Name: 마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 마우스 배아 척수 전체 마운트에서 DRG 뉴런 축삭 분기를 DiI 라벨링으로 시각화하는 방법을. T형 또는 Y형 분기 패턴을 분석하여 신경 발달 및 축삭 재생 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자가 도움이 덧글에 대한 박사 알리스 테어 Garratt을 (최대 Delbrück 센터, 베를린) 감사하고 싶습니다. 이 작품은 독일 연구 협회 (DFG)의 공동 연구 센터 (SFB665)에 의해 지원되었다.

1. 해부 절차 참고 : 마우스의 실험적 사용이 공식적으로 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 지침을 승인 따라야합니다. <ol><li> 준비하기 전에, 해부 현미경을 설정하고 집게를 (내부 - 광택 조언을 두 중) 해부 크고 작은 가위, 큰 톱니 포셉, 곡선 포셉 및 뒤몽 제 5의 4 세트를 포함하여 해부에 필요한 수술 도구를하다 ( 자세한 내용은)는 특정 시약 및 장비의 테이블을 참조하십시오. 100 mm Sylgard - 코팅 배양 접시에있는 필터 종이를 놓습니다. 12 잘 판, 100 mm 페트리 접시와 12 ML 관의 우물에서 차가운 PBS를 붓고 얼음을 두십시오. 얼음 두 번째 12 잘 플레이트와 장소의 각 우물에 고정 버퍼의 피펫 2ml (PBS, pH를 7.4에서 4 % paraformaldehyde). </li><li> anesthetization 후, E12.5 (질 플러그 감지 E0.5로 지정)에 초과 임신 댐을 희생, 마우스를 장소세 종이 수건의 시트 및 70 % 에탄올로 복부 영역을 흡수에 미치는 복부 측면까지 함께. </li><li> abdominopelvic 구멍을 열고, 양국 자궁 뿔을 분리하고 차가운 PBS로 100 mm 요리 중 하나에 그들을 전송합니다. </li><li> 미세한 통제, 소형, 바로 가위로 이번에는 질 벽에의 세로 절개를하고 태반에서 각 amniotic SAC 버려야. </li><li> 벗겨내는 amniotic 각 배아에서 SAC와 탯줄은 자르고. </li><li> 작은 가위를 사용하여 배아를 참살하고 genotyping가 필요해야하는 경우 게놈 DNA의 격리를 위해 별도로 머리 또는의 일부를 넣어. 그 후, 차가운 PBS로 12 잘 판의 각 우물에 torsi을 전송. </li><li> PBS 몇 방울로 Sylgard 접시에 필터 용지를 습식 및 종이의 지느러미 측면과 배아 몸통을 위치. 더 나은 안정성을 위해, 시체에서 떨어진 꼬리와 사지를 펴. </li><li> 일하는약 16X의 확대와 해부 현미경, 신중하게 좋은 밀고 집게의 두 쌍이있는 척수 위의 배아의 피부를 꼬집어 부드럽게 그것을 갈가리 찢어. 중간에부터 꼬리 방향으로 첫째 진행 후 앞쪽에 편으로의 중간에서 다시 시작. </li><li> 건조하지 않도록 PBS의 두세 방울과 함께 수시로 배아가 젖었어. </li><li> 그것이 내부 - 광택 팁을 벌금 포셉의 날개와 수평 슬라이딩 운동에 의해 주변의 연골이 척추 칼럼에서 DRG와 척수를 분리 배아에서 제거됩니다 때 DRG를 방지하기 위해이 척수에서 출발 시끄러운 쓰레기 오토바이 경찰입니다. 배의 오른쪽 가운데에 시작, 앞쪽에 끝에 다음 꼬리쪽으로 길을 작동합니다. 그 후, 반대편에있는 절차를 반복합니다. 관련 DRG를 다 뜯어내고하지 않도록주의하십시오. </li><li> 배아에서 완전히 느슨하게 척수를 분리하려면 해당 cervic 데리러야외 미세 집게로 부분과 꼬리 끝 부분 한 조각에서 빼낸다. </li><li> 분리된 척추 고정 버퍼 가득 12 - 음 판의 우물에 첨부 DRG와 코드와 남은 배아에서 척수 코드의 준비와 진행 잠수함. </li><li> 척추 코드에게 얼음에 적어도 두 시간을 수정. </li></ol> 2. DRG의 뉴런의 DiI - 라벨링 <ol><li> 표시되는 각 척수 들어, micropipette를 끌어당기는 두 개의 유리 바늘을 준비합니다. ..., 2 열 = 600 벨 = 25 시간 = 175, 3 열 = 630, 벨 = 1 열 = 625, 벨 = 35 시간 = 175 : 우리는 셔터 모델 P - 97 전극 풀러 (프로그램 설정을 사용 30 시간 = 150). </li><li> 미세한 통제하에 3-5 시간은 에탄올에 DiI의 5 % (W / V) 솔루션의 각 유리 바늘의 끝부분을 찍어. 에탄올의 증발은 바늘에 DiI 크리스털의 얇은 레이어를 만듭니다. </li><li> 약 40x의 배율과 해부 현미경 작업, 그 V와 척수를 배치슬라이드에 entral 측면까지. 스프링 가위를 사용하여 나중에 (섹션 C를 참조) 거꾸로 개방 책 모드에서 준비 장착 있도록 floorplate을 통해 절단하여 전체 길이의 복부 측면에있는 코드를 엽니다. </li><li> 슬라이드에 지느러미 측면과 척수를 놓습니다. 