Name: 간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 학습하세요 BMV 바이러스 조립을 생체내 및 체외에서 연구하는 방법을. Agrobacterium 매개 전달과 광학 바이러스 고스트 형성을 통해 바이오의학 응용을 위한 나노입자를 제작할 수 있습니다.

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저자 agroinfiltration의 개발과 체외 조립 assays들의 소중한 제안에 대한 실험실의 몇몇 회원을 감사드립니다. 이 작품은 캘리포니아 대학에서 교부금에 의해 재정 지원되었다. 이 연구는 국립 과학 재단 (CBET-1144237)에서 교부금에 의해 부분에서 지원되었다.

1. 식물 재료 <ol><li> encapsidation 분석에 사용되는 Nicotiana benthamiana 공장은 4 잎 무대 (약 3~4주 오래된 식물)에 있어야합니다. </li></ol> 2. 기능성 바이러스성 게놈 구성 요소의 전달 및 표현이 agroinfiltration하여 세포를 심는 방법 <ol><li> 제 1 일 : Agrobacterium 변형 (예 : EH 105 또는 GV 3101) pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 BMV RNA 3 1,2를 숨겨주가 50 kanamycin의 MG / ML로 보충 LB 한천 플레이트에서 재배되는 (위해 선정 pCASS 벡터)와 rifampicin의 100mg/ml ()는 Agrobacterium을 위해 선택됩니다. 부화는 이틀 동안 28 ° C에서 실시되고있다. </li><li> 3 일 : 50 밀리그램 / kanamycin 28 1 하루 100 밀리그램 / rifampicin의 ML ° 250 rpm으로 설정 궤도 흔드는에서 C의 ML이 포함된 LB의 국물 2 ML에 LB 한천 플레이트에서 접종 단일 군락. </li><li> 4 일 : LB의 국물 보충의 50 ML의 예방에드는 50와 MG / kanamycin과 rifampicin 100 밀리그램 / ML, 10 MM MES 산도 5.6의 ML 100 MM은 28 16 시간 동안 Erlenmeyer 플라스크에 250 ML에 문화 중 하나를 ML로 acetosyringone ° 궤도 흔드는에서 C를 250 rpm으로 . </li><li> 주 5 : 4 ° C.에서 5,000 rpm으로 10 분간 참나무 능선 튜브 또는 멸균 팔콘 튜브 및 원심 분리기로 (OD 600 1.0에 도달하면) 문화를 전송 </li><li> 이 단계에게 항생제의 완전한 제거를 보장하기 위해 한 번 더 반복, 4 ° C에서 5,000 rpm으로 10 분 동안 10 밀리미터 MgCl 2, 원심 분리기 10 ML에 펠릿를 해산. </li><li> 10 밀리미터 MgCl 2와 10 밀리미터 MES (산도 5.6)가 포함된 10 ML 버퍼에 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> BMV RNA 1, 2, RNA RNA 3 각 문화에 대해 OD 600 측정 및 10 밀리미터에게 MgCl 2와 10mM MES (산도 5.6)을 사용하여 0.1 OD 600으로 조정합니다. </li><li> 한 ML 각 세 0.1 OD 600 문화 현탁액을 섞는다. </li><li> acetosyringone 100 밀리미터, 믹스 신사 추가기껏해야 3 시간 동안 실온에서 혼합물은 그대로 유지. </li><li> 한 ML에 문화 현탁액을 그립니다. 바늘없는 주사기. </li><li> 북아 일로부터 2-3 잘 확장된 나뭇잎의 abaxial 측면으로 위의 문화 서스펜션 침투 부드럽게 잎의 abaxial 표면의 절반에 주사기를 눌러 benthamiana (5 단계 잎, 3-4주 오래된 식물). </li><li> 다른 나뭇잎이 침투 절차를 반복합니다. </li><li> 24 ° C.로 녹색 집 안에 침입 식물을 유지 </li><li> 수확은 4 일 게시물 침투 (DPI)에 잎이 3 침투. </li></ol> 3. BMV의 virions의 정제 <ol><li> N.를 수집 benthamiana는 세 종류의 야생 BMV의 agrotransformants를 포함하는 혼합 가스로 agroinfiltrated 떠난다. </li><li> 0.08 M MgAc, 산도 4.5 단 사용하기 전에 추가되어야하는 β-메르 캅 토 에탄올의 1백분의 1 볼륨, BMV 추출 버퍼 (0.5 M NaAc의 동일 부피 (W / V)로 멸균 유봉과 박격포의 잎을 갈아서) 3. 바이러스 수율을 최대화하기 위해, 그것은 분쇄 간단하고 효율적인 세포 파괴를 용이하게 산성 씻은 모래 (~ 0.5-1 G)를 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 캘리코 천에로부터 2-3 레이어를 통해 잎 추출물을 필터링하고 단말마를 수집합니다. </li><li> 다시 잎 소재의 초기 무게로 BMV 추출 버퍼의 동일한 볼륨 캘리코 천에 대한 유지 부분을 갈아서. </li><li> 캘리코 헝겊을 사용하여 여과 절차를 반복합니다. 