간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서 접근법

이 절차의 전반적인 목적은 in vivo 및 in vitro에서 바이러스 조립을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 brome mosaic virus RNA를 발현시키고, 아그로 인필트레이션(agro infiltration)을 통해 이를 식물 세포에 노출시킴으로써 달성됩니다. 그 다음으로, 인필트레이션된 잎에서 BMV 비리온을 정제합니다.

그 다음으로 인비트로(in vitro) 조립을 위한 캡시드 단백질 하위 단위체를 준비합니다. 마지막으로, 캡시드 단백질과 인도시아닌 그린 염료를 사용하여 BMV Varians를 인비트로로 조립합니다. 최종적으로, 흡광도 및 형광 방출 측정을 통해 광학적 고스트(optical ghosts) 형성을 확인함으로써 인비트로로 조립된 bro mosaic varians의 결과를 보여줍니다.

오늘은 여과(filtration)라고 불리는 기술을 보여드리겠습니다. 이 기술은 식물에 바이러스 성분을 전달하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 전사체(in vitro transcripts)를 제작할 필요가 없다는 점이며, 동시에 여러 성분을 동일한 세포로 전달하여 동기화된 감염을 가능하게 한다는 것입니다. 저희가 현재 추진하고 있는 연구는 브로 모자이크 바이러스(brome mosaic virus)를 FDA 승인 발색단인 시아닌 그린(cyanine green)과 결합하여 바이오메디컬 응용을 위한 새로운 유형의 나노 입자를 제작하는 것입니다.

구체적으로 저희의 의도는 광학 와이어 고스트(optical wire ghosts) 또는 OWG라고 부르는 이러한 구조체를 형광 이미지 및 광음향 이미징을 포함한 광학 이미징 방식에 사용하고, 레이저 치료의 매개체로 활용하는 것입니다. 현재 저희가 추진하고 있는 구체적인 임상 적용 사례는 수술 중 절차와 병행하여 난소암 이미징에 이러한 구조체를 사용하는 것입니다. 그리고 이러한 구조체를 기능화할 수 있다는 것이 핵심 아이디어입니다.

난소암의 경우 특히 복강 내에 존재할 수 있는 잔존 종양 세포를 인식할 수 있는 특이적 타겟팅 모티프를 가진 OBG를 제작합니다. 이전에 준비된 brown mosaic virus RNA 1, 2 또는 3을 보유한 아그로박테리움 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 50 µg/mL의 kanamycin과 100 µg/mL의 rifampicin이 포함된 2 mL의 LB 배지에 접종합니다. 250 RPM의 궤도 쉐이커(orbital shaker)를 사용하여 28 °C에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, 500 mL 삼각 플라스크에 담긴 50 mL의 LB 배지에 1 mL의 배양액을 접종하고, 250 RPM의 궤도 쉐이커를 사용하여 28 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 배양액의 OD 600이 1.0에 도달하면, 이를 멸균된 30 mL 튜브로 옮겨 10분 동안 원심 분리합니다.

5,000 RPM 및 4°C에서 펠렛을 10 mM 염화 마그네슘 10 mL에 녹인 후, 5,000 RPM 및 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 항생제가 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 10 mM MES와 10 mM 염화 마그네슘이 포함된 버퍼 10 mL에 펠렛을 현탁합니다.

각 배양액의 OD 600을 측정하고, 10 millimolar 염화마그네슘과 10 millimolar MES를 사용하여 OD 600이 0.1이 되도록 조정합니다. 그런 다음 0.1 OD 600으로 조정된 세 가지 배양 현탁액을 각각 10 milliliters씩 혼합합니다. 최종 농도가 100 millimolar가 되도록 아세토페논을 첨가합니다.

부드럽게 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 그대로 둡니다. 배양 후, 바늘이 없는 1 mL 주사기에 배양액을 흡입합니다. 각 잎 뒷면의 절반 부분에 주사기를 부드럽게 눌러, 충분히 확장된 N hamana 잎 2~3장의 뒷면(abaxial side)으로 배양 현탁액을 침투시킵니다.

침투시킨 식물을 온실 내 24 °C에서 3~4일 동안 유지한 후 잎을 수확하십시오. BMV 비리온을 정제한 후, 1 x 바이러스 해리 완충액 1L를 준비하십시오. 다음으로 투석막을 준비하십시오.

Sambrook 등의 방법에 따라, 정제된 바이러스를 ml당 5~10 mg 농도로 투석 백에 넣고, 이 백을 1x 바이러스 해리 버퍼가 담긴 플라스크에 넣습니다. 교반하며 4 °C에서 24시간 동안 바이러스를 투석합니다.

투석백에서 용액을 수집하고 4°C에서 30,000 RPM으로 30분 동안 원심분리하여 결합되지 않은 바이러스 입자를 침전시킵니다. 상층액을 4°C에서 30,000 RPM으로 3시간 동안 원심분리합니다. 비리온으로 재조립될 RNA 전사체를 준비한 후, 캡시드 단백질 하위 단위와 RNA 전사체를 1:5 비율로 혼합합니다.

혼합물을 투석 백(dialysis bag)에 넣고 누출되지 않도록 단단히 고정합니다. 1X RNA assembly buffer 1L를 준비한 후, 재조립 반응 혼합물을 해당 버퍼 내에서 4°C로 24시간 동안 투석합니다. 다음 날, 투석 백에서 혼합물을 꺼내 RNA assembly buffer 1.5mL를 추가한 다음, 4°C에서 30,000 RPM으로 3시간 동안 다시 원심분리합니다. 그 후 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 재현탁합니다.

다음으로, OD 260 nm에서 비리온 농도를 추정합니다. 그런 다음 OD 280 nm에서 캡시드 단백질 서브유닛의 농도를 측정하거나, Bradford Assay와 같은 다른 방법을 사용하여 해리된 캡시드 단백질 서브유닛의 무결성을 결정합니다. 12~15% SDS-PAGE를 수행한 후 웨스턴 블로팅을 진행합니다. 마지막으로, 서면 프로토콜에 기술된 절차에 따라 광학 바이러스 고스트(optical viral ghosts) 또는 ov cheese를 생성합니다.

여기에 세 가지 야생형 BMV agri 컨스트럭트 혼합물을 아그로-인필트레이션(agro infiltration)한 end hamana 식물에서 정제된, 음성 염색된 BMV Varion의 투과전자현미경 이미지가 제시되어 있습니다. 이 TEM 이미지는 인도시아닌 그린(indocyanine green)을 함유한 음성 염색된 광학 바이러스 고스트(optical viral ghosts)를 보여줍니다. 여기에는 광학 바이러스 고스트의 흡광 및 형광 스펙트럼이 숙달된 후의 모습으로 제시되어 있습니다.

이 기술은 샘플당 5분 내에 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 바이러스 또는 비바이러스 성분을 캡시드 단백질 하위 단위체에 캡슐화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.