Name: 마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 도파민성 및 선조체 익스플랜트를 3차원 콜라겐 매트릭스에서 배양하여 축삭 성장과 신경 회로 발달을 연구하는 방법입니다. 면역조직화학을 통해 축삭 반응을 정량화할 수 있습니다.

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콜라겐 매트릭스 분석은 과거 2-3 년 동안 여러 연구 그룹의 연구에 의해 개발되고 향상되었습니다. dopaminergic 및 striatal explants를 위해 여기에서 설명한 방법은 크게 이러한 연구로부터 혜택을 누릴 수 있습니다. 또한, 저자 striatal explant 문화를 설정하는 그녀의 도움을 Asheeta 프라 사드 감사드립니다. 실험실에서 작품은 인간 국경 과학 프로그램기구 (경력 개발 상)에 의해 추진하는 사업, 보건 연구 및 개발에 네덜란드기구 (ZonMW-VIDI 및 ZonMW-TOP), Europanian 연합 (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , 그랜트 222999) (RJP까지) 및 학술 연구에 대한 네덜란드기구 (TopTalent; .. 너까지).

1. 쥐 꼬리 콜라겐의 작성 <ol><li> 6-10 성인 쥐의 꼬리를 (이것은 사용할 때까지 -20 ° C에 꼬리를 저장할 수 있습니다)를 수집합니다. </li><li> 실온 (RT)에서 하룻밤 사이에 95 % 에탄올에 꼬리를 적시게. </li></ol> 쥐의 꼬리의 절개 (조직 문화 후드에서) : (그들을 사용하지 않을 때 70 %의 에탄올에 도구를 유지하고이 절차 전반에 걸쳐 사용되는 모든 솔루션, 도구 및 유리 제품은 멸균 있는지 확인) <ol start="3"><li> 꼬리에서 힘줄를 수집하려면, 꼬리 끝부분을 잘라. 포셉 한 켤레와 꼬리의 큰 끝을 잡아. , 잡고 구부 및 기타 포셉 가까운 꼬리를 끊어야 할 포셉 또 한 쌍의을 사용합니다. 떨어져 당겨와 힘줄 (그림 1A, B) 뒤에 남아있을 것입니다. </li><li> 멸균 H 2 O에 힘줄를 수집하고 모든 힘줄을 수집 후 멸균 H 2 O를 가진 새로운 petridish으로 이동 </li><li> 2-3 힘줄을 가지고 2 쌍 중을 사용하여 분쇄기에 넣어멸균 H 2 O에있는 새로운 petridish에 ceps 이러한 정맥 (; 그림 1C 힘줄 조직이 반짝 이는 반사이다)로 비 힘줄 조직을 제거합니다. 모든 비 힘줄 조직을 제거 후, ​​각각의 꼬리는 힘줄의 약 100-150 MG를 얻을. </li><li> 멸균 3퍼센트 초산 300 ML에 힘줄을 전송하고 4에 천천히 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 멸균 3퍼센트 초산의 추가 200 ML을 추가하고 4에 천천히 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 4에 120 분 동안 ~ 2,700 XG에 힘줄이 들어있는 아세트산 용액을 원심 ° C 펠렛 이외의 해산 힘줄이 아닌 힘줄 조직합니다. </li><li> 원심 분리하는 동안 투석 튜브가 준비 : <ul><li> 40cm의 조각 잘라 </li><li> 5 분, 500 μm의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 넣어 익히지 </li><li> 멸균 H 2 O 시원하고 </li></ul></li><li> 투석 튜브의 한쪽 끝에 매듭을 묶게하고 자동 pipett를 사용하여 조직 문화 후드 얼음 속에서 centrifuged 힘줄이 솔루션의 표면에 뜨는 함께 튜브를 채우려면전자과 25 ML의 피펫. 거품을 생산하지 마십시오. 매듭은 튜브의 모든 조각들은 (그림 1D) 얼음 무균 알루미늄 호일에 튜브 및 매장 튜브의 다른 쪽 끝을 가득 때까지. </li><li> 조직 문화 후드에 무균 0.1X MEM, 산도 4.0의 10 나도 준비합니다. 튜브 조각에 시체를 추가하고 10 난 비커에 미리 냉각 0.1X MEM 용액에 이들을 추가합니다. 천천히 교반 ° C ~하면서 4에서 하룻밤 Dialyze. 산도가 낮은 유지하면서 이러한 투석은 초과 산성을 제거합니다. </li><li> 새로운 사전 냉각 10리터 0.1X MEM로 교체 및 4에서 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 새로운 사전 냉각 10리터 0.1X MEM으로 대체하여 이전 단계를 반복하고 4에서 하룻밤 저어 ° C. </li><li> 멸균 50 ML 튜브로 나누어지는의 콜라겐 솔루션입니다. 4 ° C.에 상점 aliquots 6-12 개월을 유지, 오직 조직 문화 후드에 콜라겐 주식을 취급하고 있습니다. </li><li> 그것은 정화 콜라겐은 콜라겐 matr에서 최적의 결과를 얻으려면 (0.1x MEM)을 희석해야 여부를 테스트하는 것이 중요하다IX 분석. 