이 단계는 4 ° C.에 실시하여야한다 </li><li> 원심 튜브에 여과물 솔루션을 전송하고 정학의 색상이 밝은 녹색을 화나게 때까지 실온에서 5 분간 미리 냉장 클로로포름과 소용돌이 동등 볼륨 (또는 쉐이크)을 추가합니다. </li><li> 4에서 12,000 rpm으로 15 분간 유화 솔루션을 원심 ° C. </li><li> 수성 단계를 수집하고 잔류 클로로포름을 제거하는 마그네틱 활동가 30 분 동안 저어. </li><li> 멸균 ultracentrifuge 관에 정지를 전송합니다. </li><li&gt; 밑받침 한 ML. 쿠션 3 등 10 %의 자당 (바이러스 추출 버퍼에 준비). </li><li> 4에서 Beckman의 ultracentrifuge에서 3 시간 동안 30,000 rpm으로 원심 ° C. </li><li> 뜨는을 취소하고 (멸균 증류수 1 / 10으로 서스펜션 버퍼 묽은 BMV 추출 버퍼를 준비하는) BMV 서스펜션 버퍼의 원하는 볼륨으로 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 위의 단계에서 부분적으로 정화 virion 준비는 4 ° C.에서 28,000 rpm으로 150 분 동안 10~40%의 자당 밀도 구배 원심 분리를 받게됩니다 </li><li> 수동 또는 fractionator에 의한 바이러스 밴드를 수집합니다. 바이러스 밴드는 흰색 밝은 조명 아래에서 파란색으로 표시됩니다. </li><li> 바이러스 서스펜션 버퍼로 적어도 50 %는 바이러스 샘플을 포함 자당 솔루션을 희석. </li><li> 4에서 Beckman의 ultracentrifuge에서 30,000 rpm으로 3 시간 동안 희석 바이러스가 포함된 자당 용액을 원심 ° C. </li><li> 마지막으로 비르 중 원하는 볼륨으로 높은 정화 바이러스 펠릿을 정지우리 정학 버퍼. </li><li> OD 260에서 분광 광도계를 사용하여 virion (MG / ML)의 농도를 측정합니다. </li></ol><img alt="등식 1" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" /> 참고 : RNA 내용을 바탕으로 BMV에 대한 흡광 계수가 5 4입니다. <ol start="19"><li> TEM 밑에 보면 virions의 순도 (그림)를 확인 </li></ol> 4. 체외 조립에 대한 capsid 단백질 subunits의 작성 <ol><li> 5 1X 바이러스 분리 버퍼 (; 50 MM 트리스 HCL, pH를 7.5; 1.0 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1.0 밀리미터 DTT와 PMSF 0.5 MM 0.5 M CaCl 2) 1 리터를 준비합니다. </li><li> Sambrook 외 6에 따라 투석 막을 준비합니다. </li><li> 투석 주머니에 바이러스를 정제의 필요한 농도를 분배. </li><li> 1X 바이러스 분리 버퍼를 포함 비커에 바이러스가 포함된 투석 주머니를 놓습니다. </li><li> 4 ° C whil에서 24 시간 Dialyze전자 저어. </li><li> 4에서 15 분에 해당하는 12,000 XG에 24 시간 원심 후 투석 가방에서 솔루션을 수집 ° C. 이것은 dissociated virions에서 BMV RNA를 분리합니다. </li><li> 4 펠렛에 ° C에서 어떠한 취소 dissociated 바이러스 입자에서 3 시간 동안 Beckman의 원심 분리기에서 35,000 rpm으로 뜨는와 원심 분리기를 수집합니다. </li><li> 표면에 뜨는를 수집합니다. </li><li> 이 단계에서는 그것은 dissociated capsid 단백질 subunits로부터 오염 virion의 RNA를 제거하기 위해 필수적입니다. 이렇게하려면 8 단계에서 뜨는는 고속 원심 분리 (3 시간에서 30,000 RPM이어서 모든 RNA를 (RNA 1X 조립 버퍼에 아래 참조) 추가하지 않고 capsid 단백질 subunits의 reassembly여 야간의 또 다른 라운드를 받게됩니다 4 ° C) 펠릿 모든 조립 virions 있습니다. 이 reassembly 단계 후에 뜨는 포함 코트 단백질 subunits는 잔류 오염 RNA의 무료 것입니다. 