td> 시그마 </td><td> B6542 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase IV </td><td> 시그마 </td><td> C5138-100MG </td><td></td></tr><tr><td> DAB 기판 키트 3&#39;3&#39;diaminobenzidine </td><td> 벡터 (AXXORA) </td><td> VC-SK-4100-KI01 </td><td></td></tr><tr><td> DNase </td><td> 시그마 </td><td> DN-25 </td><td></td></tr><tr><td> 엘리트 ABC 시약 </td><td> 벡터 (AXXORA) </td><td> VC-PK-7100-L050 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin G / Y 솔루션 </td><td> 로스 </td><td> X883.1 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 송아지 혈청 (FCS) </td><td> Biochrom AG </td><td> S 0115 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> 메이어의 Hematoxylin 용액 </td><td> AppliChem </td><td> A4840, 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 10월 운드 </td><td> 사쿠라 Finetek 유럽 </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 버퍼 포름 알데히드 10% </td><td> 로스 </td><td> A146.3 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Amersham </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> Roti-Histokit </td><td> 로스 </td><td> 6638.1 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61,870 </td><td></td></tr><tr><td> quillaja 껍질에서 사포닌 </td><td> 시그마 </td><td> S7900 </td><td></td></tr></tbody></table>

cyp2d6 동물 모델 : 마우스에 면역 간염을 유발하는 방법

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

자가 면역 간염은 알 수없는 병인 1,2의 간을 드물지만 생명에 지장 면역 질환이다. 과거 수많은 시도에서 인간의 질병 3-5의 특성을 반영 동물 모델을 생성되었습니다. 그러나 다양한 모델로 질병의 유도 오히려 복잡했고 종종 간염 3-5에만 일시적했습니다. 따라서 트리거 6으로 제 2 형자가 면역 간염 (AIH-2), 즉 hCYP2D6에서 주요 인간 autoantigen를 사용하여 간단한 마우스 모델을 개발했습니다. hCYP2D6을 인식 1 형 간 - 신장 microsomal 항체 (LKM-1) 항체는 AIH-2 7,8의 특징입니다. wildtype FVB 또는 C57BL / 6 마​​우스에 hCYP2D6 게재가 간으로 트리거링 항원의 직접적인 전달을 보장합니다 아데노 바이러스 구조 (AD-2D6)에 의해했습니다. 따라서, 다음의 지역 염증이 autoimmunity의 후속 개발을위한 비옥한 분야 9를 생성합니다. C광고-2D6의 정맥 주사와 intraperitoneal 주사의 ombination은 간장에 대한 지속적인 면역 손상 (섹션 1) 유도하기위한 가장 효과적인 경로이다. 여기 간 질환은 CYP2D6 모델에서 유도되는 방법과 간 손상의 다양한 측면을 평가하는 방법을자가 면역 질환에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 첫째, hepatocyte 같은 aminotransferases 등의 파괴,뿐만 아니라 hCYP2D6 항체의 titers을 나타내는 마커의 혈청 수준은 혈액 retroorbitaly (섹션 2) 샘플링에 의해 결정됩니다. 둘째, hCYP2D6 특정 T 세포 반응은 비장과 간장에서 lymphocytes를 수집하는이 특징입니다. 순수 간 lymphocytes를 얻기 위해, 간은는 콜라겐으로 소화와 Percoll 기울기 (섹션 4) 위에 정화 포털 정맥 (섹션 3)를 통해 PBS에 의해 perfused됩니다. hCYP2D6 특정 T 세포의 빈도는 hCYP2D6 펩티드 및 유동세포계측법 의한 IFNγ 생산 세포 (섹션 5)의 식별과 자극에 의​​해 분석됩니다. 셋째,세포 침투와 섬유증은 간암 섹션 (섹션 6) immunohistochemistry에 의해 결정됩니다. 이러한 분석 섭생이 모델의 만성적인 성격을 증명하기 위해서는 질병의 개시 이후에 여러 번 실시되어야한다. 주파수와 활동 hCYP2D6 특정 T 및 / 또는 B 세포 및 간 손상과 섬유증의 정도 특징으로 면역 반응의 정도는 예방 지연이나 autodestructive을 폐기하기위한 가능한 치료의 후속 평가를 위해 평가되어야 간장의 과정입니다.