그런 다음 수동으로 미세한 시각화에서 유리 바늘의 DiI 덮인 팁 및 척수의 한쪽 신중하게 피어스는 매초마다 DRG와 코드를 접근한다. DiI의 거의 흔적은 뉴런만이 소수의 라벨을 보장하기 위해 뚫었 DRG에서 볼 수 없습니다. 코드의 다른 측면에 대한 두 번째 바늘을 가져가라. 단 매초 DRG를 목표로하는 것은 개별 axons의 차별 복잡 수도 인근에서 DRG 분류 axonal 계획의 중복 방지. </li><li> 최소한 6 주위 온도에서 시간 또는 4 하룻밤 동안 짙은 어둠 속에서 고정 버퍼와 부화 척수를 반환 ° C가 디로 염색 시간을주고플라즈마 막 내의 축삭을 따라 ffuse. 척수에 부수적인 성장의 분석이 필요한 경우 긴 잠복기 (4 시에하는 데 이틀 ° C)에 대한 허용합니다. </li></ol> 3. 마운트 및 현미경 분석 <ol><li> 그 지느러미 면을 하나의 척수는 PBS의 드롭에서 coverslip에 아래 염료 확산, 위치 다음. 첨부된 DRG가 옆으로 올바르게 지향적이며, 뒤섞이다하지 않는 조심해. 초과 액체를 기음과 집게를 사용하여 거꾸로 오픈 책을 모드에서 코드를 버리고. </li><li> PBS를 사용하여 현미경 슬라이드에 대한 준비를 탑재합니다. </li><li> 분류 axonal 계획의 불필요한 배경 얼룩 형광 현미경 분석의 증가를 방지하기 위해서 마운트의 하루를 실시한다. 다음 4 어둠의 슬라이드를 유지까지 ° C. </li></ol> 4. 대표 결과 : 마우스의 척수는 수입 성의 PR를받습니다자궁 경부의 8쌍에서 ojections, 흉부의 13쌍, 60 척추 신경에 총 성례의 DRG의 요추와 4쌍 5쌍. 훈련 후에도 연결된 대부분의 DRG와 척수는 5 분 안에 배아에서 격리 수 있습니다. 이 절차는 E11.5에서 E13.5 마우스 배아에 연결된 DRG와 척수 코드의 격리에 적합합니다. 그러나, 최상의 결과는 E12.5에서 달성하고 있습니다. 여기에서 설명한 상표 절차의 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 척수의 전체 길이 이상의 DRG의 라벨은 다음 여러 척추 레벨 (그림 4)에서 axonal 분기 동작을 계량하는 데 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig1.jpg" /> 그림 1. 제도 axonal 분기의 두 주요 모드를 묘사. 여기에 표시된대로 - - (A) 분기점으로 이어질 수 성장 원추의 활동에 의해 분기뿐만 아니라 복잡한 터미널 arbors 또는축삭 샤프트에서 (B) 부수 형성 (중간 분기). 후자 모드는 6,7 대뇌 피질과 thalamocortical axons을 예상의 지배 분기 유형입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig2.jpg" /> 그림 2 배아 척수로 DRG 뉴런의 수입 성의 전망은 axonal 분기 두 가지 유형의 표시 :. 분기점에 의해 DREZ (1)에서와 중간 분기 (2)에 의해 대기 기간 후에 발생하는 딸 지점의 민간인 피해 양식에서 axons 첫번째 지점을. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig3.jpg" /> 그림 3. 배아 마우스 DRG의 신경의 단일 axonal 궤도의 시각화. (A) 첨부 DRG와 척수는 E12.5 마우스의 배아에서 준비했습니다. 증가 확대에 야생 형 생쥐의 DiI - 레이블 DRG의 (스케일 바, 1mm.) (BD) 등의 전망이 표시됩니다. B의 모든 초 DRG는 labele입니다DiI로 D. 형광 이미지가 거꾸로 있으며, 꼬리는 왼쪽에 있으며, 측면 C와 D에서 맨 아래에 있습니다. C에서 axons의 작은 번호가 표시되고 더 높은 배율에서 T와 같은 가지의 존재는 척수의 DREZ에서 확인할 수 있습니다. (스케일 바, 250 μm의 (B), 100 μm의 (C)와 50 μm의 (D).) <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig4.jpg" /> 그림 4. T - 모양의 가지, 야생 형에서 단일 주동이의 혹은 꼬리 전환 및 C - 타입 natriuretic 펩티드 (CNP) - 결함 E13.5에서 생쥐의 부량. 계산 한 axons의 숫자는 각 유전자형에 대해 서로 다른 트렁크 수준 꺾쇠 괄호로 묶어 주어집니다. C 또는 R은 - 전환 - 전용 꼬리 또는 주동이의 방향으로 성장을, 각각. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3667/3667fig5.jpg" /> 그림 5. cGMP 신호 통로는 척수의 DREZ에서 감각 축삭의 분기점을 트리거합니다. 의 (A) 제도리간드 CNP, 수용체 guanylyl cyclase Npr2와 세린 / 배아 DRG의 뉴런에서 트레오닌 키나제의 cGKIα 구성된 cGMP 신호 경로. Npr2는 CNP에 의해 자극시 GTP로부터 cGMP 생성합니다. (B) DiI 야생 유형과 CNP - 결함 생쥐의 뉴런을 DRG의 단일 axons의 추적. (스케일 바, 25 μm의.)