그러나 이것을 위해, 그것은 V에 추가를 수행하는 것이 좋습니다reassembly RNA 1X 조립 버퍼를 사용하여 전용 코트 단백질 subunits로 itro. reassembly 밤이여 후 준비 (TEM을 사용하여 확인) 조립 virions 무료 여야합니다. </li><li> OD 254 및 280 nm의에서 측정하여 또는 그러한 브래드 포드 분석과 같은 다른 방법에 의한 capsid 단백질 subunits의 농도를 결정합니다. </li><li> 12~15% dissociated capsid 단백질 subunits의 무결성을 확인하는 서양 얼룩 이어 SDS-PAGE를 수행합니다. </li></ol> 5. RNA의 체외 조립에 virions를 포함하는 <ol><li> virions로 다시 조립되는 RNA의 성적 증명서를 준비하고 집중 7을 계산합니다. </li><li> capsid 단백질 subunits을 섞어서 1시 5분 (wt / wt) 5의 비율로 성적표를 알 엔. </li><li> 투석 주머니에 상기 혼합물을 분배하고 적절하게 모든 누수를 피하기 위해 확보. </li><li> 1000 ML을 준비합니다. 5 RNA 1X 조립 버퍼 (; 50 MM 트리스-HCL, pH를 7.2,, 10 MM KCl 5 밀리미터 MgCl 2, 1.0 밀리미터 DTT 50 MM NaCl)의. </li><li> 비커에 1X 조립 버퍼에 대해 반응 혼합물을 포함하는 투석 가방을 놓고 저어. </li><li> 부드럽게 저어하여 24 시간 동안 4 ° C에서 다시 조립 반응을 Dialyze. </li><li> 24 시간 이내에 투석 주머니의 혼합물을 수집하여 RNA 조립 버퍼의 1.5 ML을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 저속 (2,000 XG)에서 centrifuging하여 Centricon-100 컬럼을 통해이 혼합물을 전달합니다. </li><li> 30 분 동안 4 ° C에서 어셈블리 버퍼의 1.5 ML로 한 칼럼을 씻으십시오. </li><li> 두 번 이상 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 마지막으로, 4에서 1만그램에서 원심 분리하여 다시 조립 virions을 elute ° C를 5 분 동안. </li><li> OD 260 nm의에서 virion 농도를 예상됩니다. </li></ol> 6. 광학 바이러스성 유령의 제조 (OVGs​​) <ol><li> 원하는 농도 비율 (이 보고서에 사용된 녹색과 capsid 단백질을 Indocyanine의 중량 비율이 1시 10분이었다)에서 정화 capsid 단백질로 녹색 (ICG) 8 Indocyanine 추가<html> d는 pipetting에 의해 철저하게 섞는다. </li><li> 24 시간 동안 4 ° C에서 OVG 조립 버퍼 (1 밀리미터 DTT, pH4.8, 50 MM NaAc; 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 M NaCl)에 대한 capsid 단백질과 ICG 솔루션을 Dialyze. </li><li> 24 시간 이내에, 4에서 1 시간 동안 90,000 rpm으로 투석 가방 (12 kDa 기공 크기)와 원심 분리기에서 솔루션을 수집 ° C (그림 B) </li><li> 4 ° C.에 vortexing하거나 야간 BMV 서스펜션 버퍼에서 자체적으로 중단하도록 허용함으로써 뜨는을 제거하고 BMV 서스펜션 버퍼에 펠릿을 정지 </li><li> TEM (그림 C)에 의해 OVGs의 형태를 확인합니다. </li><li> 240 NM에서 분광 광도계 (캐리 50, Varian 주식 회사)를 사용하여 950 nm의로 흡광도를 측정, ICG의 존재는 700 nm의 및 790 nm의 팔 주위 서명 흡광 봉우리가 확인된다. (그림 D) </li><li> ~ 700 nm의와 ~ 800 nm의의 전형적인 ICG 형광 봉우리가 spectrofluorometer을 사용 OVG 솔루션의 620 나노미터 여기 (그림 D) (Fluorolog 3 Jobin-Yvon)시 볼 수 있습니다. </li></ol>_title &quot;&gt; 7. 대표자 결과 <img alt="그림" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> N.에서 정화 부정적인 스테인드 BMV의 virions의 그림 A. TEM 이미지 benthamiana 공장은 세 종류의 야생 BMV의 agroconstructs (스케일 바 = 100 nm의)의 혼합물로 agroinfiltrated. <img alt="그림 B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> 체외에서의 그림 B. 펠렛은 고속 원심 분리에 따라 함유 OVGs을 ICG 조립. <img alt="그림 C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> 부정적인 스테인드 ICG가 포함된 OVGs의 그림 C. TEM 이미지 (스케일 바 = 100 nm의). <img alt="그림 D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> OVGs의 그림 D.의 흡광도 (위쪽)과 형광 (아래) 스펙트럼. OVG 방출 w에 사용 여기 파장620 nm의 있습니다.