따라서 콜라겐 희석 시리즈를 생성 (undiluted 콜라겐, 1시 1분, 1시 2분 및 1시 5분이 희석)와 최적의 콜라겐 희석을 결정하기 위해 아래에 설명된대로 콜라겐 매트릭스 assays를 수행합니다. </li></ol> 2. Dopaminergic Midbrain 7,8의 해부 <ol><li> 어머니의 자궁에서 E14.5 마우스 배아를 해부하고 필요할 때까지 얼음 L15 매체에 보관. </li></ol> 모든 후속 해부 과정은 얼음 L15 매체로 진행됩니다. <ol start="2"><li> 두뇌를 해부. </li><li> 각 telencephalic 소포 (striatal explants 위해 telencephalic vesicles을 사용)의 중간 부분을 따라 절단하여 telencephalon를 제거합니다. </li><li> meningeal 칼집을 제거합니다. </li><li> mesencephalic 굴곡의 단지 주동이의 dorsoventral 몫을합니다. </li><li> mesencephalic 만곡 중 꼬리 다른 dorsoventral 몫을합니다. </li><li> microdissectio을 사용하는 등 부분의 중간선을 따라 rostrocaudal 컷 만들기n은 칼로 기본 복부 midbrain 조직을 폭로합니다. 그것이 dopaminergic 뉴런 (그림 2)가 들어 있으므로 복부 midbrain 조직에 충돌하지 않도록주의하십시오. </li><li> 이 rostrocaudal 인하는 수평과 지느러미 midbrain 조직을 제거하는 복부 중간선에 평행합니다. </li><li> microdissection 나이프를 사용 explants로 남아 복부 midbrain 조직을 나누십시오. </li><li> 사용할 때까지 얼음 5 % FBS를 포함한 L15 매체에 explants을 저장합니다. </li></ol> 3. Striatum의 해부 모든 해부 과정은 얼음 L15 매체로 진행됩니다. <ol><li> midbrain의 해부 동안 해부 telencephalic vesicles을 사용합니다. </li><li> 시상과 집게를 사용하여 striatum 사이에 절단하여 시상을 제거합니다. </li><li> 이러한 후각 망울로 주동이의 구조를 제거 striatum에 mediolateral 상처가 주동이의합니다. striatum에 caudally있는 조직에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 위치striatum의 코로나보기를 얻을 수 남은 ​​슬라이스 (그림 2). </li><li> striatum는 조직 (더 투명) 약간은 덜 조밀한 부분으로 인식된다. microdissection 나이프를 사용 explants로 striatum과 상처를 해부. 측면과 중간 ganglionic 예하의 이주 뉴런을 포함 중간선에 약간 어두운 조직 주변을 피하십시오. </li><li> 사용할 때까지 얼음 5 % FBS를 포함한 L15 매체에 explants을 저장합니다. </li></ol> 4. 조립 콜라겐 매트릭스 Assays 콜라겐의 준비 (얼음의 모든 단계, 피펫 팁에게 냉각 사용)를 <ol><li> 10X MEM 100 μl와 1M 나트륨 중탄산염 40 μl (NaHCO 3)로 희석 콜라겐의 860 μl를 섞어서 얼음에 보관. 이 시점에서 콜라겐가 따뜻해지면 그것은 고체화됩니다. </li><li> 4 잘 Nunc 요리의 우물로 coverslip에 준비된 콜라겐 20 μl의 방울 (직경 약 5 ㎜) 추가그리고 37 CO 2 배양기에 서 해주 ° C ~ 5 % 30 분 (주위 O 2 농도가 충분합니다)에 대한 CO 2. 이 인큐베이션 기간 동안 콜라겐은 아교 질로 만들다 것입니다. </li></ol> 콜라겐 겔에서 설치 프로그램 공동 문화 <ol start="3"><li> 콜라겐은 gelatinized 후 콜라겐으로 dopaminergic 또는 striatal explant를 전송하는 200 μl 팁과 피펫을 사용합니다. </li><li> 바늘을 사용하여 서로 근접 거리에 explants 이동합니다. 한 explant (~ 200-300 μm의) (그림 2)의 약 직경의 거리에서 그들을 따로 보관. </li><li> 초과 매체를 제거하고 explants 위에 준비된 콜라겐 20 μl를 추가합니다. 이것은 종종 explants가 이동하게됩니다. 4.4에서 설명한대로 바늘을 사용하여 explants를 재지정. </li><li> 콜라겐은 37 ° C 5 % CO 2시 30 분 뒤에 RT에서 15 분 동안 응고하자. </li><li> 콜라겐가 설정되면, 전자의 400 μl를 추가할xplant 매체 37시 CO 2 배양기에서 2-3 일동안은 성장 ° C에서 5 % CO 2. </li></ol> 5. Immunohistochemistry과 부량에 의한 분석 Immunohistochemistry <ol><li> explants를 해결하려면 부드럽게 매체 400 μl (이를 4퍼센트로 PFA를 diluting)에 PBS에서 8 % paraformaldehyde 400 μl (PFA)를 추가하고 RT에서 1 시간 동안 서 보자. </li><li> RT에서 PBS의 3 배 15 분 씻으십시오. </li><li> 버퍼를 차단에 품어 (BB, PBS + 1% FBS + 0.1 % 트리톤 X-100) 2 시간. </li><li> 4 ° C.