<ol><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dil+and+diO%3A+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).</li>
<li>Acebes, A., Ferrus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+features+of+axon+collaterals+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites.</a> Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).</li>
<li>Ozaki, S., Snider, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+trajectories+of+sensory+axons+toward+laminar+targets+in+the+developing+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord.</a> J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+guanylyl+cyclase+Npr2+is+essential+for+sensory+axon+bifurcation+within+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord.</a> J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).</li>
<li>Gibson, D. A., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+axon+branching+in+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system.</a> Development. 138 (2), 183-183 (2011).</li>
<li>O'Leary, D. D., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+axons+branch+to+multiple+subcortical+targets+by+interstitial+axon+budding%3A+implications+for+target+recognition+and+%26quot%3Bwaiting+periods%26quot%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and &quot;waiting periods&quot;.</a> Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).</li>
<li>Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).</li>
<li>Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+imaging+and+ultrastructural+analysis+of+individual+axon+terminals+labeled+by+iontophoretic+application+of+lipophilic+dye%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye.</a> J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).</li>
<li>Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+%28CNP%29+is+a+bifurcation+factor+for+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).</li>
<li>Zhao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulate+axon+branching+by+the+cyclic+GMP+pathway+via+inhibition+of+glycogen+synthase+kinase+3+in+dorsal+root+ganglion+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).</li>
<li>Zhao, Z., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axonal+development+by+natriuretic+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).</li>
<li>Schmidt, H., Rathjen, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+mechanisms+regulating+axonal+branching+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo.</a> Bioessays. , (2010).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Livet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