<ol><li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta%3A+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li>
<li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses%3A+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li>
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<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

여기에 제시된 Agroinfiltration 접근 방식은 널리 식물 바이러스의 광범위한 적용이 될 수 있습니다. 이 방법의 특징 기능은 동일한 세포 - 일반적으로 식물 바이러스의 일상적으로 사용되는 기계적인 접종과 관련된 주요 단점에 여러 agroconstruct의 전송을 동기화됩니다. 생체내과 모델로 brome의 모자이크 바이러스를 이용한 체외 조립의 연구에에 의해 효율적으로 수행할 수 다음과 같은 몇 가지 팁.은 (i) 북아 일의 성공적인 침투를 위해 benthamiana이 침투하기 전에 24 시간 동안 물, 식물, 안 떠난다; 침윤이 4-5시 사이에 수행되었다 경우 (2) Agrobacterium 서스펜션 문화는 쉽게 세포 내 공간에 확산 것이다, (3) 문화의 광학 밀도를 넘지 않아야 OD 600에서 1.0. 높은 세포 밀도 agrocultures의 침투가 심한 바이러스성 복제 및 후속 virion에 영향을 미칠 수있는 세포 독성 및 잎...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> MES의 나트륨 염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2993 </td></tr><tr><td> 녹색 Indocyanine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I2633 </td></tr><tr><td> Beckman의 ultracentrifuge </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 모델 : L8-70 </td></tr><tr><td> Centricon-100 컬럼 </td><td> Millipore </td><td> YM-100 </td></tr><tr><td> 분광 </td><td> 캐리 50, Varian 주식 회사 </td><td> 부품 번호 10068900 </td></tr><tr><td> Spectrofluorometer </td><td> Fluorolog 3 Jobin-Yvon. </td><td> 부품 번호 FL3-21 </td></tr></tbody></table>