에서 BB의 일차 항체와 하룻밤 품어 dopaminergic axons은 striatal axons 방지 DARPP32 항체 (1:500) 9 및 모든 axons 방지 βIII의 tubulin (1:3000) 7 시각화를위한 안티 - 티로신 hydroxylase 항체 (1:1000) 7을 사용하십시오. </li><li> RT에서 PBS에 5 배 1 시간 씻는다. </li><li> 4에서 하룻밤 BB의 해당 형광단 (1:500)에 복합 이차 항체와 함께 품어° C. 이 단계에서 explants의 노출을 최소화의 빛으로 (예 : 알루미늄 박으로 그들을 포함). </li><li> 4에서 PBS에서 하룻밤 씻으 ° C ~ 다음 날 동안 여러 세차장으로 따라갔다. </li><li> 현미경에 explants를 탑재은 Antifade 시약이 매체를 장착 연장 사용하는 슬라이드. 유리 현미경 슬라이드에 ~ 10 μl의 방울을 추가합니다. coverslip을 가지고 부드럽게 아래로 향하게 explant 측면에 장착 매체의 드롭에 배치하십시오. 아주 부드럽게 장착 매체의 드롭 그것을 낮추는 방법으로 드 coverslip에 따른 공기를 포집하지 마십시오. </li></ol> P / D 비율을 계산하여 부량 <ol start="9"><li> epifluorescence 현미경 (그림 3)를 사용 explants의 디지털 이미지를 습득. </li><li> 이러한 이미지를 사용하여, 근위 사분면 (인접 explant에 가장 가까운 explant의 예 부분)과 말초 사분면 (인접 expla에서 떨어져 멀리 explant의 일부를 생성하는 quadrants으로 각 explant을 나누다NT) (그림 2, 4). </li><li> 근위 및 말초 quadrants의 두 explant에서 신흥 20 긴 neurites의 길이를 측정합니다. </li><li> 각 개별 explant에 대한 P / D 비율을 계산하는 20 긴 neurites의 평균 길이를 사용합니다. 비율 &lt;1 축삭의 반발을 표시하면서 AP / D 비율&gt; 1, 축삭의 명소를 나타냅니다. </li><li> 어떤 경우에는 neurites의 울창한 성장은 개별 neurite 길이의 평가를 방지합니다. 이러한 상황에서는 부량는 explant의 가장자리와 근위 및 말초 quadrants의 축삭 성장의 선도 전면 사이의 거리를 측정하여 수행할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 이미지 dopaminergic 및 striatal explants의 성공적인 문화 후에는 axons의 큰 숫자 (표시되지 않음) 명시야 현미경을 사용하여 표시하거나 방지 βIII tubulin의 immunocytochemistry 의해 같은 시각입니다. 이러한 axons의 하위 집합이 dopaminergic 또는 S 것입니다<html> 시각을 사용 immunocytochemistry 같은 triatal axons (그림 3). 설명된대로 quadrants로 explants 나누어 및 P / D 비율을 결정함으로써, putative 축삭 매력적이거나 혐오스러운 장면 효과 (그림 3E) 계량하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> 그림 1. 쥐의 꼬리 힘줄의 콜라겐의 준비를 보여주는 사진. 쥐의 꼬리를 갈라 이겠지)는 힘줄을 제공합니다. B) 인대는 밧줄과 같은 번들로서 볼 수 있습니다. C) 인대는 그들의 반짝 이는 흰색 외관에 의해 정맥에서 구별하기 쉽습니다. D) 초산에 힘줄을 해소 후 솔루션은 투석 튜브로 전송됩니다. 녹아 콜라겐 추위를 유지하려면, 튜브는 얼음에 무균 알루미늄 호일에 표시됩니다. 전자 2 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 절차의 여러 단계를 나타내는 도식. 적절한 뇌 영역 해부와 explants를 생성합니다 버렸어요. 단일 midbrain 및 striatal explant는 콜라겐 매트릭스의 근접 거리에 위치하며 37 ° C.에 48~72시간 동안 성장 남아 있습니다 Axons는 형광 immunohistochemistry에 의해 시각이며 P / D 비율은​​ chemotropic 응답을 수치 계산됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> 그림 3. 콜라겐 매트릭스 문화 축삭의 성장을 보여주는 대표적인 결과. ) Midbrain의 explant는 안티 - 티로신 hydroxylase 항체가 축삭의 가지를 밝히 물들일. 점선은 인접한 explant을 나타냅니다. 보여주는 개별 neurites과 성장 콘 (화살표)의 B) 확대. C) Striatal explant 안티 DARPP32 물들일. D) C의 확대는 개별 neurites을 보여주는. 의 E) 예P / D 비율 부​​량. Explants은 동일 quadrants으로 나뉩니다. 말초 사분에서 멀어 직면하는 동안 근위 구역이 인접한 explant에 직면하고 있습니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
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<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