DiI 라벨에 대한 고정 조직의 사용과 함께 준비의 용이성과 함께 axonal 지점 형성의 두 가지 유형으로 구성된 틀에 박힌 프로젝션 패턴 분기 axonal 연구에 유리한 모델을 DRG 붙어있는 배아 척수를합니다. 코팅 유리 바늘을 사용하여 DiI 미세한의 응용 프로그램이 있습니다 - DRG 뉴런의 작은 그룹의 시각화함으로써 개별 axons과 분기 패턴의 분석 - DRG의 대량 라벨과는 달리 인치 설명한 방법은 더욱 더 분류 뉴런 8 수를 감소 lipophilic 추적의 iontophoretic 주입 향상 수 있습니다. 그러나 이것은 더 많은 시간이 걸리는 것입니다. 배아 척수 전체 마운트 준비에 하나의 axonal 궤도의 DiI 라벨은 cGMP 신호 층계를 함유 리간드 CNP 그 수용체 Npr2의 식별 수단이되었고,cGMP 의존 키나제 cGKIα - axonal 분기 한 가지 유형의 조절 : DREZ 4,5,9-12에 신경을 DRG의...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Stereomicroscope Stemi DRC </td><td> 자이스 혈구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 용액 (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L182 - 50 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 머크 </td><td> 8.18715.1000 </td><td></td></tr><tr><td> 표준 외과 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14001-13 </td><td></td></tr><tr><td> 톱니 표준 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11021-14 </td><td></td></tr><tr><td> 추가 벌금 홍채 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> 곡선 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11003-13 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 5 번 좋은 팁 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 제 5 미러 마무리 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-23 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas - 튀빙겐 봄 가위 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15008-08 </td><td></td></tr><tr><td> 필터 종이 </td><td> 피셔 과학 </td><td> FB59041 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> 세계 Precission 악기 </td><td> SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mm 배양 접시 </td><td> Greiner </td><td> 663,102 </td><td></td></tr><tr><td> 12 ML의 폴리 프로필렌 튜브 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> ECO3.1 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> 12 물론 문화 플레이트 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 35-3043 </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 머크 </td><td> 1.00983.2500 </td><td></td></tr><tr><td> / 브라운 micropipette 풀러 P - 97을 불타는 </td><td> 셔터 악기 (주) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate 유리 모세관 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 30-0066 </td><td></td></tr><tr><td> DiI는 (1,1 &#39;- Dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 3&#39; - tetramethyl - 퍼클로레이트를 indocarbocyanine) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 468,495 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 SuperFrost 플러스를 슬라이드 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> H867.1 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 커버 풀렸는데 </td><td> 칼 로스 GmbH의 </td><td> 1870.2 </td><td></td&gt; </tr></tbody></table>

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 axonal 공부 drg 뉴런의 dii - 라벨링