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

인간, 동물과 식물, 자손의 encapsidation 성숙하고 안정적​​인 virions에 대한 긍정-센스 RNA의 genomes의 병원성과 바이러스에 주어진 호스트에있는 감염의 설립 중에 추기경 단계입니다. 따라서 encapsidation의 연구 노하우 전염성 virions를 형성하기 위해 바이러스 어셈블리를 조절 메커니즘에 관한 정보를 deciphers. 이러한 정보는 바이러스 확산과 질병 통제 curbing의 소설 방법을 공식화에 매우 중요합니다. 바이러스 encapsidation는 생체내 및 시험 관내에서 공부하실 수 있습니다. 생체내의 게놈 encapsidation은 macromolecular 상호 작용과 subcellular compartmentalization 관련된 고도 규제를 선별하는 과정입니다. 따라서 생체내에서 바이러스 encapsidation를 포함한 이벤트가 바이러스 분아 따위에 의해 중식 및 조립 방법을 이해하는 기초 지식을 제공하는 해부하기 위해 선도적인 연구합니다. 최근 시험 관내 encapsidation에 생물 의학 IMA의 영역에서 연구에 악용되었습니다ging 및 치료 응용 프로그램입니다. 비 싸여 식물 바이러스 부정 청구 외국 재료의 시험 관내 encapsidation에의 투자에 앞서 서다. Brome의 모자이크 바이러스 (BMV), 식물 비 싸여 복수 RNA 바이러스 병원성는 생체내 및 시험 관내의 게놈 포장을 연구를위한 모델 시스템으로 사용되었습니다. Nicotiana benthamiana 공장에서 encapsidation의 assays 들어, Agrobacterium-매개 과도 표현은, agroinfiltration처럼 보이겠 동일한 세포에 여러 구성 요소의 동기화된 전달과 표현에 대한 효율적이고 강력한 기술입니다. 이 접근법에서는 desiredviral mRNAs의 cDNAs 들고 이진 플라스미드 벡터를 나르는 Agrobacterium tumefaciens 전지의 정지 1 ML 일회용 주사기 (바늘없이)보다 더 정교한 아무것도 사용하지 세포 사이 공간 withina 잎으로 침입한다. 식물 세포로의 DNA 삽입의 전송에서 이러한 프로세스 결과, T-DNA인서트는 핵에 transiently 남아 후 호스트 중합 효소 II에 의해 베꼈는데되며, 과도 표현식로 이어지는. 결과 mRNA 성적 증명서는 (뒤덮힌 및 polyadenylated)가 번역을 위해 세포질에 수출되고 있습니다. 부화의 약 24~48시간 후 침투 나뭇잎 부분은 microscopyor 생화 학적 분석을위한 샘플 수 있습니다. Agroinfiltration 동시에 transfected되는 세포의 다수 (수백 수천까지)를 허용합니다. 시험 관내 encapsidation의 경우, BMV의 정화 virions는 원심 분리하여 RNA 및 취소 dissociated virions의 제거 다음에 분리 버퍼가 포함된 염화칼슘으로부터 dialyzing하여 capsid 단백질로 dissociated 있습니다. 게놈 소진 capsid 단백질 subunits 그런 다음 원하는 바이러스성 게놈 구성 요소 또는 염료 indocyanine 같은 비 바이러스성 구성 요소와 재조 립된다.

를 통해 식물 세포에 여러 바이러스 구성 요소의 배포를 동기화하는 간단하고 효율적이며 강력한 방법<em&gt; Agrobacterium</em&gt; - 중재 과도 표현이 설명되어 있습니다. 이러한 접근 방식은 복제를 공부를위한 의무입니다 encapsidation는 다음<em&gt; 체외에서</em&gt; reassembly 게놈에 비 바이러스 구성 요소는 생물 의학 응용에 적합한 광학 바이러스 귀신을 고갈.

인간, 동물 및 식물에 병원성을 띠는 양성 가닥 RNA 게놈 바이러스에서, 자손 바이러스가 성숙하고 안정적인 비리온으로 캡시드화되는 과정은 매우 중요한...

