마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

이 절차의 전반적인 목표는 Meso Sal 및 Sal Nigro 경로 발달을 연구하기 위해 도파민 및 stri AAL Explan을 배양하는 것입니다. 이것은 먼저 선조체를 미시적으로 해부하고 E 14.5 마우스 배아에서 도파민성 중뇌를 해부함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 절개된 조직에서 적절한 크기의 엑스플랜을 절단하는 것입니다.

다음으로, 엑스플란은 콜라겐 겔 내에 서로 가깝게 배치됩니다. 마지막 단계는 축삭돌기가 자랄 수 있도록 2-3일 동안 이러한 엑스플랜을 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 특정 신경 세포 마커에 대한 면역조직화학은 매력적이거나 반발적인 축삭 반응을 보여주고 정량화하는 데 사용됩니다.

해리 배양 또는 두 개의 DX 외식 배양과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 콜라겐 매트릭스가 세포 외 환경을 모방하는 엑손에 3차원 기질을 제공한다는 것입니다. 또한, 콜라겐 매트릭스는 X 외식 또는 주변에 배치된 세포에 의해 방출되는 단백질의 상대적으로 안정적인 구배의 def 형성을 허용합니다. 절차를 시연하는 사람은 Ava Smith와 Francesca로, 제 연구실의 대학원생입니다.

이 절차를 시작하려면 모체의 자궁에서 E 14.5 마우스 배아를 해부합니다. L 15에 보관하고 필요할 때까지 얼음에 중간 크기로 보관하십시오. 다음으로, 배아를 현미경으로 옮기고 배아에서 뇌를 분리합니다.

그런 다음 각 두부 소포의 내측 부분을 잘라 두부를 제거합니다. 그런 다음 수막초를 제거하십시오. meas cephalic flex의 rostral 바로 dorso ventral cut을 만듭니다.

그 후, 두부 굴근(me cephalic flexor)의 또 다른 등쪽 복부 절단을 만듭니다. 그런 다음 현미해부 칼을 사용하여 배쪽 정중선을 따라 위장 코들을 잘라 아래에 있는 복부 중뇌 조직을 노출시킵니다. 복부 중뇌 조직에는 도파민 뉴런이 포함되어 있으므로 부딪히지 않도록 주의하십시오.

그 후, 배쪽 중뇌 조직을 제거하기 위해 복부 정중선의 측면 및 평행으로 두 개의 로스트 코들 컷을 만듭니다. 다음으로, 말단에서 현미해부 칼을 사용하여 남아 있는 복부 중뇌 조직을 X 엑스플랜으로 분할합니다. X는 사용할 때까지 얼음에 5%FBS를 포함하는 L 15 배지에 외식합니다.

이제 중뇌 해부 중에 이전에 얻은 발톱 두부 소포를 현미경으로 옮깁니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 시상과 사투 사이를 절단하여 시상을 제거합니다. 그런 다음 후각구와 같은 후구 구조를 제거하기 위해 선조체에 내측 측면 절단 복부를 만듭니다.

다음으로, 선조체에 끼워진 조직에 대해 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 선조체의 관상 모양을 얻기 위해 나머지 조각을 배치합니다. 선조체는 조직에서 약간 더 투명한 부분으로 인식될 수 있습니다.

그런 다음 선조체를 분리한 다음 미세 해부 칼을 사용하여 보형물로 자릅니다. 정중선에 가까운 약간 더 어두운 조직을 피하십시오.이 조직에는 측면 및 내측 신경절 돌출부의 이동하는 뉴런이 포함되어 있습니다. 준비된 콜라겐 한 방울을 4웰 접시가 없는 우물에 넣는 커버 슬립에 추가합니다.

섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 30분 동안 보관하십시오. 콜라겐은 이 배양 동안 젤라틴화됩니다. 콜라겐이 젤라틴화되면 200마이크로리터 팁이 있는 피펫을 사용하여 도파민 또는 염 외식을 콜라겐으로 전달합니다.

그런 다음 바늘을 사용하여 외식재를 서로 가깝게 움직입니다. 대략 하나의 x explan의 지름의 거리에서 거리를 유지하십시오. 그런 다음 여분의 매체를 제거합니다.

엑스플랜 위에 준비된 콜라겐 20마이크로리터를 추가합니다. 이것은 종종 외식식물이 이리저리 움직이게 합니다. 바늘을 사용하여 외식식물의 위치를 변경합니다.

콜라겐이 실온에서 15분 동안 응고되도록 합니다. 그런 다음 37% 이산화탄소가 공급되는 섭씨 5도의 인큐베이터로 30분 동안 옮깁니다. 콜라겐이 굳은 후 400마이크로리터의 엑스플랜 배지를 넣고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 2-3일 동안 자라게 합니다.

엑스플랜을 부드럽게 고정하려면 파라 포름알데히드 4%를 넣고 실온에서 1시간 동안 보관합니다. 1시간 후. PBS로 실온에서 15분 동안 매번 3회 세척합니다.

그런 다음 PBS를 제거한 후 차단 버퍼에서 2시간 동안 배양한 후 다음날 섭씨 4도에서 1차 항체와 차단 버퍼로 밤새 배양합니다. PBS로 실온에서 5회 세척하면 매번 1시간 동안 세탁합니다. 그런 다음 적절한 세균총에 접합된 2차 항체로 배양합니다.

4는 섭씨 4도에서 밤새 버퍼를 차단합니다. 이 단계부터는 빛에 대한 노출을 최소화하기 위해 외식식물을 알루미늄 호일로 덮습니다. 섭씨 4도의 PBS에서 밤새 씻은 다음 다음 날 여러 번 씻으십시오.

다음으로, 외식면이 아래를 향하도록 하여 연장된 퇴색 방지 시약 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 외식식물을 장착합니다. 장착 매체에 덮개 슬립을 매우 부드럽게 놓아 그 아래에 공기가 갇히지 않도록 합니다. 그런 다음 epi 형광 현미경을 사용하여 x explants의 디지털 이미지를 획득합니다.

이러한 이미지를 사용하여 각 X explan을 사분면으로 나누어 근위 사분면과 원위 사분면을 생성합니다. 그 후, X 외삽에서 나오는 20개의 가장 긴 신경돌기의 길이를 근위부와 원위부 사분면 모두에서 측정합니다. 가장 긴 20개의 신경의 평균 길이를 사용하여 각 개별 설명에 대한 근위 원위 비율을 계산합니다.

근위 원위 비율이 1보다 크면 축삭돌기의 인력을 나타냅니다. 비율이 1보다 작으면 축삭돌기 반발을 나타냅니다. 여기에 보이는 것은 축삭돌기 성장을 드러내는 항 티로신 하이드록실라제 항체로 염색된 중뇌 익스플랜입니다.

점선은 인접한 외식을 나타냅니다. 여기서 화살표는 개별 신경돌기와 성장 원뿔을 나타냅니다. 다음은 근위 원위 비율 정량화의 예입니다.

는 동일한 사분면으로 나뉩니다. 근위 사분면은 인접한 X 외삽을 향하고 있고 원위 사분면은 반대쪽을 향하고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 misal 및 nigro 경로 발달을 조사하고 이러한 경로의 정보와 관련된 분자 메커니즘을 연구하기 위해 도파민 및 성층 외식재를 공동 배양하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.