HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

이 절차의 전반적인 목표는 hela 세포를 capped 및 uncapped mRNA와 transfection하고, gal luciferase의 전사체를 주입하고, luciferase 활성을 위해 세포 배양을 분석하는 것입니다. 이는 먼저 T seven 고수율 RNA 합성 키트를 사용하여 in vitro transcription을 통해 Gaia luciferase의 전사체인 uncaped 및 capped mRNA를 합성함으로써 수행됩니다. mRNA를 캡핑하는 두 가지 방법이 시연됩니다.

하나는 전사 중 캡 아날로그를 사용하고 다른 하나는 전사 후 캡핑을 위해 vaccinia 캡핑 효소를 사용합니다. 다음 단계는 캡이 있는 mRNA 전사체와 캡이 없는 mRNA 전사체를 나선 세포로 transfection하는 것입니다. 궁극적으로, uncaped 또는 capped mRNA로 인한 루시페라제 활성은 명명된 heli cell culture에서 비교됩니다.

자체 transcription 반응을 설정하는 것에 비해 이 방법의 주요 장점은 T seven high yield RNA synthesis kit가 고수율 및 더 중요하게는 고품질의 전체 길이 RNA transcripts를 생성하도록 테스트 및 최적화되었다는 것입니다. 이는 성공적인 RNA 번역과 기능적 활성 단백질의 발현에 매우 중요합니다. 따라서 이 방법은 RNA transfection에 대한 통찰력을 제공하며, in vitro 전사된 RNA는 마이크로주입 마이크로어레이 분석, 혼성화 기반 블롯, RNA 구조 및 기능 연구와 같은 다른 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

이 예시 반응에 대한 DNA 주형은 가우시안 루시페라아제 또는 글루크 유전자를 포함하는 선형화된 플라스미드입니다. T seven promoter를 사용하면 캡이 있는 제품과 캡이 없는 제품이 모두 합성됩니다. 먼저 T seven 고수율 RNA 합성 키트의 성분을 해동하고 얼음 위에 보관합니다.

RNA 오염을 방지하려면 장갑을 착용하고 벤치 표면 피펫 및 기타 재료를 철저히 세척하십시오.뉴클레아제가 없는 피펫 팁, 튜브 및 유리 용기를 사용하여 캡이 없는 RNA를 합성하는 것이 좋습니다. 실온에서 10 x 버퍼와 물부터 시작하여 DNA 템플릿인 뉴클레오티드를 차례로 반응하도록 설정합니다. 그리고 마지막으로 중합효소 혼합물입니다.

시약 첨가 순서는 캡이 있는 RNA를 합성하는 데 중요합니다. 캡 유사체를 사용하여 유사한 반응 혼합물을 만들되 캡 아날로그 뉴클레오티드를 추가합니다. 표준 뉴클레오티드를 첨가한 후, 이제 부드럽게 와류를 일으켜 반응 성분을 혼합한 다음 내부 대조군이 선형화된 플라스미드 C Luke 발현을 정규화하는 데 사용되는 C Luke에서 c Luke의 캡 전사체를 합성하기 위한 두 번째 반응을 설정함에 따라 건조 공기 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 반응을 펄스, 회전 및 배양합니다.

배양 후 각 반응 혼합물에서 DNA 템플릿을 제거합니다. 70마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 넣은 다음 DNA 10개, 반응 완충액 1개, DNA 2마이크로리터를 추가합니다. 첫째, DNA가 건조 공기 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 15분 동안 반응하도록 합니다.

이제 스핀 컬럼 기반 RNA 정제 키트를 사용하여 반응을 정제하고 NanoDrop TM 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화합니다. 마지막으로, Agilent RNA 6, 000 nano Kitt 및 Agilent 2100 bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다. 표준 캡핑 반응의 경우, 15마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 정제된 캡이 없는 글루크 mRNA 10마이크로그램을 추출합니다.

이에 따라 확장할 수 있습니다. RNA를 섭씨 65도에서 10분 동안 가열하여 2차 구조를 파괴한 다음 5분 동안 얼음 위에 놓습니다. 캡핑 반응을 설정하려면 캡핑 버퍼, GTP, 갓 희석된 달팽이 메티오닌 및 백시니아 캡핑 효소를 변성된 RNA에 추가하고, 반응 성분을 부드럽게 소용돌이치고, 펄스 스핀을 일으키고, 건조 공기 인큐베이터에서 30분 동안 섭씨 37도의 반응을 배양합니다.

배양 후 이전 섹션의 끝에서 했던 것처럼 RNA를 정리하고 분석합니다. 헬라 세포를 도금하는 것으로 시작합니다. 48 웰 플레이트의 28 웰에는 70-230, 000 개의 세포와 10 % 혈청이 보충 된 150 마이크로 리터의 고 포도당 DMEM이 포함되어야합니다.