콜라겐 매트릭스 분석은 여기 설명 (예 : 참고 문헌 5-8 참조) 축삭 유도 분자와의 연결 시스템의 다양한 조사를 위해 지난 수십 년간의 여러 연구소에서 사용하고 향상되었습니다. 이러한 연구는이 분석은 효과와 다른 (중급) 대상 조직을 통해 분비 축삭 유도 분자 규제를 공부를위한 강력한 도구입니다 것으로 나타났습니다. 그러나, 그것은 콜라겐 매트릭스가 세포외 환경 (ECM)의 대용품이지만 확실히 ECM에서는 정상적으로 현재 많은 단백질이 결여되어 있다고 지적한다. ECM의 구성 요소는 축삭 유도 분자 10 효과에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, 콜라겐 매트릭스 분석은 시험 관내 및 기타 조직 문화 접근 방법 (예 : organotypic 슬라이스 문화 11) 또는 유전자 조작 동물 모델의 분석과 함께 기본적인 분자 메커니즘을 조사에 특히 유용합니다. </p&gt; <p class="jove_c...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 소태아 세럼 </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> 글루타민 (200mM) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> 머크 </td><td> 444,203 </td><td></td></tr><tr><td> 최소 필수 미디어 (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz의 L-15 중간 </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 Antifade 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> 투석 튜브 </td><td> 스펙트럼 연구소 </td><td> 132,660 </td><td></td></tr><tr><td> 래빗 안티 티로신 Hydroxylase </td><td> 펠 - Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> 래빗 안티 Darpp32 (H-62) </td><td> 산타 - 크루즈 </td><td> SC-11365 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 방지 βIII의 tubulin </td><td> 시그마 </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 형석은 이차 항체를 분류 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 assays의 striatal explants의 해부와 문화