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

여기서 우리는 lipophilic 추적 1,1 &#39;- dioctadecyl - 3, 3,3&#39;, 퍼클로레이트 (DiI 1) 3&#39; - tetramethylindocarbocyanine를 사용하여 잘 퍼지는 얼룩하여 배아 척수로 DRG 뉴런의 작은 그룹의 탄도를 레이블에 기술을 제시 . 유전자가 변이된있는 마우스 라인의 사람과 야생 타입의 axonal 경로의 비교는 신경 시스템의 배선에 필수적인 메커니즘입니다 axonal 분기의 제어 후보 단백질의 기능 역할에 대한 테스트를하실 수 있습니다. Axonal 분기되므로 정보의 병렬 처리를위한 물리적 기초를 제공하고, 복수의 타겟과 연결하는 개별 신경 세포 수 있습니다. axonal 성장의 중간 타겟 지역에 파급 효과가 터미널 arborization 구분할 수 있습니다. 또한, axonal 지점 형성의 다른 모드는 성장 원추의 활동 (분할 또는 지연 브래지어의 여부 분기 결과에 따라 분류있을 수 있습니다nching) 또는 과정에서 축삭 축에서 민간인 피해의 신진부터 중간 분기 2 (그림 1)했다. DRG에서 뉴런의 중심 예상 axonal 분기 두 가지 유형의 연구를하는 유용한 실험 시스템을 제공합니다 : 자신의 수입 성의 axons시 10 분 13 일 (E10 - E13) 배아 일 사이에 척수의 지느러미 루트 항목 영역 (DREZ)를 도달할 때 틀에 박힌 패턴의 T 또는 Y 형 분기를 표시합니다. 두 결과의 딸 axons 다음 코드의 dorsolateral 여백에서 각각 주동이의 또는 꼬리 방향으로 진행하고 대기 기간 민간인 피해는 특정의 릴레이 뉴런에 회색 물질 (중간 분기) 및 프로젝트를 침투 이러한 줄기 axons에서 새싹 후에만 그들은 더 이상 (터미널 분기) 3 arborize 척수의 laminae. DiI의 tracings은 PR에 나타나 척수의 지느러미 루트 항목 영역에서 성장 콘 감을 잡을수있다그 분기점을 제안 분할의 ocess이 성장 원추 자체 4 (그림 2) 분할로 인해 발생하지만, 다른 옵션은 물론 5 논의되었습니다. 이 비디오는 DRG가 첨부된 떠나는 E12.5 생쥐의 척수를 해부하다하는 방법을 첫째 보여줍니다. DiI의 표본 작은 금액의 다음 고정은 모세관 튜브에서 나온 유리 바늘을 사용하여 DRG에 적용됩니다. 부화 단계 후, 표시된 척수는 형광 현미경을 사용하여 개별 axons을 분석 거꾸로 오픈 책을 준비로 마운트됩니다.

쥐 척수로 감각 afferents의 틀에 박힌 예상 단일 axons의 추적을 통해 axonal 분기를 공부하기 위해 쉽게 액세스할 실험 시스템을 제공합니다.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

본 연구에서는 ...를 이용한 확산 염색법을 통해 배아 척수로 들어가는 소수 DRG 뉴런 집단의 궤적을 표지하는 기술을 제시합니다.

