Name: 인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: 학습하세요 인간 유두종바이러스(HPV) 특이적 T세포 클론을 분리하고 성장시키는 방법을 배우세요. 인터페론-γ 분비 기반 분석으로 항원 특이적 T세포 빈도를 측정하고 에피토프 특이적 클론을 식별하여 면역학 연구와 백신 개발에 활용하세요.

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본 연구는 American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) 및 NIH 보조금 (R01 CA143130 및 UL1RR029884)의 지원을 받아 수행되었습니다.

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

전통적으로 면역학자들은 관심 대상인 T세포를 in vitro에서 자극하고, 한계 희석 실험을 수행하여 에피토프 특이적 T세포 클론을 분리함으로써 새로운 T세포 에피토프를 특성화하려 시도했습니다. 이후 T세포 클론은 크롬 방출 분석법을 사용하여 특성화되었습니다 8,9. 하지만 T세포의 빈도가 너무 낮아 분리할 수 없었거나, 특성화를 완료하기에 충분한 T세포 클론 세포를 확보하지 못해 많은 시도가 실패로 돌아갔습니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 (1) 관심 T세포의 수가 충분한지 평가하고, (2) IFN-γ 분비를 기준으로 T세포를 선택하여 관심 T세포의 빈도를 높이며, (3) 자가 LCL을 T세포 클론 세포와 함께 파종하는 ELISPOT 분석법을 수행함으로써 적은 수의 T세포 클론 세포를 사용하여 이러한 한계점을 극복합니다. 그림 2 는 잠재적 T세포 에피토프가 존재하는 영역을 식별할 뿐만 아니라, 에피토프 특이적 T세포의 빈도를 평가하기 위해 수행된 ELISPO...

<table><tbody><tr><td>CD8 T 세포 분리 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Phytohemagglutinin</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2mg/vial</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s 배지</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>1% pooled human serum</td></tr><tr><td>96-웰 라운드 바텀 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>24-웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>인산 완충 식염수</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1차 anti-IFN-&amp;#947; 단일클론 항체 (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>비오틴 결합 anti-IFN-&amp;#947; 단일클론 항체 (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HA ELISPOT 플레이트</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>100 ml 병</td></tr><tr><td>Pooled Serum, human</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>열불활성화</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC 키트</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>안정화된 diaminobenzidine</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>AID EliSpot 리더 클래식</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 papillomavirus의 소설 t-세포 epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 immunospot 분석의 이용

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

인간 유두종 바이러스(HPV)와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체에 특이적인 희귀 T 세포를 분리하고 특성화하는 어려움을 극복하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 포함된 단계는 피험자로부터 T 세포 에피토프(epitope)를 포함하는 HPV 단백질 영역을 식별하고, 인터페론-γ(IFN-γ) 분비를 기반으로 펩타이드 특이적 T 세포를 선택하며, T 세포 클론을 배양하고 특성화하는 것입니다(Fig. 1). 피험자 1은 최근 생검을 통해 고등급 편평 상피내 병변 진단을 받았으며, T 세포를 수집한 당일에 치료를 위해 루프 전기 절제술을 받은 환자였습니다1. 중첩 합성 펩타이드를 사용하여 수행한 IFN-γ 효소 결합 면역 스팟(ELISPOT) 분석을 통해 T 세포 에피토프를 포함하는 인간 유두종 바이러스 16형(HPV 16) E6 및 E7 단백질 내 영역이 식별되었습니다(Fig. 2). 이 분석 데이터는 T 세포 에피토프를 포함하는 영역을 식별하는 것뿐만 아니라, 에피토프 특이적 T 세포의 수를 추정하고 상용 자성 비드(CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA)를 사용하여 IFN-γ 분비를 기반으로 이들을 분리하는 데 사용되었습니다. 선택된 IFN-γ 분비 T 세포는 웰당 단일 T 세포의 성장을 지원하기 위해 조사된 피더 세포 혼합물이 있는 상태에서 희석하여 단독 배양하였습니다. 이러한 T 세포 클론은 필요한 T 세포 클론 세포 수를 최소화하기 위해, 식별된 영역을 커버하는 펩타이드 및 자가 Epstein-Barr 바이러스 변형 B-림프모구 세포(LCLs, Walls 및 Crawford가 설명한 방식대로 획득)2가 있는 상태에서 IFN-γ ELISPOT 분석을 사용하여 스크리닝되었습니다. ELISPOT 분석에서 일반적으로 사용되는 웰당 1 x 105 세포1,3 대신, 1 x 105 자가 LCLs가 있는 상태에서 1,000개의 T 세포 클론 세포를 사용함으로써 필요한 T 세포 클론 세포 수를 획기적으로 줄였습니다. 자가 LCLs는 T 세포 클론 세포에 펩타이드 항원을 제시할 뿐만 아니라, 웰 내의 높은 세포 밀도를 유지하여 에피토프 특이적 T 세포 클론 세포가 IFN-γ를 분비할 수 있도록 하였습니다. 이는 IFN-γ ELISPOT 분석의 성공적인 수행을 보장합니다. 마찬가지로, IFN-γ ELISPOT 분석은 CD8 T 세포 에피토프(HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY)의 최소 및 최적 아미노산 서열과 그 HLA class I 제한 요소(B58)를 특성화하는 데 활용되었습니다. 또한 HPV 16 E6 또는 E7 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCLs를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 분석을 수행하였습니다. 결과는 E6 T 세포 에피토프가 내인성으로 처리되었음을 보여주었습니다. 다른 고위험 HPV 유형의 상동 T 세포 에피토프에 대한 교차 인식 또한 확인되었습니다. 이 방법은 CD4 T 세포 에피토프를 기술하는 데에도 사용될 수 있습니다4.