이 절차의 전반적인 목적은 in vivo 및 in vitro에서 바이러스 조립을 연구하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 brome mosaic virus RNA를 발현시키고, 아그로 인필트레이션(agro infiltration)을 통해 이를 식물 세포에 노출시킴으로써 달성됩니다. 그 다음으로, 인필트레이션된 잎에서 BMV 비리온을 정제합니다.그 다음으로 인비트로(in vitro) 조립을 위한 캡시드 단백질 하위 단위체를 준비합니다. 마지막으로, 캡시드 단백질과 인도시아닌 그린 염료를 사용하여 BMV Varians를 인비트로로 조립합니다. 최종적으로, 흡광도 및 형광 방출 측정을 통해 광학적 고스트(optical ghosts) 형성을 확인함으로써 인비트로로 조립된 bro mosaic varians의 결과를 보여줍니다.오늘은 여과(filtration)라고 불리는 기술을 보여드리겠습니다. 이 기술은 식물에 바이러스 성분을 전달하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 전사체(in vitro transcripts)를 제작할 필요가 없다는 점이며, 동시에 여러 성분을 동일한 세포로 전달하여 동기화된 감염을 가능하게 한다는 것입니다. 저희가 현재 추진하고 있는 연구는 브로 모자이크 바이러스(brome mosaic virus)를 FDA 승인 발색단인 시아닌 그린(cyanine green)과 결합하여 바이오메디컬 응용을 위한 새로운 유형의 나노 입자를 제작하는 것입니다.구체적으로 저희의 의도는 광학 와이어 고스트(optical wire ghosts) 또는 OWG라고 부르는 이러한 구조체를 형광 이미지 및 광음향 이미징을 포함한 광학 이미징 방식에 사용하고, 레이저 치료의 매개체로 활용하는 것입니다. 현재 저희가 추진하고 있는 구체적인 임상 적용 사례는 수술 중 절차와 병행하여 난소암 이미징에 이러한 구조체를 사용하는 것입니다. 그리고 이러한 구조체를 기능화할 수 있다는 것이 핵심 아이디어입니다.난소암의 경우 특히 복강 내에 존재할 수 있는 잔존 종양 세포를 인식할 수 있는 특이적 타겟팅 모티프를 가진 OBG를 제작합니다. 이전에 준비된 brown mosaic virus RNA 1, 2 또는 3을 보유한 아그로박테리움 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 50 µg/mL의 kanamycin과 100 µg/mL의 rifampicin이 포함된 2 mL의 LB 배지에 접종합니다. 250 RPM의 궤도 쉐이커(orbital shaker)를 사용하여 28 °C에서 하루 동안 배양합니다. 다음 날, 500 mL 삼각 플라스크에 담긴 50 mL의 LB 배지에 1 mL의 배양액을 접종하고, 250 RPM의 궤도 쉐이커를 사용하여 28 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 배양액의 OD 600이 1.0에 도달하면, 이를 멸균된 30 mL 튜브로 옮겨 10분 동안 원심 분리합니다.5,000 RPM 및 4°C에서 펠렛을 10 mM 염화 마그네슘 10 mL에 녹인 후, 5,000 RPM 및 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 항생제가 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 이 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 10 mM MES와 10 mM 염화 마그네슘이 포함된 버퍼 10 mL에 펠렛을 현탁합니다.각 배양액의 OD 600을 측정하고, 10 millimolar 염화마그네슘과 10 millimolar MES를 사용하여 OD 600이 0.1이 되도록 조정합니다. 그런 다음 0.1 OD 600으로 조정된 세 가지 배양 현탁액을 각각 10 milliliters씩 혼합합니다. 최종 농도가 100 millimolar가 되도록 아세토페논을 첨가합니다.부드럽게 혼합한 후, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 그대로 둡니다. 배양 후, 바늘이 없는 1 mL 주사기에 배양액을 흡입합니다. 각 잎 뒷면의 절반 부분에 주사기를 부드럽게 눌러, 충분히 확장된 N hamana 잎 2~3장의 뒷면(abaxial side)으로 배양 현탁액을 침투시킵니다.침투시킨 식물을 온실 내 24 °C에서 3~4일 동안 유지한 후 잎을 수확하십시오. BMV 비리온을 정제한 후, 1 x 바이러스 해리 완충액 1L를 준비하십시오. 다음으로 투석막을 준비하십시오.Sambrook 등의 방법에 따라, 정제된 바이러스를 ml당 5~10 mg 농도로 투석 백에 넣고, 이 백을 1x 바이러스 해리 버퍼가 담긴 플라스크에 넣습니다. 교반하며 4 °C에서 24시간 동안 바이러스를 투석합니다.투석백에서 용액을 수집하고 4°C에서 30,000 RPM으로 30분 동안 원심분리하여 결합되지 않은 바이러스 입자를 침전시킵니다. 상층액을 4°C에서 30,000 RPM으로 3시간 동안 원심분리합니다. 비리온으로 재조립될 RNA 전사체를 준비한 후, 캡시드 단백질 하위 단위와 RNA 전사체를 1:5 비율로 혼합합니다.혼합물을 투석 백(dialysis bag)에 넣고 누출되지 않도록 단단히 고정합니다. 1X RNA assembly buffer 1L를 준비한 후, 재조립 반응 혼합물을 해당 버퍼 내에서 4°C로 24시간 동안 투석합니다. 다음 날, 투석 백에서 혼합물을 꺼내 RNA assembly buffer 1.5mL를 추가한 다음, 4°C에서 30,000 RPM으로 3시간 동안 다시 원심분리합니다. 그 후 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 재현탁합니다.다음으로, OD 260 nm에서 비리온 농도를 추정합니다. 그런 다음 OD 280 nm에서 캡시드 단백질 서브유닛의 농도를 측정하거나, Bradford Assay와 같은 다른 방법을 사용하여 해리된 캡시드 단백질 서브유닛의 무결성을 결정합니다. 12~15% SDS-PAGE를 수행한 후 웨스턴 블로팅을 진행합니다. 마지막으로, 서면 프로토콜에 기술된 절차에 따라 광학 바이러스 고스트(optical viral ghosts) 또는 ov cheese를 생성합니다.여기에 세 가지 야생형 BMV agri 컨스트럭트 혼합물을 아그로-인필트레이션(agro infiltration)한 end hamana 식물에서 정제된, 음성 염색된 BMV Varion의 투과전자현미경 이미지가 제시되어 있습니다. 이 TEM 이미지는 인도시아닌 그린(indocyanine green)을 함유한 음성 염색된 광학 바이러스 고스트(optical viral ghosts)를 보여줍니다. 여기에는 광학 바이러스 고스트의 흡광 및 형광 스펙트럼이 숙달된 후의 모습으로 제시되어 있습니다.이 기술은 샘플당 5분 내에 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 바이러스 또는 비바이러스 성분을 캡시드 단백질 하위 단위체에 캡슐화하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