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

striatum 한 포함한 telencephalon 여러 분야에 대한 중간 forebrain 번들 통해 Midbrain의 도파민 (mdDA) 뉴런 프로젝트. 서로, striatonigral (직접) 경로를 야기할 striatum에서 매체 가시 뉴런은 substantia nigra 2 신경을 분포시키다. 이러한 축삭의 책자의 개발은 축삭의 성장과 neurites하거나 (중급) 대상 지역 3,4에 의해 출시되는 분자를 포함하여지도 단서의 과다의 조합 동작에 의존적일 수 밖에 없습니다. 이러한 수용성 요소는 세포외 환경을 흉내낸 axons에 대한 입체적인 기판을 제공하는 콜라겐 매트릭스의 culturing의 mdDA 및 / 또는 striatal explants하여 체외에서 공부하실 수 있습니다. 또한, 콜라겐 매트릭스 주변 (예 : 참고 문헌 5와 6 참조)에 배치 기타 explants이나 세포가 발표한 단백질의 상대적으로 안정적인 그라디언트의 형성을 허용합니다. 여기 pur를위한 방법을 설명콜라겐 젤류 및 후속 immunohistochemical 및 정량 분석​​에 쥐의 꼬리 콜라겐, dopaminergic 및 striatal explants의 microdissection, 그들의 문화 ification. 첫째, E14.5 마우스 배아의 두뇌는 고립된 dopaminergic이며 striatal explants는 microdissected됩니다. 이러한 explants 그 후 (CO) 체외에서 48~72시간 동안 coverslips에 콜라겐 젤에 배양해 있습니다. 그 후, axonal 전망이의 연결을 표시 (예, 티로신 hydroxylase, DARPP32 또는 βIII의 tubulin)과 축삭의 성장과 매력적이거나 혐오스러운 장면 축삭 댓글의 계량하고 사용하여 시각입니다. 이것의 연결 준비는 개발하는 동안 mesostriatal 및 striatonigral 축삭의 성장과지도의 세포와 분자 메커니즘의 체외 연구에 대한 유용한 도구입니다. 이러한 분석을 사용, 그건 dopaminergic 및 striatal axons 기타 (중급) 목표를 평가하기 위해 또는 특정 분자 단서를 테스트할 수도 있습니다.