인유두종바이러스와 같이 국소 감염을 일으키는 병원체의 T세포 에피토프를 규명하는 것은 혈중 T세포 수가 제한적이기 때문에 매우 어렵습니다. 본 영상에서는 매우 적은 수의 세포로부터 희귀 T세포를 분리하고 특성을 분석하는 방법을 설명합니다.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

인간 ...와 같은 병원체에 특이적인 희귀 T 세포를 분리하고 특성을 분석하는 데 따르는 어려움을 극복하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 환자로부터 HPV 항원 특이적 T세포 클론을 분리, 배양 및 분석하는 것입니다. 먼저, CD8 T세포 라인을 구축하고 SBOT 분석을 수행하여 항원 특이적 T세포의 빈도를 추정합니다. 인터페론 감마 분비를 기반으로 항원 특이적 T세포 클론을 분리한 후, 고처리량 스크리닝 인터페론 감마 SBOT 분석을 수행하여 에피토프 특이적 T세포 클론을 식별합니다.최소 최적 펩타이드에 대한 T-세포 클론의 특성 분석을 계속합니다. 에피토프 서열은 에피토프가 내인성으로 처리되는지 여부 또한 결정합니다. HLA 제한 요소를 식별하고 다른 고위험군 HPV 유형에 대한 교차 반응성을 평가하십시오.궁극적인 목표는 환자로부터 유래한 항원 특이적 T 세포의 스크리닝 및 특성 분석을 통해 새롭고 임상적으로 유의미한 HPV T 세포 에피토프를 규명하는 것입니다. 항원 특이적 T 세포를 식별하기 위해 LY assay를 사용하는 것과 같은 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 성공 가능성이 훨씬 높다는 점입니다. 이 방법은 T 세포가 HPV의 어느 부분을 인식하는지와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. T 세포 특이성에 관한 지식을 바탕으로 백신 및 면역 치료제를 개발할 수 있으므로, 이 기술의 영향은 자궁경부암의 치료 또는 진단으로 확장됩니다.이 방법은 CD8 T 세포 에피토프에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, CD4 T 세포 에피토프와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 피험자 1로부터 확립된 CD8 T 세포주를 이용한 인터페론 감마(interferon gamma) SPO 분석 결과, HPV16 E6 46-70 영역에 T 세포 에피토프가 포함되어 있음이 확인되었습니다. 이러한 에피토프 특이적 T 세포들은 인터페론 감마 분비 여부를 기준으로 선택되었습니다. 조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포, B 림프모구 세포 및 피토헤마글루티닌을 포함하는 feeder 세포 혼합물을 complete E cells 배지에서 준비하십시오.이제 피더 세포 혼합물 내에서 분리된 에피토프 특이적 T 세포를 연속 희석하여, 멀티채널 파이펫 플레이트를 사용하여 mL당 5개의 세포 농도로 준비합니다. 희석된 에피토프 특이적 T 세포 100 µL를 96웰 라운드 바텀 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 37 °C, 5% CO2 조건에서 5일 동안 배양하며, 11일에서 14일 사이에 재조합 인간 인터루킨 2로 세포를 자극합니다.플레이트 웰 바닥에 큰 펠릿 형태로 형성된 성장 중인 T세포 클론을 시각적으로 확인하십시오. 때로는 배지가 노란색으로 변할 수 있습니다. 새로운 피더 세포 혼합물과 complete ecel 배지를 준비하여 24웰 플레이트의 각 웰에 1 mL씩 분주하십시오.성공적인 실험은 200 µL 마이크로 피펫을 사용하여 T-세포 클론을 분리하고 배양할 수 있는지 여부에 달려 있습니다. T-세포 클론을 각각 주름진 피더 세포가 있는 별도의 웰로 옮깁니다. 모든 T-세포 클론을 옮길 때까지 이 과정을 반복합니다.멸균된 sbot 플레이트의 웰에 5 $\mu\text{g/mL}$ 농도의 일차 항-인터페론 감마 단클론 항체 50 $\mu\text{L}$를 코팅합니다. 4 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 200 $\mu\text{L}$의 PBS로 3회 세척합니다.