주요 인간 autoantigen을 표현 아데노 바이러스와 생쥐의 감염은 CYP2D6의 광범 간염, 섬유증 및 생성을 특징으로 면역 - 매개 간 질환의 영구적인 형태로 제 2 형자가 면역 간염 결과에서 고통받는 환자 세라 인정 P450 2D6 (hCYP2D6)를 시토크롬 특정 면역 반응.

CYP2D6 동물 모델 : 마우스에 면역 간염을 유발하는 방법

자가면역성 간염은 원인이 알려지지 않은, 희귀하지만 생명을 위협하는 간의 자가면역 질환입니다1,2. 그동안 이를 위해 많은 시도가 이루어져 왔습니다...

다음 실험들의 전반적인 목표는 간 인터페이스의 만성 염증, 간염, 고감마글로불린혈증 및 특징적인 자가항체 생성을 특징으로 하는 인간 자가면역성 간 질환인 자가면역성 간염의 마우스 모델을 제작하고 검증하는 것입니다. 먼저, 간 내 국소 염증을 유도하기 위해 질병 유발 자가항원 CYP 2D six를 발현하는 아데노바이러스 컨스트럭트를 동물에 감염시킵니다. 다음으로, 간 관류 및 밀도 구배 원심분리를 통해 간 림프구를 분리합니다. 최종적으로, 면역조직화학 염색과 세포 내 사이토카인 염색을 통해 각각 간 손상 정도와 자가항원 특이적 T 세포 식별 여부를 평가할 수 있습니다.기존 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 본 연구의 자가면역성 간염 모델이 제2형 자가면역성 간염 환자에게서 관찰되는 것과 거의 동일한 간의 만성 염증 및 자가 항원 특이적 면역 반응을 특징으로 한다는 점입니다. 본 모델은 자가면역성 간염 환자에서 간의 점진적인 파괴가 어떻게 유도되는가와 같이, 자가면역성 간 질환 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 일반적으로 vial 방식에서는 정맥 내 감염과 안와 정맥동을 통한 혈액 수집, 그리고 간 관류 과정에서 어려움이 있으며, portal vein을 이용한 방법은 숙련된 연습이 필요합니다.마취 후, 마우스의 뒷목을 잡고 엄지와 중지로 머리의 느슨한 피부를 당겨 고정합니다. 이때 눈 주변의 피부가 당겨지면서 안구가 약간 돌출되는 것을 확인하십시오. 이제 동물의 코와 가장 가까운 눈꺼풀 접합부의 내안각에 바늘을 놓고, 80 2D six 바이러스 용액 100 µL를 천천히 주입합니다.그 후 바늘을 약간 빼고 눈꺼풀을 닫습니다. 우선 5 mL 주사기에 차가운 PBS를 채우고 27 gauge 바늘을 주사기에 부착하는 것부터 시작하십시오. 그런 다음 마우스를 안락사시킨 후, 가위를 사용하여 동물의 뒷다리에서 약 1 cm 떨어진 지점의 피부와 근육층을 절개하며, 가위로 동물의 양측을 횡격막까지 절개해 올라갑니다.횡격막에 도달하면 피부를 뒤로 당기고 가위로 횡격막을 갈비뼈에서 분리한 후 하대정맥(vena cava)을 박리합니다. 박리 과정의 이 단계에서 위와 장을 옆으로 밀어내어 간문맥을 노출시킵니다. 간에 관류액을 주입하는 것은 이 절차에서 가장 까다로운 부분이며, 특히 간에 만성 염증이 있거나 섬유화된 경우에 더욱 그렇습니다. 마우스의 크기가 매우 작으므로 간문맥을 정확하게 천자하기 위해서는 정교한 손길이 필요합니다.또한, PBS를 천천히 주입하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 조직이 손상될 수 있습니다. 미리 준비한 바늘을 간문맥에 삽입한 다음, 주사기의 플런저를 부드럽게 눌러 PBS가 간 내의 혈액을 천천히 씻어내도록 하여 관류를 완료합니다. 핀셋으로 횡격막을 잡고 가위로 횡격막을 몸체에서 절단하여 간을 적출합니다.마지막으로, 장기를 페트리 접시에 옮기고 횡격막, 담낭 및 간에 연결되어 있는 다른 모든 조직을 제거하십시오. 자가면역성 간염이 있는 동물의 간은 섬유화되어 있으며 개별 엽들이 융합되어 있다는 점에 유의하십시오. 먼저 페트리 접시에 신선한 PPS 10 milliliters를 채운 뒤 얼음 위에 올려둡니다.관류된 간을 접시에 옮기고 가위로 조직을 작은 조각으로 자릅니다. 다음으로, 조직과 PBS를 70 µm 셀 스트레이너(cell strainer)에 붓고 유리 페스틀(pestle)을 사용하여 간 조각들을 스트레이너 너머로 밀어냅니다. 