midbrain의 도파민 시스템과 striatum에서 Explants가를위한 콜라겐 매트릭스 분석에 사용됩니다<em&gt; 체외에서</emmesostriatal 및 striatonigral 경로 개발&gt; 분석. 본 분석에서는 axonal 파생물 및지도는 조작과 계량 수 있습니다. 그것은 또한 다른 지역이나 분자 단서를 평가에 대해 수정할 수 있습니다.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

중뇌 도파민(mdDA) 뉴런은 내측 전뇌 다발을 통해 선조체를 포함한 종뇌의 여러 영역으로 투사됩니다1. ...

이 절차의 전반적인 목적은 중뇌-선조체 및 선조체-흑질 경로의 발달을 연구하기 위해 도파민성 뉴런과 선조체 AAL Explan을 배양하는 것입니다. 이는 먼저 E 14.5 마우스 배아로부터 선조체와 도파민성 중뇌를 미세 해부함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 해부한 조직에서 적절한 크기의 explan을 절단하는 것입니다.다음으로, 외편(explan)들을 콜라겐 겔 내에서 서로 가까이 위치시킵니다. 마지막 단계는 축삭 돌출(axon outgrowth)이 일어날 수 있도록 이 외편들을 2~3일 동안 배양하는 것입니다. 최종적으로, 특정 신경 세포 마커에 대한 면역조직화학 염색을 통해 축삭의 유인 또는 반발 반응을 확인하고 정량화합니다.해리된 또는 두 개의 DX 외식물 배양과 같은 기존 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 콜라겐 매트릭스가 세포외 환경과 유사한 엑손을 위한 3차원 기질을 제공한다는 점입니다. 또한, 콜라겐 매트릭스는 X 외식물이나 주변에 배치된 세포에서 방출되는 단백질의 상대적으로 안정적인 구배 형성을 가능하게 합니다. 본 절차의 시연은 저희 실험실의 대학원생인 Ava Smith와 Francesca가 진행하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 모체 자궁에서 E 14.5 마우스 배아를 적출하십시오. 필요할 때까지 L 15 배지가 담긴 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 배아를 현미경으로 옮겨 배아에서 뇌를 분리하십시오.그런 다음 각 두부 소포의 내측 부분을 따라 절개하여 두부를 제거합니다. 그 후, 뇌수막초를 제거합니다. 정중 두부 굴곡의 바로 앞쪽에서 등-배측 절개를 수행합니다.이어서, 중뇌 굴곡부(cephalic flexor) 바로 근처에 등-배측(dorsal ventral) 절개를 한 번 더 실시합니다. 그런 다음 미세 해부용 칼을 사용하여 등쪽 정중선을 따라 횡단 절개를 가해 하부의 복측 중뇌 조직을 노출시킵니다. 복측 중뇌 조직에는 도파민성 뉴런이 포함되어 있으므로 손상되지 않도록 주의하십시오.그 후, 등쪽 중뇌 조직을 제거하기 위해 복측 중앙선과 평행하게 외측으로 두 번의 Rost Coddle 절개를 수행합니다. 다음으로, 마이크로디섹션 나이프를 사용하여 남은 복측 중뇌 조직을 X 낱개로 분할합니다. X 분할된 조직은 사용 전까지 5% FBS가 포함된 L 15 배지 내에서 얼음 위에 보관합니다.이제 중뇌 해부 과정에서 미리 얻어둔 발톱 머리 소포를 현미경으로 옮깁니다. 포셉을 사용하여 시상과 시상하부 사이를 절단하여 시상을 제거합니다. 그런 다음 선조체 앞쪽을 내측에서 외측으로 절단하여 후각구와 같은 앞쪽 구조물을 제거합니다.다음으로, 선조체(striatum)에 인접한 조직에 대해 이 단계를 반복합니다. 그 후, 선조체의 관상면(coronal view)을 얻을 수 있도록 나머지 슬라이스를 배치합니다. 선조체는 조직에서 약간 더 투명한 부분으로 식별할 수 있습니다.그 다음 선조체를 분리하고, 마이크로디섹션 나이프를 사용하여 이를 임플란트 크기로 절단합니다. 외측 및 내측 신경절 융기의 이동 뉴런이 포함되어 있어 색이 약간 더 어두운 정중선 근처의 조직은 피하십시오. 4-웰 디쉬의 웰 내 커버슬립 위에 준비된 콜라겐 한 방울을 추가합니다.37°C 및 5% 이산화탄소 조건의 인큐베이터에서 30분 동안 유지합니다. 