위한 실크 영화 문화 시스템 체외에서 분석 및 Biomaterial 디자인

이 절차의 전반적인 목표는 실크 필름 체외 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 이것은 먼저 원하는 필름을 만들기 위한 실크 용액을 생산함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 실크 용액을 실리콘 고무 성형 표면에 주조하고 필름을 건조시키는 것입니다.

실크 필름은 세포 배양을 위해 이후에 처리됩니다. 다음으로, 배양 시스템은 멸균 기술을 사용하여 조립됩니다. 마지막 단계는 실크 필름에 원하는 세포 유형을 파종하는 것입니다.

궁극적으로, 실크 필름 배양 표면은 배양 내에서 직접 이미지화되거나 분석될 수 있습니다. 플레이트 또는 샘플은 필요에 따라 고정 및 추가 처리를 위해 제거할 수 있습니다. 표준 조직 배양 플라스틱에서의 배양과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 실크 필름 생체 재료가 생체 적합성이 높고 연구원이 다운스트림 in vivo 및 in vitro 응용 분야로 쉽게 전송할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 세포 생물학 및 생체 재료 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있으며, 예를 들어 표면 지형을 사용하여 세포 반응에 영향을 미칠 수 있는 방법은 무엇입니까? 이 방법은 각막 상피 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 초기 체외 실험이 더 복잡한 생체 내 시스템에 대한 예비 답변을 제공할 수 있는 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 실리콘 고무 몰드 제작을 시작하려면 이 데모를 위해 주조를 위해 원하는 지형 표면을 얻습니다.

표준 100mm 에칭 실리콘 웨이퍼가 사용됩니다. PDMS 포팅 및 촉매 용액은 구매한 키트에서 제공되는 것과 같이 9:1 비율로 제공됩니다. 경화 과정을 시작하기 위해 용액을 철저히 혼합하십시오.

주조 접시 내에 실리콘 웨이퍼 표면을 배치한 후 실리콘 웨이퍼 위에 4.5g의 PDMS 용액의 무게를 잰다. PDMS 용액이 웨이퍼 위에 고르게 펴진 후 웨이퍼를 100mm 직경의 페트리 접시 뚜껑으로 덮고 10mm 수은에 2시간 동안 놓습니다. PDMS 용액에서 기포를 제거하려면 다음 날 밤새 섭씨 60도 오븐의 평평한 표면에 주조 설정을 놓고 경화된 PDMS 실리콘 웨이퍼를 100% 에탄올 수조에 넣습니다.

PDMS를 제거하기 전에 면도날을 사용하여 집게를 사용하여 둘레 가장자리를 들어 올려 웨이퍼에서 PDMS를 제거하기 시작합니다.100% 에탄올 수조 내에서 PDMS를 부드럽게 잡아당깁니다. 실리콘 고무 주조가 찢어지지 않도록 주의하면서 14mm 홀 펀치를 사용하여 개별 PDMS 금형을 펀칭합니다. 이 직경은 24웰 플레이트의 웰에 맞도록 설계되었습니다.

실크 용액을 준비하려면 증류수 2리터를 끓입니다. 유리 스피커에서 봄벡스 마오리 누에 고치 5g을 3등분하고, 누에 고치 내부 표면을 과도하게 코팅한 곤충 미립자로 인해 광범위하게 오염된 고치를 폐기합니다. 끓는 물에 탄산나트륨 4.24g을 천천히 넣어 끓는 물이 끓지 않도록 합니다.

탄산나트륨이 녹으면 끓는 물에 누에 고치 조각을 넣고 테프론 코팅된 교반 막대로 40분 동안 저어줍니다. 끓인 후 증류수를 싱크대에 조심스럽게 배출하고 실크 추출물을 손으로 짜서 여분의 물을 제거합니다. 그런 다음 실크 추출물을 증류수 1리터와 함께 플라스틱 비커에 넣고 20분 동안 저어 씻습니다.

깨끗한 물로 이 세척 과정을 두 번 반복하십시오. 씻은 실크 추출물을 손으로 링으로 감싸고 실크 섬유 추출물을 화학 후드 안에 넣어 12시간 동안 건조시킵니다. 다음날, 일반적으로 약 3.5g인 말린 실크 섬유의 무게를 잰다.

그런 다음 서면 프로토콜에 따라 실크의 20% 중량 대 부피 용액에 대해 9.3몰 리튬 브로마이드 용액을 준비합니다. 실크 추출물을 비커에 넣은 다음. 리튬 브로마이드 용액을 실크 섬유 위에 붓습니다.

실크 섬유가 용액 안에 잠겨 있는지 확인하십시오. 실험실 주걱을 사용하여 용해된 실크를 섭씨 60도의 오븐에 4시간 동안 넣습니다. 4시간 후 적절한 크기의 주사기를 사용하여 12ml의 실크 용액을 추출합니다.

18 게이지 바늘을 배치한 후. 주사기 끝에서 용액을 투석 카세트에 주입합니다. 카세트를 채운 후 비운 주사기로 카세트에서 남은 공기를 빼냅니다.