여기서는 투과 전자 현미경을 이용하여 나노미터 해상도로 액체에 바이러스 성 복합체를 이미지화하는 절차를 설명합니다.

시투에서 액체에 있는 생물학 어셈블리의 TEM

표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

이 논문은 거의 네이티브 상태의 거대분자의 고품질 현미경 이미지를 얻는 데 사용되는 초저온 전자 현미경 검사 방법론에 대해 설명합니다. 이 방법은 거대분자의 3D 재구성을 생성하기 위해 고안된 단일 입자 접근 방식을 사용하여 추가 컴퓨터 처리에 적합한 이미지를 생성합니다.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

일상적인 탐지 방법 바이러스 성 게놈 증폭을 이용 하는 비 전염 성 입자에서 전염 성 차별을 그들의 무 능력에 의해 제한 됩니다. 이 문서의 목적은 aptamer 바인딩, 동적 산란, 및 전송 전자 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 노로바이러스 입자의 차별에 도움이 다른 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 것입니다.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.

호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

여기에서는 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 스케일에서 액체-EM 및 Cryo-EM 분석에 적합한 바이러스 어셈블리를 준비하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

액체와 얼음에서 바이러스 어셈블리의 고해상도 이미징 향상

우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

학습하세요 BMV 바이러스 조립을 생체내 및 체외에서 연구하는 방법을. Agrobacterium 매개 전달과 광학 바이러스 고스트 형성을 통해 바이오의학 응용을 위한 나노입자를 제작할 수 있습니다.

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서 접근법

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