이 배양 과정 동안 콜라겐이 젤화됩니다. 콜라겐이 젤화된 후, 200 µL 팁이 장착된 피펫을 사용하여 도파민성 또는 염성 외식편을 콜라겐으로 옮깁니다.그런 다음 바늘을 사용하여 외식편들을 서로 가까이 이동시킵니다. 외식편 1개의 직경 정도의 거리로 간격을 유지하십시오. 다음으로 과잉 배지를 제거합니다.준비된 콜라겐 20 µL를 조직편(explant) 위에 추가합니다. 이 과정에서 조직편이 움직이는 경우가 많으므로, 바늘을 사용하여 조직편의 위치를 다시 조정하십시오.콜라겐을 상온에서 15분 동안 굳힙니다. 그 다음, 5% carbon dioxide가 공급되는 37 °C 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 둡니다. 콜라겐이 완전히 굳으면, explan medium 400 µL를 첨가하고 37 °C 인큐베이터에서 2~3일 동안 배양합니다.조직을 부드럽게 고정하기 위해, 4% 파라포름알데하이드를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 유지합니다. 1시간 후, 실온의 PBS로 15분씩 3회 세척합니다.그 다음 PBS를 제거하고, 차단 버퍼(blocking buffer)에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 1차 항체와 차단 버퍼를 함께 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온에서 PBS로 5회 세척하며, 각 세척 단계는 1시간 동안 수행합니다. 그 다음 적절한 형광 물질이 결합된 2차 항체로 배양합니다.블로킹 버퍼에서 4°C로 하룻밤 동안 처리합니다. 이 단계부터는 빛 노출을 최소화하기 위해 외식물을 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 4°C의 PBS에서 하룻밤 동안 세척한 후, 다음 날 여러 번 더 세척합니다.다음으로, 절편면이 아래를 향하도록 하여 prolonged anti fade 시약 마운팅 용액을 이용해 현미경 슬라이드 위에 외식물(explant)을 마운트합니다. 마운팅 용액 위에 커버 슬립을 매우 조심스럽게 덮어 내부에 공기가 갇히지 않도록 합니다. 그런 다음, 에피 형광 현미경(epi fluorescence microscope)을 사용하여 x개의 외식물에 대한 디지털 이미지를 획득합니다.이 이미지들을 사용하여, 각 X explant를 4분면으로 나누어 근위 4분면과 원위 4분면을 생성합니다. 그 후, 근위 및 원위 4분면 모두에서 X explant로부터 뻗어 나온 가장 긴 neurite 20개의 길이를 측정합니다. 가장 긴 neurite 20개의 평균 길이를 사용하여 각 개별 explant의 근위 원위 비율(proximal distal ratio)을 계산합니다.근위부-원위부 비율이 1보다 크면 축삭 유인(attraction)을 나타냅니다. 반면, 비율이 1보다 작으면 축삭 반발(repulsion)을 나타냅니다. 여기 제시된 이미지는 anti tyrosine hydroxylase 항체로 염색하여 축삭 성장을 보여주는 중뇌 절편입니다.점선은 인접한 외식편을 나타냅니다. 화살표는 개별 신경 돌기와 성장 원추를 나타냅니다. 다음은 근위-원위 비율 정량화의 예시입니다.이들은 동일한 크기의 4분면으로 나뉩니다. 근위부 4분면은 인접한 X 이식편을 향하며, 원위부 4분면은 그 반대 방향을 향합니다. 이 영상을 시청한 후에는 도파민성 및 층상 이식편을 공동 배양하여 meso-nigral 경로의 발달을 조사하고, 이러한 경로의 형성에 관여하는 분자적 기전을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 분석은 commissural axons를 방향에 대한 신호 분자의 능력, 여기에 본 Morphogenetic의 단백질 7 (BMP7)을 평가합니다. 배아 등의 척수의 explant는 COS 세포의 secreting 후보 성장 요인의 집계에 인접한 양식입니다. explant 내에서 성장 Reoriented commissural axons은 immunohistochemistry에 의해 시각입니다.