그 다음 RPMI 1640에 5% 혼합 인간 혈청을 넣은 용액 50 µL를 사용하여 비특이적 결합을 차단합니다. 큰 기포가 있을 경우 항상 멸균 바늘로 터뜨려 제거하십시오. 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 5% human serum이 포함된 50 µL의 RPMI 1640에 1×10⁵개의 자가 LCL을 첨가합니다. 1 mL 피펫을 사용하여 각 T-세포 클론의 세포를 혼합한 후, 100 µL를 멸균된 eppendorf tube로 옮깁니다. 5% pooled human serum이 포함된 500 µL의 RPMI 1640으로 희석합니다.그런 다음 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고, 상층액을 제거한 후 5% human serum이 포함된 110 µL의 RPMI 1640에 세포를 재현탁합니다. 이제 신속한 스크리닝을 위해, PHA 양성 대조군 웰과 동일한 위치에 있는 두 개의 Ellis spot plate 웰에 각각의 클론 세포 현탁액 50 µL를 분주합니다. 여러 개의 einor tube에 남은 배지를 합쳐 다음의 동일한 위치에 있는 웰들에 각각 50 µL씩 분주합니다.또한 50 µL의 배지를 사용하여 음성 대조군 웰을 준비합니다. 이제 테스트 플레이트의 양성 대조군 웰에 양성 영역에 포함된 펩타이드 50 µL를 첨가합니다. 배지만 포함된 플레이트에는 PHA 스톡 용액 10 µL와 RPMI 1640 40 µL를 첨가합니다.5% pooled human serum가 포함된 RPMI 1640 50 µL를 추가하고, Ellis spot plate를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 전체 배양 기간 동안 plate를 이동시키지 마십시오. 배지를 제거한 후, 0.05% tween 20이 포함된 PBS 200 µL로 well을 세 번 세척합니다.다음으로, biotin 결합 anti interferon gamma 단클론 항체 50 µL를 첨가하고 2시간 동안 배양합니다. 0.1% tween 20이 포함된 PBS 200 µL로 3회 세척합니다. 그 후, 갓 조제한 avidin 및 biotin 결합 horseradish peroxidase 50 µL를 첨가하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 0.1% tween 20이 포함된 PBS로 3회 세척한 후, stable 50 µL를 첨가합니다.디노 벤진(Dino benzine)을 처리하여 실온에서 5분 동안 발색시킵니다. 그 다음 탈이온수 200 µL로 3회 세척합니다. 플레이트를 완전히 건조시킵니다.자동화된 ELISPOT 리더기를 사용하여 스폿 수를 측정합니다. 에피토프 특이성 확인을 위해 T세포 클론을 선택합니다. 그 후, 에피토프 영역에 포함된 세 가지 펩타이드 각각에 대한 반응성을 확인하기 위해 10³개의 클론 T세포를 이용하여 ELISPOT 분석을 수행합니다.야생형 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCL과 HPV 16 E6 또는 E7 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCL을 준비합니다. 다시, 선택된 T 세포 클론을 대상으로 ELISpot 분석을 수행하여 야생형 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCL에 대한 반응성과 HPV 16 E6 또는 E7 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCL에 대한 반응성을 비교합니다. 먼저, 에피토프 영역을 포함하는 일련의 중첩된 9-mer 펩타이드를 사용하여 ELISpot 분석을 수행합니다.그런 다음, 다양한 길이의 펩타이드 시리즈에 대한 반응성을 확인하기 위해 LY spot assay를 수행합니다. 소수 펩타이드의 농도 범위를 설정하여 lie spot assay를 진행하십시오. 이를 통해 최소 및 최적의 아미노산 서열을 포함할 가능성이 가장 높은 조건을 찾을 수 있습니다.하나 또는 두 개의 HLA class one 분자를 공유하는 해당 인간 피험자로부터 분리된 동종 LCL을 준비합니다. 활성이 좋은 T-cell 클론을 선택합니다. 