이 절차의 전반적인 목적은 마우스 배아 척수의 whole mount 표본에서 DRG 뉴런의 개별 축삭 분지 패턴을 시각화하는 것입니다. 축삭 분지에 관여하는 분자를 식별하기 위해, 마우스 척수로 투사되는 DRG 뉴런의 돌출부는 축삭 분지를 연구하기 위한 단순하고 쉽고 접근 가능한 실험 시스템을 제공합니다. DRG 뉴런의 ENT 축삭이 척수의 dorsal root entry zone에 도달하면, 이들은 T자 또는 Y자 형태의 정형화된 분기 패턴을 보입니다.그 결과 생성된 두 개의 딸 축삭은 각각 척수의 등쪽 외측 가장자리에서 뇌측 또는 척수측 방향으로 진행합니다. 일정 대기 기간이 지난 후에야 이러한 줄기 축삭에서 측지 돌기가 나와 회백질로 침투하며, 말단 수지상 분기가 일어나는 척수의 특정 층에 있는 중계 뉴런으로 투사됩니다. 이 영상에서는 먼저 척수를 해부하는 방법을 보여줍니다.표본을 고정한 후, 모세관 튜브로 뽑아낸 유리 바늘을 사용하여 배아 12.5일차 마우스의 부착된 DRG에 dii의 미세 양을 도포합니다. 배양 단계를 거친 후, 표지된 척수를 역 오픈북(inverted open book) 형태로 마운트하여 형광 현미경으로 개별 축삭을 분석합니다. 축삭의 분지는 신경 연결성 발달의 중요한 측면입니다. 본 방법은 Y형 분지 패턴을 돌연변이 마우스의 패턴과 비교할 수 있게 하여, 축삭 분지를 조절하는 분자를 식별할 수 있도록 합니다.먼저, 해부 현미경을 설치하고 해부에 필요한 수술 도구들을 준비합니다. 100 mm 실크 가드 코팅 페트리 접시에 거름종이 한 장을 놓습니다. 다음으로, 12-웰 플레이트의 웰, 100 mm 페트리 접시, 12 mL 튜브에 차가운 PBS를 붓고 얼음 위에 둡니다.두 번째 12-웰 플레이트의 각 웰에 4% paraldehyde 고정 완충액 2 mL를 피펫으로 넣고 얼음에 둡니다. 마우스에서 양측 자궁각을 분리한 후, 이를 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 100 mm 디시로 옮깁니다. 배아의 머리를 제거한 후, 배아의 toci를 12-웰 플레이트로 옮깁니다.S 가드 디쉬 내의 여과지에 PBS를 몇 방울 떨어뜨려 적신 후, 안정성을 높이기 위해 배아의 몸통을 등 쪽이 위로 향하게 하여 종이 위에 배치합니다. 약 16배 배율의 해부 현미경 하에서 꼬리와 사지를 몸체에서 바깥쪽으로 펴줍니다. 미세 팁 포셉 두 쌍을 사용하여 배아의 척수 상단 피부를 중앙부터 조심스럽게 집어 올립니다.먼저 꼬리 방향으로 피부를 조심스럽게 찢은 다음, 다시 중간 부분부터 앞쪽 방향으로 찢어줍니다. 배아가 건조해지는 것을 방지하고 후근 신경절(DRG)이 척수에서 찢어지지 않도록 이따금 PBS를 두세 방울 떨어뜨려 적셔줍니다. 제거 시에는 배아 오른쪽의 중간 지점부터 시작하여 꼬리 방향으로, 그런 다음 앞쪽 끝 방향으로 진행하여 DRG와 척수를 주변 연골성 척추에서 분리함으로써 느슨해진 척수를 배아로부터 완전히 분리합니다.미세 핀셋으로 경추 부위를 집어 척수 방향으로 한 번에 끌어내십시오. 분리된 DRG 부착 척수를 고정 완충액이 채워진 12-웰 플레이트의 웰에 담그고, 나머지 배아에서도 척수 준비 과정을 계속 진행하십시오.라벨을 부착할 각 척수 조직을 얼음 위에서 최소 2시간 동안 고정하고, 현미경 제어 하에 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 니들 2개를 준비합니다. 약 40배 배율의 해부 현미경 하에서, 각 유리 니들의 팁을 에탄올에 희석한 5% 염료 용액에 3~5회 담가 니들 표면에 얇은 염료 결정층을 형성합니다. 스프링 가위를 사용하여 척수의 복측이 위로 오도록 슬라이드 위에 놓습니다.반전된 오픈 북 마운팅(inverted open book mounting)이 가능하도록 바닥판(floor plate)을 절개하여 척수의 복측을 전체 길이에 걸쳐 엽니다. 슬라이드 위에 척수의 배측이 위로 오도록 배치합니다. 그런 다음 다이아몬드 팁이 덮인 유리 바늘로 척수에 접근하여 척수 한쪽 면의 DRG를 하나 건너 하나씩 조심스럽게 뚫습니다.두 번째 바늘을 사용하여 소수의 뉴런만 표지하는 것을 보장하기 위해, 관통된 DRG에 dai의 흔적이 거의 보이지 않아야 합니다. 척수의 반대편에서도 동일하게 반복하되, 매 두 번째 DRG만을 대상으로 하여 인접한 DRG로부터 표지된 축삭 돌기의 투영이 겹쳐 개별 축삭의 구분이 어려워지는 것을 방지합니다.척수를 고정 완충액으로 다시 옮기고, 염료가 세포막 내의 축삭을 따라 확산될 수 있도록 상온에서 최소 6시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 암소에서 배양합니다. 염료 확산이 완료되면, 단일 척수를 등쪽이 아래로 향하게 하여 커버 슬립 위의 PBS 한 방울에 놓은 뒤, 과잉 액체를 흡입해 제거하고 핀셋을 사용하여 척수를 뒤집힌 펼친 책 모양(inverted open book mode)으로 평평하게 폅니다.부착된 DRG가 측면으로 올바르게 배향되었는지 확인하고 서로 섞이지 않도록 주의하십시오. 원치 않는 배경 염색의 증가를 방지하기 위해 PBS를 사용하여 표본을 현미경 슬라이드에 마운팅하십시오. 라벨링된 축삭 투사체의 형광 현미경 분석은 마운팅 당일에 수행해야 합니다. 그 전까지 슬라이드는 4°C의 암소에 보관하십시오.여기 야생형 마우스의 DRG를 Dai로 표지한 배측 뷰를 점진적인 배율 증가에 따라 매 초 설명된 대로 보여줍니다. DRG는 Dai에 의해 표지되었습니다. 여기에서 소수의 축삭들이 표지되었으며, 더 높은 배율에서 척수의 배측 뿌리 진입 구역에 T자형 분지의 존재를 확인할 수 있습니다.T자형 분지. 야생형 및 C-type natriuretic peptide CMP 결핍 마우스의 서로 다른 척수 레벨에서 단일 rostral R 또는 cordal C 회전 수를 정량화하였다. E 13.5 단계.집계된 뉴런의 총 수는 괄호 안에 표시되며, 궤적 유형의 백분율은 아래에 표시됩니다. 야생형의 DRG 뉴런 축삭과 달리, CMP 신호 전달 돌연변이에서는 척수의 등쪽 뿌리 진입 구역에서 분기하지 않고 한 방향으로만 회전합니다. 이 방법을 통해 우리는 등쪽 뿌리 진입 구역에서 감각 축삭의 분기에 필수적인 CGP 신호 전달 폭포를 확인할 수 있었습니다.cgm의 야생형과 대조적으로, P signaling 변이체에서는 축삭의 이동이 등쪽 뿌리 진입 구역에서 분기되지 않고 단 한 방향으로만 진행됩니다. 또한 이러한 연구들은 CG P signaling 변이체에서 co 형성에는 영향이 없음을 밝혔으며, 이는 DGen 뉴런에서 관찰되는 두 번째 유형의 축삭 분기가 서로 다르게 조절됨을 시사합니다.

