태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

이 실험 절차의 전반적인 목표는 에탄올 노출이 제브라피쉬의 발달에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 초기 발달 단계의 제브라피쉬를 일반 배아 배양액에 에탄올 용량을 투여하여 노출시킵니다. 그 다음, 에탄올을 제거하고 물고기가 원하는 시점까지 발달하도록 둡니다.

그 후, 대조군 배아와 비교하여 처리군 배아에서 육안으로 확인 가능한 물리적 변화와 유전자 발현의 변화를 분석합니다. 마지막으로, 에탄올로 유도된 발달 결함이 변화될 수 있는지 확인하기 위해 mRNA, morpholino 또는 약물을 사용하여 배아를 조작합니다. 최종적으로, quantitative PCR과 in situ hybridization의 조합을 통해 발달 중인 제브라피쉬 배아에 미치는 에탄올의 영향이 유전자 발현 변화와 연관되어 있음을 보여줍니다.

이후 유전자 발현 수준을 조절함으로써 에탄올로 인한 발달 결함을 개선하거나 예방할 수 있습니다. 오늘 시연할 기술은 태아 알코올 증후군의 본질에 대한 지식을 확장할 뿐만 아니라 척추동물의 발달 과정을 보존하는 데 기여합니다. 배아에 에탄올을 처리하는 과정은 저희 실험실의 기술원인 Steph Erhardt가 시연하겠습니다.

야생형 교배를 통해 배아를 돔 단계(dome stage)까지 28 °C의 배아 배양액(embryo water)에서 배양합니다. 한 클러치(clutch)의 배아를 디시당 10~50개씩 원하는 수의 디시에 나누어 담습니다. 어류 배양액(fish water)에 0.2~2.5% v/v 농도로 희석한 에탄올 용액을 배아에 첨가하고, 원하는 노출 시간이 지난 후 최대 24시간 동안 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.

정량적 PCR을 위한 mRNA를 수집하기 위해, 발달의 특정 기간 동안 물을 포함한 에탄올을 신선한 배아수로 교체하십시오. H 매칭 배아를 에펜도르프 튜브에 넣습니다. 어류 배양액을 제거하고 TCEP가 포함된 용해 버퍼를 추가하십시오.

전동 분쇄기를 사용하여 배아를 물리적으로 분리한 후, 원심분리기에 넣고 저속으로 회전시킵니다. 용액을 pre-clear 컬럼으로 옮긴 다음, 컬럼을 원심분리합니다. 이는 분리된 큰 파편들을 제거하기 위함입니다.

RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출하십시오. 그다음, QPCR 또는 마이크로어레이 분석을 위한 표준 방법을 사용하여 cDNA를 합성함으로써, in situ hybridization 및 항체 염색을 위한 배아를 준비합니다. 수정 후 6~24시간 된 배아를 4% paraformaldehyde에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 고정한 후, PBS 및 0.1% tween으로 3회 세척하십시오.

현미경 하에서 날카로운 핀셋 두 개를 사용하여 꼬리 부분을 제거합니다. 그 다음, 메탄올 농도는 높이고 PBT 농도는 낮추는 일련의 용액 교체 과정을 통해 배아를 메탄올로 옮깁니다. 배아를 100% methanol로 옮긴 후, 연골 염색을 위해 -20 °C에서 보관합니다.

수정 후 5~6일이 될 때까지 배아를 배양합니다. 4°C에서 4% 파라포름알데히드로 하룻밤 동안 고정합니다. 그 후 PBT로 3회 세척하여 에탄올 노출로 인해 어떤 유전자 발현 수준이 변화했는지 확인합니다.

먼저 프라이머를 설계하여 이를 검증함으로써 QPCR을 수행하십시오. 세 개의 생물학적 샘플을 대상으로 프라이머를 테스트합니다. 이 대조 생물학적 샘플은 관심 유전자가 해당 연령대에 발현되기만 한다면 어떤 연령의 것이든 상관없습니다.

프라이머 검증이 완료되면, 이전에 준비한 cDNA를 사용하여 qPCR을 수행합니다. 이때 샘플은 3반복으로 실행하며, 제브라피쉬 대조군을 위한 대조 샘플을 포함합니다. 대조군으로는 gapdh 프라이머를 사용합니다. 결과를 gapdh 수준으로 정규화한 후, $2^{-\Delta\Delta Ct}$ 방법을 사용하여 유전자 발현의 상대적 수준을 계산합니다.

야생형과 비교하여 실험군의 차이를 보여주는 두 가지 delta delta CT 변이. C의 경우 두 가지 하이브리드화 컨스트럭트임. 표적 유전자에 라벨링된 ribo probe.

그런 다음 표준 조건에서 연령이 일치하는 배아와 함께 배양하고, 알칼리성 인산분해효소를 사용하여 하이브리드화 패턴을 검출합니다. 해부 현미경을 사용하여 샘플의 이미지를 촬영함으로써 형태적 발달 상태를 평가하며, 예를 들어 모양을 확인합니다. 살아있는 배아의 이미지를 촬영하여 안구 간 거리와 체장을 평가합니다. 먼저 배아를 파라포름알데히드로 고정합니다. 그 다음 이미지를 수집하여 알코올 처리가 유생의 발달 중인 연골 구조에 미치는 영향을 조사하고 염색합니다.