배아 척수 Commissural Axons을 방향을 Diffusible 신호 분자의 능력을 시금

우리는 병아리 E4 statoacoustic 신경절 및 E6 척수의 explants을 해부하다 문화하는 방법을 보여줍니다. Explants는 24 시간 동안 3D 콜라겐 젤의 혈청 무료 조건에서 양식입니다. Neurite 대응은 성장 인자 - 보충 매체와 단백질 코팅 비즈와 함께 테스트됩니다.

Neurite 가지의 Assays에 대한 해부와 칙 Statoacoustic 신경절과 콜라겐 젤에서 척수의 Explants의 문화

이 비디오는 쥐의 배아 뇌 조직에서 도파민 뉴런을 배양하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 과정에는 단백질 분해 효소로 중뇌를 치료하고, 세포를 분리하고, 세포의 성장과 장기적인 생존을 위해 항생제가 함유된 영양이 풍부한 배지의 폴리머 코팅된 커버슬립에서 배양하는 것이 포함됩니다.

Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

이 비디오는 마우스 배아의 중뇌에서 도파민 뉴런을 분리하고 배양하는 과정을 보여줍니다. 고립된 복부 중뇌 바닥은 효소를 사용하여 해리됩니다. 생성된 도파민 뉴런은 수확되어 다중 웰 플레이트 내부의 마이크로 섬으로 전달됩니다. 세포는 마이크로 아일랜드 내부의 고밀도로 세포를 유지하기 위해 도파민 뉴런 배지로 배양됩니다.

1차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런의 분리 및 배양

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

도파민 뉴런은 뇌에서 중요한 조절 역할을 합니다. 그들의 손실은 파킨슨병과 관련이 있습니다. 이 비디오에서는 배아 마우스 중뇌에서 중심 도파민 뉴런의 1차 배양을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이러한 배양은 다양한 스트레스에 대한 이러한 뉴런의 극도의 취약성을 연구하는 데 유용합니다.

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

뇌의 복잡한 행동에 대한 통찰력을 얻으려면 고급 연구 도구가 필요합니다. 여기에서 우리는 뇌와 유사한 구조를 닮은 신경 조직의 새로운 실크-콜라겐 기반 3D 엔지니어링 모델을 보여줍니다. 이 모델은 뉴런 네트워크 조립, 축삭 유도, 세포-세포 상호 작용 및 전기 활동을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

편광 신경 조직의 엔지니어링 3D 실크 콜라겐 기반 모델

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.

성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하

여기, 우리 자기 연골 같은 조직으로 dedifferentiated 인간의 관절 chondrocytes의 분화를 촉진 하는 펩 티 드 건설 기계 조립에 3D 문화 시스템을 얻기 위해 프로토콜을 제시.

3 차원 펩 티 드 건설 기계에 포유류 세포 배양

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

배우세요 마우스 도파민성 및 선조체 익스플랜트를 3차원 콜라겐 매트릭스에서 배양하여 축삭 성장과 신경 회로 발달을 연구하는 방법입니다. 면역조직화학을 통해 축삭 반응을 정량화할 수 있습니다.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

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