dii-labeling-drg-neurons-to-study-axonal-branching-whole-mount

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 설치류와 다양한 연령대의 비 인간 영장류의 뇌 조각의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를, 소개하는 유전자 총을의 사용을 보여줍니다. 이 특정한 경우에, 우리는 성인 생쥐 (3-6개월 세) 및 성인 cynomologus 원숭이 (9-15년 이전)를 사용합니다. 원래 박사 Lichtman의 실험실에 의해 설명이 기술은...

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

우리는 중추 신경 시스템에 하나의 뉴런을 라벨에 대한 기술 (CNS)의...

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

여기에서는 척수의 수압압출과 동일한 설치류에서 특정 등뿌리 신경절(DRG)의 식별 및 격리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 표준 척수 분리 방법과 비교하여 이 방법은 훨씬 빠르고 조직 손상 위험을 줄입니다.

설치류의 등쪽 뿌리 신경절의 척수 및 절연의 유압 압출

이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.

성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

Electroporation 셀에 관심사의 유전자를 전달 하는 효과적인 접근 이다. 적용 하 여이 접근에서 vivo에서 성인 마우스 지 루트 신경 절 (DRG)의 신경에, 축 삭 재생 비보를 공부 하는 모델을 설명 합니다.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

여기에 제시된 것은 고품질의 등뿌리 신경절 냉동 유지 장치 절편을 지속적으로 획득하기 위한 개발입니다.

마우스 등쪽 뿌리 신경절 냉동 절제술을 위한 절차

등근 신경절(DRG)은 1차 감각 신경세포체를 포함하며 주변 감각 신호를 척수로 전달합니다. 이 프로토콜은 구조적으로 온전한 신경절의 표준화된 분리, 해부학적 분절 식별, 초보자를 위한 직관적 안내, 그리고 시술 조직 손상 감소를 지원하는 마우스 DRG 해리 방법을 설명합니다.

쥐 등근 신경절의 해리 및 분리

배우세요 마우스 배아 척수 전체 마운트에서 DRG 뉴런 축삭 분기를 DiI 라벨링으로 시각화하는 방법을. T형 또는 Y형 분기 패턴을 분석하여 신경 발달 및 축삭 재생 연구에 활용할 수 있습니다.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

더 많은 동영상 탐색