이미징 전 배아를 고정하고 투명화하기 위해 lc와 blue를 사용하여 수 시간에서 하룻밤 동안 처리하였습니다. living embryos의 세포 사멸을 분석하기 위해 PBS에 녹인 5 mg/mL aine orange 용액에서 1시간 동안 배양하였습니다. 배아를 PBS로 3회 세척한 후 슬라이드에 마운팅하고, 공초점 현미경을 사용하여 샘플을 이미징한 뒤 Z-stack을 이용하여 합성 영상을 생성하였습니다.

에탄올 노출로 인해 발현이 감소한 유전자를 확인한 후, 관심 유전자의 capped mRNA를 25에서 200 picograms per nanoliters 농도로 1~2세포기 배아에 주입합니다. 알이 dome stage에 도달할 때까지 28 degree Celsius로 가열된 인큐베이터에서 회복시킨 다음, 이전과 동일하게 에탄올로 처리합니다. 에탄올 노출 결과로 발현이 증가한 유전자의 경우, 1~2세포기 배아에 picogram에서 nanogram 양의 antisense morphos를 주입하여 이를 넉다운(knock down)시킵니다.

이 프로토콜은 캡핑된 mRNA의 프로토콜과 유사합니다. mRNA 또는 스플라이싱 morpho를 주입하는 경우, R-T-P-C-R을 사용하여 스플라이싱된 전사체와 스플라이싱되지 않은 전사체의 양을 비교함으로써 효율을 측정하여 용량 의존적 유전자 활성을 분석하고, 주입하는 morino의 양을 적정하며, 에탄올로 처리하기 전에 배아가 원하는 단계까지 발달하도록 둡니다. 제브라피쉬 배아를 에탄올에 노출시키면 다른 척추동물에서 발견되는 표현형과 관련된 여러 발달 및 유전적 결함이 발생합니다.

Noor를 포함한 축 조직의 비정상적인 발달은 noord의 단축 및 때때로 단절을 초래하며, 이는 여기서 보여주는 바와 같이 이후 체절의 이상으로 부분적으로 이어집니다. 처리하지 않은 대조군은 강한 셰브론(chevron) 형태를 띠는 반면, 에탄올 처리된 체절은 sonic hedgehog 신호 전달 감소 시 나타나는 U자형 외형을 띱니다. 여기에서 확인할 수 있습니다.

에탄올 노출의 또 다른 결과로, 초기 발달 지연 및 그에 따른 신경 결함의 하위 단계에서 발생했을 가능성이 있는 배아 길이의 단축이 나타납니다. 이러한 발견은 발달 과정 중 에탄올에 노출된 아동들에게서 발견되는 사춘기 전 단계의 지속 및 저신장과 유사하며, 이는 제브라피시 모델이 이러한 인간 선천적 결함을 이해하는 데 적절함을 시사합니다. 동물 모델을 통해 심각한 에탄올 노출이 소두증 및 안구증을 포함하여 뚜렷한 태아 알코올 증후군 표현형으로 이어진다는 것이 입증되었습니다.

제브라피시에서 안구 간 거리(intraocular distance, IOD)는 인간의 선천적 결함 특성과 일치하게 에탄올 용량 의존적으로 감소합니다. 안구 결손(opia)은 매우 높은 용량에서만 발견되지만, 더 낮은 용량에서도 IOD의 유의미한 감소가 나타나며, 이는 이 동물 모델이 안면 중앙선 발달에서 유사한 결함을 가지고 있음을 시사합니다. 이 그림에서는 처리하지 않은 배아와 에탄올 처리 배아에서 six3b 및 gli1의 초기 유전자 발현 수준을 비교하였습니다.

두 유전자 모두 에탄올 처리된 샘플에서 발현 수준이 감소한 것으로 나타났습니다. NC 두 함께 하이브리다이제이션(two hybridization)을 사용하여 six3b와 gooid의 발현 패턴을 분석한 결과는 다음과 같습니다. 여기서 두 유전자 모두 처리되지 않은 대조군과 비교하여 에탄올 처리된 배아에서 공간적 발현이 감소한 것을 보여주었습니다.

두 유전자 모두 C 두개안면 정중선 조직이 될 조직에서 발현되므로, 수정 후 8시간에서의 발현 감소는 발생 후기에 나타나는 IOD 감소와 일치합니다. 에탄올의 영향을 받는 유전자들이 식별되면, 해당 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 메커니즘이 존재합니다. 본 예시에서는 glee one 수치를 증가시키는 리간드인 sonic hedgehog의 mRNA를 주입하였으며, 이를 통해 glee one 감소 및 에탄올 처리 배아에서 나타나는 외형적 결함을 회복시켰습니다.

하지만 six three B를 주입했음에도 에탄올에 노출된 표현형을 회복시킬 수는 없었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 발달 중인 제브라피시 배아에서 에탄올로 인해 발생하는 유전적 및 발달적 결함을 탐구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 여기서 사용된 기술은 발달 중인 척추동물 배아에 대한 다른 수용성 화합물의 독성을 연구하고자 하는 분들에게도 적용될 수 있습니다.