이제 조직 조각 위에 10 mL의 차가운 콜라게나아제 버퍼(collagenase buffer)를 조심스럽게 붓고, 필요에 따라 페스틀을 계속해서 사용합니다.4°C에서 30 ×g로 3분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기되, 펠릿 위에 5 mm의 액체가 남도록 합니다. 4°C에서 650 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다. 상층액의 마지막 3 mm를 제외한 나머지는 모두 제거합니다.침전물을 20 milliliters의 per call buffer에 재현탁시킨 후, 4 °C에서 600 ×g로 20분간 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 그 다음, CYP 2D6 모델의 야생형 마우스에 adenovirus 2D6를 감염시켜 지속성 자가면역성 간염이 유발된 상태에서 튜브를 가볍게 쳐서 침전물을 재현탁시킵니다. 간은 오른쪽 그림에서 관찰되는 바와 같이 뚜렷하게 변화된 형태를 보입니다. 특히, 검은색 화살촉으로 표시된 것처럼 간엽이 융합되어 있으며, 검은색 화살표로 표시된 과비대 결절이 간 전체에 흩어져 나타나고, 대조군 감염 시와 달리 광범위한 피막 섬유화가 관찰됩니다.왼쪽 그림에서 볼 수 있듯이, 인간 CYP 2D6를 발현하지 않는 아데노바이러스는 간 형태에 영향을 주지 않습니다. 아데노바이러스 2D6에 감염된 쥐의 간에서는 아데노바이러스 대조군 감염 쥐와 달리 문맥 주변 및 실질 영역에서 광범위하고 지속적인 세포 침윤이 나타납니다. 단일 검은색 화살표로 표시된 것과 같이, 아데노바이러스 2D6 감염 쥐에서만 나타나는 단핵구의 유의미한 침윤에 주목하십시오.세 개의 화살표는 인접한 문맥관을 연결하며 간 실질 내에 광범위하게 나타난 세포 침윤을 나타냅니다. 이 그림에서는 일부 콜라겐 다발이 실질로 돌출되면서, 섬유화가 주로 피막하 영역에서 어떻게 발달하는지 관찰할 수 있습니다. 세 개의 검은색 화살표가 가리키는 간 피막 아래의 다층적인 콜라겐 배치와, 단일 화살표가 가리키는 실질로 돌출된 일부 다발, 그리고 검은색 화살표 머리가 가리키는 대규모 침윤 세포 집단의 존재에 주목하십시오.adenovirus 2D6에 감염된 마우스에서 지속적인 자가면역성 간염의 세 번째 특징은 간으로 귀환하는 인간 CYP 2D6 특이적 CD4 및 CD8 T 세포가 지배적으로 생성된다는 점이며, 이는 세포 내 사이토카인 염색의 대표적인 닷 플롯(dot plot)에서 확인할 수 있습니다. 간 림프구를 면역 우세 CD4 또는 CD8 인간 CYP 2D6 펩타이드로 하룻밤 동안 자극하면 각각 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포 특이적 인터페론 감마 발현이 유도됩니다. 이 절차를 수행할 때, 말초혈액 단핵세포에 의한 간 림프구의 오염을 방지하기 위해서는 간의 최적 관류가 매우 중요한 단계임을 기억해야 합니다. 이 절차 이후에는 T 세포의 발달 후 활성 상태와 이동 잠재력을 연구하기 위해 일차 간 성상세포 분리와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 동물 모델은 자가면역성 간 질환 분야의 연구자들이 간의 만성 염증을 유발하는 핵심 요인을 탐구하고, 환자를 위한 가능한 치료법을 평가하는 길을 열어줄 것입니다.

the-cyp2d6-animal-model-how-to-induce-autoimmune-hepatitis-in-mice

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연구

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Medicine

의학

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SJL 마우스의 실험적 면역 Hypophysitis의 유도

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바이러스 항원 특이적 T 세포를 이용한 B형 간염 바이러스 복제 억제

이 비디오는 인간 면역 체계와 간 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이는 인간 간 세포와 조혈 줄기 및 전구 세포를 비장 내 주사를 통해 형질전환 면역 결핍 마우스에 이식하여 간 세포의 생착과 인간 면역 세포의 발달을 유도하는 것을 포함합니다.

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