기본 인적 Keratinocytes에서 Organotypic 뗏목 문화의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 일차 각질 형성 세포(primary keratinocytes) 또는 확립된 상피 세포주로부터 장기 유사 래프트 배양물(organotypic raft cultures)을 생성하는 것입니다. 이는 먼저 섬유아세포 콜라겐 플러그(fibroblast collagen plugs)를 제작함으로써 수행됩니다. 그 다음으로, 플러그 위에 상피 세포를 층상으로 배치합니다.

그런 다음 플러그를 래프트 그리드로 옮겨 10~14일 동안 공기-액체 계면(air liquid interface) 상태로 유지합니다. 마지막 단계에서 래프트를 수확합니다. 최종적으로, 조직학적 또는 면역조직화학적 분석을 통해 상피 분화의 변화를 평가할 수 있으며, 이 방법은 상피 분화에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

또한 생애 주기의 일부로 피부 또는 점막 상피를 감염시키는 바이러스와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 실험 절차의 시연은 제 실험실의 대학원생인 Dan Anneker가 맡게 됩니다. 먼저, 유리 비커에 크롬 황산을 붓고 금속 래프트 그리드를 황산에 1시간 동안 담가둡니다.

그 다음 그리드를 수돗물로 밤새도록 계속해서 헹굽니다. 밤새 헹군 후, 이중 증류수로 3~5시간 더 헹구고 래프트 그리드를 건조시킵니다. 그런 다음 래프트의 세 면을 각각 동일한 간격으로 약 0.5cm씩 구부린 후, 래프트 그리드를 오토클레이브로 멸균합니다.

콜라겐 겔을 준비한 후, 트립신을 사용하여 두 섬유아세포를 분리하고, 배지를 이용해 트립신을 중화합니다. 섬유아세포를 50 milliliter 원심 분리 튜브에 옮기고, 세포 수를 측정하여 제작 가능한 래프트(raft)의 개수를 결정합니다. 그런 다음 실온에서 244 ×g로 4분 동안 세포를 원심 분리한 후, 섬유아세포 펠릿에서 배지를 흡입하여 제거하고, 계산된 래프트 개수에 맞는 적절한 양의 재구성 버퍼 DMEM 및 콜라겐에 세포를 재현탁합니다.

겔이 너무 빨리 응고되는 것을 방지하기 위해 콜라겐을 마지막에 첨가합니다. 콜라겐을 첨가한 후에는 겔에 기포가 유입되지 않도록 용액을 빠르고 부드럽게 섞어줍니다. 겔 혼합물이 너무 노란색을 띠면 필터 멸균된 용액을 두 방울 정도 추가합니다.

1N 수산화나트륨을 첨가합니다. 겔이 적절한 pH를 나타내는 적황색으로 변할 때까지 부드럽게 섞어줍니다. 이제 콜라겐 섬유아세포 혼합물 3mL를 6-웰 배양 접시의 각 웰 벽면을 따라 기포가 생기지 않도록 천천히 피펫팅한 후, 겔이 응고될 수 있도록 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.

겔이 굳으면, 고형화된 콜라겐 겔 상단에 EGF가 포함된 E 배지 3 mL를 첨가하고 플레이트를 다시 배양기로 옮깁니다. 저계대 각질형성세포를 약 70% 합류도까지 배양한 후, 트립신으로 각질형성세포를 처리하고, EGF가 포함된 배지로 트립신을 중화시킵니다. 세포 수를 측정하여 제작 가능한 래프트(raft)의 수를 결정합니다.

세포를 원심 분리한 후, 계산된 각 래프트 배양분당 1 mL의 EGF가 포함된 eed에 펠렛을 재현탁합니다. 이제 6웰 플레이트를 옆으로 기울여 콜라겐 겔에서 배지를 제거한 다음, 각 겔에 2 mL의 신선한 EGF 포함 eed를 추가합니다. 이어서, 각 웰에 이미 들어 있는 2 mL의 eed에 재현탁된 각질형성세포 1 mL를 조심스럽게 추가합니다.

각질형성세포와 2 mL의 배지를 조심스럽게 피펫팅하여 콜라겐 플러그 위에 한 방울씩 떨어뜨립니다. 세포가 완전히 합쳐질 때까지 37 °C 배양기에 2~4일 동안 둡니다. 배지를 교체한 후 하루가 지나 배지 색이 노란색으로 변하거나 4일째가 되면 세포가 준비된 것입니다. 멸균된 포셉을 사용하여 멸균된 금속 래프트 그리드의 측면이 아래로 향하게 하여 10 cm 디쉬에 넣습니다.

콜라겐 겔 하나에서 배지를 흡입하여 제거한 다음, 멸균 스패튤라를 겔의 가장자리를 따라 위아래로 움직여 웰의 측면에서 겔을 분리합니다. 콜라겐 플러그를 6-웰 플레이트에서 그리드로 옮기는 과정이 이 절차에서 가장 어려운 부분입니다. 플러그가 찢어지지 않도록 스패튤라를 플러그 아래로 조심스럽게 밀어 넣고, 플러그와 그리드 사이에 기포가 생기지 않도록 그리드 위에 평평하게 놓으십시오.

그 후, 스패튤라를 사용하여 이 과정 중에 접힌 부분이 있다면 매끄럽게 펴줍니다. 겔을 제거하려면 플레이트를 약간 기울인 다음, 겔 아래에 스패튤라를 넣고 들어 올립니다. 그리드와 겔 사이에 기포가 생기지 않도록 콜라겐 겔을 금속 그리드 위에 올려놓습니다.

공기-액체 계면(air liquid interface)을 형성하기 위해, 래프트 그리드가 배지에 닿되 콜라겐 겔은 닿지 않도록 EGF가 포함되지 않은 EED를 디쉬 바닥에 천천히 첨가합니다. 마지막으로 래프트를 37°C에서 배양합니다. 공기-액체 계면을 유지하며 14일 후 래프트를 회수합니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, HPV 31 불멸화 일차 인간 각질 형성 세포(Hfk 31)로 제작된 래프트는 정상 인간 피부 각질 형성 세포(Hks)로 제작된 래프트에 비해 현저히 더 두껍습니다.

따라서 HPV 단백질은 분화 중인 세포가 세포 주기 내에서 활성 상태를 유지하도록 하는 능력이 있습니다. 여기서는 HK 30 및 정상 HKS로부터 생성된 기관형 래프트 배양(organotypic raft cultures)의 횡단면에 대해 녹색으로 표시된 cytokeratin 10 또는 K 10 항체를 사용하여 면역조직화학 분석을 수행하였습니다. K 10은 화살표로 표시된 기저층에서는 발현되지 않았으며, 대신 점진적으로 분화하는 세포들로 구성된 상기저층에서만 발견되었습니다.

이 그림에서, 상피의 최상층에 국한되어 나타나는 후기 단백질인 HPV 단백질 E1, E4의 발현이 예상대로 녹색으로 표시되어 있습니다. 이전 그림과 마찬가지로, 정상 hks의 래프트 배양물에서는 염색이 관찰되지 않습니다.

화살표는 다시 한번 발달 후 상피의 기저층을 나타냅니다. 이 기술은 암 생물학 분야의 연구자들이 생체 내 상피 분화를 모방하는 시스템을 사용하여 인유두종 바이러스의 병태생리를 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 일차 각질 형성 세포 또는 확립된 상피 세포주를 사용하여 기관형 래프트 배양(organotypic raft cultures)을 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.