세포가 60-90% 융합될 때까지 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하며, 이는 16시간에서 24시간 사이에 소요됩니다. 세포가 준비되면 형질주입 혼합물을 준비합니다. RNA를 마이크로리터당 100나노그램의 농도로 희석합니다.

그런 다음 세 가지 다른 반응을 위해 24개의 마이크로 원심분리기 튜브를 설정합니다. 8개의 튜브에 8번 복제되었습니다. gluc RNA에서 캡이 없는 1마이크로리터, 정상화를 위해 1마이크로리터 캡이 있는 c luke RNA와 25마이크로리터의 무혈청을 추가합니다.

DMEM은 항상 다음 8개의 튜브에서 피펫터를 사용하여 잘 혼합됩니다. 동일한 반응을 설정하되 캡이 없는 글루크, RNA 대신 마지막 8개의 튜브에 캡 아날로그를 사용하여 준비된 캡이 있는 글루크 RNA를 추가합니다. 캡 아날로그를 사용하여 준비된 gluc RNA 대신, 백시니아 반응에서 캡이 있는 gluc RNA를 0.2 마이크로리터 mRNA 부스트 시약에 캡이 없는 gluc RNA가 혼합된 8개의 튜브로 구성된 첫 번째 세트에 추가한 다음 0.2 마이크로리터에서 혼합합니다.

transit mRNA 시약을 사용하면 실온에서 5분 이상 반응이 진행되지 않도록 합니다. 반응 시작 2분 후, 각 혼합물을 배양된 세포가 있는 웰에 적가씩 옮기기 시작합니다. 백시니아 반응에서 캡, 아날로그 캡 글루크, RNA 및 캡을 씌운 글루크 RNA를 포함하는 다음 두 세트의 튜브에 대해 이 단계를 반복합니다.

4 개의 웰을 음성 대조군으로 남겨두고 5 % 이산화탄소 분석에서 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. Supra는 Gluc 분석을 위해 Biox GIA Luciferase 분석 키트를 사용하여 명명되었습니다. 1.5ml의 biox gluc 분석 버퍼에 15마이크로리터의 biox gluc 기질을 추가하여 새로운 분석 용액을 준비합니다.

최종 혼합물을 와류로 만들지 마십시오. CLU 분석을 위해 튜브 반전으로 혼합합니다. 새로 재구성 된 기질 100 개를 준비합니다.

그런 다음 1.5ml의 Blu Ciena luciferase 분석 버퍼에 15마이크로리터의 재용해된 기질을 추가하여 분석 용액을 만듭니다. 와류 없이 C Luke 분석 용액을 혼합하고 빛에서 30분 동안 실온에서 배양합니다. 분석 용액이 준비된 상태에서.

마이크로플레이트 광도계를 사용하여 세포의 발광을 측정합니다. 2초에서 10초에 걸쳐 50마이크로리터의 분석 용액을 주입하도록 광도계를 설정합니다. 다음으로, 각 세포 배양 슈퍼 이름의 10 마이크로 리터를 96 while black plate의 웰로 옮깁니다.

인젝터에 분석 용액을 프라임하고 발광 측정을 진행합니다. T seven 고수율 RNA 합성 키트는 Agilent 2100 바이오분석기에서 분석할 때 20마이크로리터 반응당 최대 180마이크로그램의 캡이 없는 RNA와 40 - 50마이크로그램의 캡이 있는 RNA를 생산할 수 있습니다. 좋은 품질은 손상되지 않았습니다.

RNA는 RNA 전사체를 나타내는 하나의 날카로운 피크를 보여줘야 합니다. 넓은 피크 또는 여러 피크는 RNA 분해를 나타냅니다. R-N-A-R-N-A의 크기를 확인하는 것도 중요합니다.

예상보다 긴 길이의 전사체는 주형 플라스미드의 불완전한 분해로 인한 것일 수 있으며, D-N-A-R-N-A 분해 및 낮은 수율은 일반적으로 주형에서 반응으로 도입된 오염 물질의 결과입니다. DNA 형질주입 후 배양 및 분석 루시페라제 활성이 뒤따랐습니다. five prime cap 구조는 엑소뉴클레아제 분해로부터 RNA를 보호하고 번역 시작을 촉진하는 데 중요합니다.

따라서 RNA 캡핑(capping)은 transfection 실험에 필수적인 단계입니다. capped transcript와 uncaped transcript로 transfection된 세포 배양 간의 측정된 발광의 차이는 이를 분명히 뒷받침하며, cap analog를 사용하는 capping 기술과 vaccinia capping 효소를 사용하는 capping 기술 모두 기능적 capped RNA transcript를 성공적으로 생성한다는 것을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 transfection 및 기타 다양한 응용 분야에 사용하기 위해 고품질 capped RNA transcript를 합성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.