10⁵개의 동종 LCL, 10³개의 T-cell 클론 세포, 그리고 10 µM 농도의 최소 및 최적 펩타이드를 사용하여 ELISPOT 분석을 수행합니다.에피토프 특이적 T 세포 클론의 특성 분석이 완료되면, 다른 고위험군 HPV 유형에 대한 교차 반응성을 테스트할 수 있습니다. 관심 있는 선택적 클론 T 세포를 대상으로 ELISpot 분석을 수행하여, 다른 고위험군 HPV 유형의 상동 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 대한 반응성을 스크리닝하십시오. 피험자 1은 최근 생검을 통해 고등급 편평상피내병변 진단을 받은 22세 아프리카계 미국인 여성입니다.LU 전기 절제술 치료 당일, 환자로부터 T 세포를 채취하였습니다. 환자의 CD8 T 세포주에 대한 ELISPOT 분석 결과, 인터페론 감마 분비 수준이 1.2 × 10⁵로 나타나 HPV 16 E6 46-70 영역에 T 세포 에피토프가 포함되어 있음을 확인하였습니다. 선택된 세포의 1/5에 대해 한계 희석법을 수행하여 에피토프 특이적 T 세포를 선별하였습니다.262개의 T세포 클론을 수확하였습니다. T세포 클로닝의 첫 번째 시도가 성공적이었으므로, 나머지 선택된 세포들은 사용하지 않았습니다. 이들 클론 중 94개에 대해 수행한 Hiro put 스크리닝 Ellis spot 분석을 통해 62개의 스크리닝 양성 클론을 확인하였습니다.첫 번째 Ellis Spott 분석에서 펩타이드 특이적 T-세포 클론들이 확인되었으므로, 나머지 T-세포 클론들은 테스트하지 않았습니다. 잘 성장한 스크리닝 양성 클론 8종의 에피토프 특이적 성질은 해당 영역을 개별적으로 커버하는 3개의 15 MER 펩타이드를 통해 확인되었습니다.지정된 모든 T세포 클론은 HPV 16 E6 51-65 펩타이드에 양성 반응을 보였습니다. 8개 클론 중 6개는 E6 46-60 펩타이드에 양성 반응을 보였으며, E6 56-70 펩타이드에는 양성 반응을 보인 클론이 없었습니다. 여기에는 HPV 16 E6 단백질 또는 E7 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스에 감염된 자가 LCL을 이용한 ELISPOT 분석 결과가 제시되어 있습니다.이러한 결과는 T 세포 클론이 내인성으로 처리된 E6 에피토프를 인식함을 입증하며, HPV 16 46~65 영역을 커버하는 일련의 중첩된 9-MER 펩타이드들은 T 세포 에피토프의 최소 및 최적 서열의 특성 분석을 용이하게 하였습니다. 가장 우수한 반응은 E6 53~61 펩타이드에서 얻어졌으며, 중첩 펩타이드 에피토프 분석을 통해 E6 52~61 10-MER 펩타이드가 최소 및 최적 서열임을 가장 일관되게 확인하였습니다. 흥미롭게도, E6 53~61 펩타이드 또한 T 세포 클론과 동일하게 강한 반응을 보였습니다.그림 79의 용량 반응 곡선은 낮은 펩타이드 농도에서 E 6 52-61 펩타이드가 E 6 53-61 펩타이드보다 양성 반응을 훨씬 더 효과적으로 유지함을 나타냅니다. 이 예시에서는 E 6 75-83의 최소 및 최적 서열을 검출하는 것으로 확인된 피험자 A를 대상으로 CD8 T 세포 에피토프의 제한적 HLA class I 분자를 분석하였습니다. B 62 및 CW 3 분자를 발현하는 LCL에서 높은 양성 반응이 관찰됩니다. CW 3를 발현하는 LCL에서는 배경 양성 반응이 나타나는 반면, HPV 게놈의 일부 영역은 잘 보존되어 있습니다.예를 들어, 피험자 1에서 확인된 HPV 16 E6 52~61 영역의 상동 서열이 다른 13가지 고위험군 HPV 유형에서도 나타났습니다. 이와 일치하게, 13가지 고위험군 HPV 유형 중 8가지에 대해 강력한 교차 인식(cross recognition)이 입증되었습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 채혈일로부터 7주 이내에 완료할 수 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 멸균 기술을 사용해야 함을 유의하십시오.어떠한 바이러스를 다루는 작업이라도 위험할 수 있으므로, 절차를 수행하는 동안 항상 보호복 착용과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오. 이 영상을 시청하고 나면 새로운 T-cell Es를 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

