마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

이 절차의 전반적인 목적은 중뇌-선조체 및 선조체-흑질 경로의 발달을 연구하기 위해 도파민성 뉴런과 선조체 AAL Explan을 배양하는 것입니다. 이는 먼저 E 14.5 마우스 배아로부터 선조체와 도파민성 중뇌를 미세 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 해부한 조직에서 적절한 크기의 explan을 절단하는 것입니다.

다음으로, 외편(explan)들을 콜라겐 겔 내에서 서로 가까이 위치시킵니다. 마지막 단계는 축삭 돌출(axon outgrowth)이 일어날 수 있도록 이 외편들을 2~3일 동안 배양하는 것입니다. 최종적으로, 특정 신경 세포 마커에 대한 면역조직화학 염색을 통해 축삭의 유인 또는 반발 반응을 확인하고 정량화합니다.

해리된 또는 두 개의 DX 외식물 배양과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 콜라겐 매트릭스가 세포외 환경과 유사한 엑손을 위한 3차원 기질을 제공한다는 점입니다. 또한, 콜라겐 매트릭스는 X 외식물이나 주변에 배치된 세포에서 방출되는 단백질의 상대적으로 안정적인 구배 형성을 가능하게 합니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Ava Smith와 Francesca가 진행하겠습니다.

이 절차를 시작하려면, 모체 자궁에서 E 14.5 마우스 배아를 적출하십시오. 필요할 때까지 L 15 배지가 담긴 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 배아를 현미경으로 옮겨 배아에서 뇌를 분리하십시오.

그런 다음 각 두부 소포의 내측 부분을 따라 절개하여 두부를 제거합니다. 그 후, 뇌수막초를 제거합니다. 정중 두부 굴곡의 바로 앞쪽에서 등-배측 절개를 수행합니다.

이어서, 중뇌 굴곡부(cephalic flexor) 바로 근처에 등-배측(dorsal ventral) 절개를 한 번 더 실시합니다. 그런 다음 미세 해부용 칼을 사용하여 등쪽 정중선을 따라 횡단 절개를 가해 하부의 복측 중뇌 조직을 노출시킵니다. 복측 중뇌 조직에는 도파민성 뉴런이 포함되어 있으므로 손상되지 않도록 주의하십시오.

그 후, 등쪽 중뇌 조직을 제거하기 위해 복측 중앙선과 평행하게 외측으로 두 번의 Rost Coddle 절개를 수행합니다. 다음으로, 마이크로디섹션 나이프를 사용하여 남은 복측 중뇌 조직을 X 낱개로 분할합니다. X 분할된 조직은 사용 전까지 5% FBS가 포함된 L 15 배지 내에서 얼음 위에 보관합니다.

이제 중뇌 해부 과정에서 미리 얻어둔 발톱 머리 소포를 현미경으로 옮깁니다. 포셉을 사용하여 시상과 시상하부 사이를 절단하여 시상을 제거합니다. 그런 다음 선조체 앞쪽을 내측에서 외측으로 절단하여 후각구와 같은 앞쪽 구조물을 제거합니다.

다음으로, 선조체(striatum)에 인접한 조직에 대해 이 단계를 반복합니다. 그 후, 선조체의 관상면(coronal view)을 얻을 수 있도록 나머지 슬라이스를 배치합니다. 선조체는 조직에서 약간 더 투명한 부분으로 식별할 수 있습니다.

그 다음 선조체를 분리하고, 마이크로디섹션 나이프를 사용하여 이를 임플란트 크기로 절단합니다. 외측 및 내측 신경절 융기의 이동 뉴런이 포함되어 있어 색이 약간 더 어두운 정중선 근처의 조직은 피하십시오. 4-웰 디쉬의 웰 내 커버슬립 위에 준비된 콜라겐 한 방울을 추가합니다.

37°C 및 5% 이산화탄소 조건의 인큐베이터에서 30분 동안 유지합니다. 이 배양 과정 동안 콜라겐이 젤화됩니다. 콜라겐이 젤화된 후, 200 µL 팁이 장착된 피펫을 사용하여 도파민성 또는 염성 외식편을 콜라겐으로 옮깁니다.

그런 다음 바늘을 사용하여 외식편들을 서로 가까이 이동시킵니다. 외식편 1개의 직경 정도의 거리로 간격을 유지하십시오. 다음으로 과잉 배지를 제거합니다.

준비된 콜라겐 20 µL를 조직편(explant) 위에 추가합니다. 이 과정에서 조직편이 움직이는 경우가 많으므로, 바늘을 사용하여 조직편의 위치를 다시 조정하십시오.

콜라겐을 상온에서 15분 동안 굳힙니다. 그 다음, 5% carbon dioxide가 공급되는 37 °C 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 둡니다. 콜라겐이 완전히 굳으면, explan medium 400 µL를 첨가하고 37 °C 인큐베이터에서 2~3일 동안 배양합니다.

조직을 부드럽게 고정하기 위해, 4% 파라포름알데하이드를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 유지합니다. 1시간 후, 실온의 PBS로 15분씩 3회 세척합니다.

그 다음 PBS를 제거하고, 차단 버퍼(blocking buffer)에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 1차 항체와 차단 버퍼를 함께 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 PBS로 5회 세척하며, 각 세척 단계는 1시간 동안 수행합니다. 그 다음 적절한 형광 물질이 결합된 2차 항체로 배양합니다.

블로킹 버퍼에서 4°C로 하룻밤 동안 처리합니다. 이 단계부터는 빛 노출을 최소화하기 위해 외식물을 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 4°C의 PBS에서 하룻밤 동안 세척한 후, 다음 날 여러 번 더 세척합니다.

다음으로, 절편면이 아래를 향하도록 하여 prolonged anti fade 시약 마운팅 용액을 이용해 현미경 슬라이드 위에 외식물(explant)을 마운트합니다. 마운팅 용액 위에 커버 슬립을 매우 조심스럽게 덮어 내부에 공기가 갇히지 않도록 합니다. 그런 다음, 에피 형광 현미경(epi fluorescence microscope)을 사용하여 x개의 외식물에 대한 디지털 이미지를 획득합니다.

이 이미지들을 사용하여, 각 X explant를 4분면으로 나누어 근위 4분면과 원위 4분면을 생성합니다. 그 후, 근위 및 원위 4분면 모두에서 X explant로부터 뻗어 나온 가장 긴 neurite 20개의 길이를 측정합니다. 가장 긴 neurite 20개의 평균 길이를 사용하여 각 개별 explant의 근위 원위 비율(proximal distal ratio)을 계산합니다.

근위부-원위부 비율이 1보다 크면 축삭 유인(attraction)을 나타냅니다. 반면, 비율이 1보다 작으면 축삭 반발(repulsion)을 나타냅니다. 여기 제시된 이미지는 anti tyrosine hydroxylase 항체로 염색하여 축삭 성장을 보여주는 중뇌 절편입니다.

점선은 인접한 외식편을 나타냅니다. 화살표는 개별 신경 돌기와 성장 원추를 나타냅니다. 다음은 근위-원위 비율 정량화의 예시입니다.

이들은 동일한 크기의 4분면으로 나뉩니다. 근위부 4분면은 인접한 X 이식편을 향하며, 원위부 4분면은 그 반대 방향을 향합니다. 이 영상을 시청한 후에는 도파민성 및 층상 이식편을 공동 배양하여 meso-nigral 경로의 발달을 조사하고, 이러한 경로의 형성에 관여하는 분자적 기전을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.