태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

이 절차의 전반적인 목표는 에탄올 노출이 발달 중인 제브라 피쉬에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이것은 초기 발달 단계에서 제브라 피쉬를 일반 배아수에 있는 에탄올 투여량에 먼저 노출시킴으로써 달성됩니다. 다음으로, 에탄올을 제거하고 물고기가 원하는 시점으로 발달하도록 합니다.

그런 다음 유전자 발현의 변화뿐만 아니라 총체적인 물리적 변화도 대조 배아와 비교하여 치료에서 분석됩니다. 마지막으로, 배아를 mRNA, 모르포스 또는 약물로 조작하여 에탄올로 유도된 발달 결함이 변경될 수 있는지 여부를 결정합니다. 궁극적으로, 정량적 PCR과 C 2 혼성화의 조합은 제브라피시 배아 발달에 대한 에탄올 효과가 유전자 발현 변화와 관련이 있음을 보여줍니다.

유전자 발현 수준의 후속 조작은 에탄올에 의한 발달 결함을 개선하거나 예방할 수 있습니다. 오늘 우리가 시연하는 기술은 태아 알코올 증후군의 본질에 대한 지식을 확장할 뿐만 아니라 척추동물의 발달 과정을 보존합니다. 오늘 시연할 사람은 제 연구실의 기술자인 스테판 에르하르트(Steph Erhardt)로, 에탄올로 배아를 치료합니다.

야생형 짝짓기에서 배아 물에서 섭씨 28도의 돔 단계로 키웁니다. 클러치의 배아를 접시당 10개에서 50개 사이의 배아가 있는 원하는 수의 접시로 나눕니다. 배아에 어류의 물에 0.2에서 2.5% 부피 사이의 에탄올 용액을 추가하고 원하는 노출 시간 후 최대 24시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다.

정량적 PCR을 위한 mRNA를 수집하기 위해 특정 발달 기간 동안 물을 함유한 에탄올을 신선한 배아 물로 교체합니다. H와 일치하는 배아를 einor tube에 배치합니다. 물고기 물을 제거하고 TCEP로 용해 완충액을 추가합니다.

전동 분쇄기를 사용하여 배아를 물리적으로 해리한 다음 원심분리기에 넣어 천천히 회전시킵니다. 용질을 pre-clear column으로 옮긴 다음 column을 원심분리합니다. 분리된 큰 조각을 제거합니다.

RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다. 그런 다음 QPCR 또는 마이크로어레이 분석을 위한 표준 방법을 사용하여 CDNA를 합성하여 C에서 2개의 혼성화 및 항체 진술을 위한 배아를 준비합니다. 수정 후 6-24시간 동안 4%파라 포름알데히드에 밤새 섭씨 4도에서 3회 세척하고 PBS에 0.1%tween을 더한 후

현미경 아래에서 두 개의 날카로운 집게를 사용하여 choon을 제거합니다. 그런 다음 메탄올 농도를 증가시키고 PBT 농도를 감소시키는 일련의 액체 변화를 사용하여 배아를 메탄올로 이동합니다. 배아를 100% 메탄올로 옮긴 후 연골을 염색하기 위해 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

수정 후 5일 또는 6일까지 배아를 올립니다. 섭씨 4도에서 4% 파라폼 알데히드로 밤새 고정하십시오. 그런 다음 PBT로 세 번 세척하여 에탄올 노출로 인해 어떤 유전자 발현 수준이 변했는지 확인합니다.

먼저 프라이머를 검증하기 위해 프라이머를 설계하여 QPCR을 수행합니다. 세 가지 생물학적 샘플로 테스트하십시오. 이러한 대조군 생물학적 샘플은 관심 유전자가 특정 연령에서 발현되는 한 모든 연령이 될 수 있습니다.

프라이머가 확인되면 이전에 준비된 CDNA를 사용하여 QPCR 실행 샘플을 3회에 걸쳐 수행하고 제브라피시 대조군에 대한 대조 샘플을 포함하여 프라이머를 사용하여 dh를 갭합니다. DH 수준을 갭으로 만들기 위해 결과를 정규화합니다. 그런 다음 강력한 방법을 사용하여 유전자 발현의 상대적 수준을 계산합니다.

야생형에 비해 실험에서 차이를 나타내는 두 개의 델타 델타 CT의 변형. C에서 두 개의 혼성화 구조. 관심 유전자에 ribo 프로브를 도랑 라벨링합니다.

그런 다음 표준 조건을 사용하여 연령이 일치하는 배아로 배양하고 알칼리성 인산가수분해효소를 사용하여 혼성화 패턴을 검출하고, 해부 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화하여 형태 발생 발달을 평가합니다. 먼저 파라 포름알데히드에 배아를 고정합니다. 그런 다음 이미지를 수집하여 유충 염색에서 발달 중인 연골 구조에 대한 알코올 처리의 효과를 조사합니다.