use-interferon-enzyme-linked-immunospot-assay-to-characterize-novel-t

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특발성 질환에 적응 면역의 미생물 목표 식별은 효소 연결된 immunospot 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

이 동영상은 거대세포바이러스(HCMV)의 중화를 측정하기 위해 고안된 면역형광 분석을 보여줍니다. 바이러스 특이적 항체는 바이러스와 혼합되어 인간 섬유아세포 세포와 함께 배양됩니다. 항체는 바이러스를 중화하여 숙주 세포를 감염시킬 수 없게 만드는 반면, 중화되지 않은 바이러스는 세포를 감염시킵니다. 배양 후, 중화 정도는 면역형광을 사용하여 바이러스에 감염된 세포를 정량화하여 결정됩니다.

인간 거대세포바이러스의 중화를 측정하기 위한 면역형광 방법

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

이러한 단일 세포 수준에서 사이토 카인 생성을 감지하고 T 세포 반응의 양적 및 질적 인 특성을 제공하는 감마 인터페론 (IFN-γ) ELISPOT 등 기능적 분석법 비발 세대 수두 대상 포진 향한 세포 매개 성 면역 반응을 평가하기 위해 사용될 수있다 바이러스 (VZV).

제대혈 이식을 다음과 IFN-γ 평가하기 ELISPOT 분석을 수두 - 대상 포진 바이러스 - 특정 세포 성 면역의 개발

장기 배양 인터페론 γ 효소 - 결합 된 Immunospot 분석은 중앙 메모리 응답의 척도로서 사용하고 보호 항 미코 박테리아 백​​신 응답과 상관된다. 이 분석을 통해, 말초 혈액 단핵 세포는 마이코 박테리아 항원과 인터루킨 -2 14 일 동안 활성화, 분화 및 중앙 메모리 T 세포의 확장을 자극.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

여기에서는 상피내 감마 델타 T 세포의 분석을 위해 인간 상경부 내 림프구를 얻기 위한 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 자성 비드 또는 세포 분류에 의해 자궁경부 감마 델타 T 세포의 정제를 위해 확장될 수 있습니다.

인간의 자궁 경부 감마 델타 T 세포의 분리 및 유세포 분석

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

기니 돼지 PBMCs에 대 한 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과 개발 전염병 연구이 관련성이 높은 모델 T 세포 응답의 특성을 수 있습니다. 우리는 DNA 백신의 피부 전달과와 관련 된 T 세포 응답을 측정 하는 분석 결과 적용 했습니다.

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

B형 간염 바이러스(HBV)유래 펩타이드 매트릭스에 기초하여, HBV 특이적 CD4 T 세포 반응은 HBV 특이적 CD4 T 세포 에피토프의 식별과 병행하여 평가될 수 있었다.

펩타이드 매트릭스에 근거한 HLA-DR-제한 CD4 T 세포 에피토프의 HBV 특정 CD4 T 세포 반응 및 식별의 분석

이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.

생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

여기서는 항원 표시 바이러스 유사 입자(VLP)에서 중화 에피토프를 검출하는 프로토콜을 제시한다. 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-유래 VLP의 면역 침전은 단백질 G-컨쥬게이트 자기 비드에 결합된 봉투 당단백질 특이적 단일 클론 항체를 사용하여 수행된다. 포획된 VLP는 이후 바이러스 성 코어 단백질 개그 특이적 항체를 사용하는 SDS-PAGE 및 서양 블롯 분석을 받게 된다.

포획 분석기를 사용하여 바이러스와 같은 입자(VLP) 기반 백신에 표시되는 항원에서 중화에 민감한 에피토프 검출

학습하세요 인간 유두종바이러스(HPV) 특이적 T세포 클론을 분리하고 성장시키는 방법을 배우세요. 인터페론-γ 분비 기반 분석으로 항원 특이적 T세포 빈도를 측정하고 에피토프 특이적 클론을 식별하여 면역학 연구와 백신 개발에 활용하세요.

인간 Papillomavirus의 소설 T-세포 Epitopes를 특성화하기 위해 인터페론-γ 효소 연결된 Immunospot 분석의 이용

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