채워진 투석 카세트를 1리터의 증류수에 넣습니다. 1시간, 4시간, 8시간, 12시간마다 3회씩 총 6회 물을 갈아줍니다. 투석 후.

주사기로 카세트에서 실크 용액을 천천히 모아 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 10, 000 g 및 4 섭씨 온도에 20 분 동안 분리기 뒤에 있는 해결책을 분리하십시오. 슈퍼 나틴을 새 튜브에 넣습니다.

이 과정을 두 번째로 반복한 후 0.5 밀리리터 실크 용액 샘플 2개를 별도의 작은 유청 접시에 피펫으로 넣습니다. 유청 접시를 섭씨 60도의 건조 오븐에 12시간 동안 또는 실크 용액이 끓을 때까지 놓습니다. 벌크 실크 용액은 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

두 샘플에서 남아 있는 고체 실크 필름의 무게를 측정하여 용액의 실크 단백질 농도 밀도를 측정합니다. 투명 테이프를 사용하여 먼지를 제거하여 PDMS 주조 표면을 준비합니다. 다음으로, PDMS 기판을 100% 에탄올에 1분 동안 담가 세척합니다.

그런 다음 제거하고 말리십시오. 50마이크로미터 두께의 필름을 생산하려면 70마이크로리터의 8% 실크 용액을 PDMS 금형에 펴 바릅니다. 1밀리리터 주사기 팁과 같은 액체 살포 도구를 사용하여 90분 동안 또는 필름이 마를 때까지 150파스칼의 기류 압력을 실행하여 실크 필름이 층류 클린 벤치에서 덮이지 않은 상태로 건조되도록 합니다.

필름이 건조되면 PDMS 몰드를 포함한 전체 필름 세트를 물 및 무릎 챔버에 4시간 이상 넣어 불용성 필름을 만듭니다. 이것은 일반적으로 세면대 바닥에 물이 있는 빈 건조 챔버로, 물과 무릎 꿇은 챔버에서 실크 필름을 제거한 후 25킬로파스칼 진공 청소기로 당깁니다. 층류 클린 벤치에서 작업하여 35mm 페트리 접시에 70% 에탄올 수조를 준비합니다.

그런 다음 제어 기판과 스테인리스 스틸 링을 최소 10분 동안 접시에 넣어 살균합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 PDMS 금형에서 실크 필름을 제거합니다. 70% 에탄올에 담그고 각 필름을 1밀리리터의 70% 에탄올로 미리 채워진 24웰 플레이트의 단일 웰에 넣습니다.

세포 접착을 허용하기 위해 패턴 면이 위를 향하도록 합니다 이 단계에서 성공을 보장하려면 실크 필름을 웰 내에 정확하고 멸균적으로 배치하는 것이 중요합니다 SILT 필름 위에 스테인리스 스틸 링을 놓고 10분 동안 배양시킵니다. 텍스트의 지시에 따라 샘플 필름 세척 후, 지시에 따라 셀 라인이 안착될 수 있도록 준비합니다. 이 시연에서는 인간 각막 윤부 상피 세포주를 최종 단계로 사용하여 일반적으로 평방 센티미터당 10, 000 세포의 밀도를 사용하여 웰당 500마이크로리터의 HCLE 현탁액을 샘플링하고 원하는 실험 프로토콜을 실행합니다. 여기에 표시된 것은 HCLE 세포주의 주사 전자 현미경 사진으로, 2일차에 패턴이 있고 평평한 실크 필름에 부착되어 있습니다.

배양 HCLE에서 배양은 8일째까지 패턴화되고 평평한 표면에서 합류하기 위해 계속 증식합니다. 이곳의 배양에서 패턴이 있는 평평한 실크 필름 배양, HCLE 세포는 1일차, 4일차 및 8일차에 유리 대조 기질과 비교됩니다. SQU를 사용한 배양 정량화에서 핵산 함량 및 MTT 대사 활성 분석 데이터는 시간이 지남에 따라 유리 대조 표면과 비교할 때 패턴화된 실크 필름 기판 및 평평한 실크 필름 기판 모두에서 HCLE 생존력을 보여줍니다.

여기에 표시된 것은 패턴화된 실크 필름 표면 위로 이동하는 HCLE 세포의 타임 랩스 위상차 이미징입니다. 18 시간 동안 세포를 평방 센티미터당 10, 000 세포의 밀도에 놓고 2 시간 동안 배양한 후 평평한 대조 표면 위로 이동하는 HCLE 세포의 비교 시간 경과 위상 대조 이미징을 위해 이미징을 동일한 배양 조건에서 18 시간 동안 보여줍니다. 실크 용액과 실리콘 몰딩이 준비되면이 절차에 따라 적절하게 수행되면이 기술을 8 시간 내에 완료 할 수 있습니다.

면역형광 스캐닝, 전자 현미경 및 웨스턴 블롯 및 면역 분석과 같은 분자 생물학 기술과 같은 다른 방법과 세포 생존율, 세포 증식 및 대사 속도와 같은 화학 분석을 평가하여 이러한 다양한 맞춤형 설계 서비스에 대한 세포 반응을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실크 솔루션을 만드는 방법, 맞춤형 패턴, 실크 필름 및 문화를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기질의 모든 세포 유형.