제브라피시가 lc와 blue를 사용하여 몇 시간 동안 밤새 이미징 전에 배아를 억류하고 제거하도록 수정했습니다. PBS에서 밀리리터당 5밀리그램의 에인 오렌지를 1시간 동안 배양하여 살아있는 배아의 세포 사멸을 분석합니다. PBS에서 배아를 세 번 세척한 다음 배아를 슬라이드에 장착하고 컨포칼 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화한 다음 Z 시리즈를 사용하여 복합재를 만듭니다.

에탄올 노출로 인해 발현이 감소한 유전자를 확인한 후, 관심 유전자에 대한 capped mRNA의 나노리터당 25-200 피코그램을 1-2개의 cell stage에 주입합니다. 알이 돔 단계에 도달할 때까지 섭씨 28도로 가열된 인큐베이터에서 회복되도록 한 다음 이전과 같이 에탄올로 처리합니다. 에탄올 노출로 인해 발현이 증가한 유전자의 경우, 1-2개의 세포기 배아에 피코그램에서 나노그램 단위의 안티센스 모르포스를 주입하여 유전자를 무너뜨립니다.

이 프로토콜은 캡핑된 mRNA의 프로토콜과 유사합니다. mRNA를 주입하는 경우, 스플라이싱 모르포(morpho)를 사용하여 효율을 측정하고, R-T-P-C-R을 사용하여 스플라이싱된 전사체와 슬라이스되지 않은 전사체의 양을 비교하여 용량 의존적 유전자 활성을 분석하고, 주입된 모리노를 적정하고, 배아가 에탄올로 처리하기 전에 원하는 단계로 발달하도록 합니다. 얼룩말 물고기 배아가 에탄올에 노출되면 다른 척추 동물에서 발견되는 표현형과 관련된 여러 가지 발달 및 유전적 결함이 발생합니다.

Noor를 포함한 축 조직의 비정상적인 발달은 noord가 짧아지고 때때로 파괴되며, 이는 부분적으로 여기에서 볼 수 있듯이 나중에 somites의 이상을 초래합니다. 처리되지 않은 대조군은 강한 갈매기 모양을 가지고 있지만 에탄올 처리된 소마이트는 감소된 음파 고슴도치 신호로 볼 수 있는 U자형 모양을 취합니다. 여기에서 볼 수 있듯이.

에탄올 노출의 또 다른 결과로, 초기 발달 지연과 그에 따른 Noor 결함의 하류일 수 있는 것은 배아 길이 단축입니다. 이 발견은 발달 중 에탄올에 노출된 어린이에서 발견되는 사춘기 이전의 저신장 지속성과 유사하며, 제브라피시 모델이 이러한 인간의 선천적 결함을 이해하는 데 관련이 있음을 시사합니다. 동물 모델에서 심각한 에탄올 노출이 synthia 및 opia를 포함한 뚜렷한 태아 알코올 증후군 표현형을 유발한다는 것이 입증되었습니다.

제브라피시의 경우, 안구 내 거리 또는 IOD는 인간 선천적 기형의 특성과 일치하는 에탄올 용량 의존적 방식으로 감소합니다. 아편은 매우 높은 용량에서만 발견되지만, 더 낮은 용량에서는 IOD가 크게 감소하며, 이는 이 동물 모델이 정중선 안면 발달에서 유사한 결함을 가지고 있음을 시사합니다. 이 그림에서는 처리되지 않은 배아와 에탄올 처리된 배아에서 6개의 3 B 및 glee 1의 초기 유전자 발현 수준을 비교합니다.

두 유전자 모두 에탄올 처리된 샘플에서 감소된 발현 수준을 보여주었습니다. NC 2 혼성화를 사용하여 six three B 및 gooID에 대한 발현 패턴을 분석했습니다. 여기서, 두 유전자 모두 처리되지 않은 대조군에 비해 에탄올 처리된 배아에서 공간 발현의 감소를 보여주었습니다.

두 유전자 모두 C 두개안면 정중선 조직이 될 운명의 조직에서 발현되기 때문에 수정 후 8시간 후에 감소하는 것은 나중에 발달 과정에서 IOD가 감소하는 것과 일치합니다. 에탄올의 영향을 받는 유전자가 확인되면 그 발현을 늘리거나 줄일 수 있는 메커니즘이 있습니다. 이 예시에서, 글리 원 레벨을 증가시키는 리간드인 음파 고슴도치에 mRNA를 주입하고, 글리 원과 에탄올 처리된 배아의 감소로 인한 총체적 결함을 구제했습니다.

그러나 6 개의 3 B를 주입하면 에탄올에 노출 된 표현형을 구출 할 수 없었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 발달 중인 제브라피시 배아인 에탄올이 생성하는 유전적 및 발달 결함을 탐색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에 사용된 기술은 발달 중인 척추동물 배아의 다른 수용성 화합물의 독성을 연구하고자 하는 사람들에게도 적용될 수 있습니다.