Name: 태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 태아 알코올 증후군 연구를 위한 제브라피시(Danio rerio) 모델에서 에탄올 노출이 유발하는 형태학적 결함과 유전자 발현 변화를 평가하는 방법을.

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우리는 현장 하이브리드화 및 mRNA의 microinjections에 대해 plasmids의 선물 몬테 Westerfield, 마코토 고바야시와 제이섹 Topczewski 감사하고 싶습니다. 우리는 비디오에 등장을위한 스테파니 Erhard에 감사합니다. 우리는 또한 비디오에 나타난 공촛점 현미경과 윌리엄 Goossens의 도움을 인정하고 싶습니다. 타일​​러 Schwend는 동영상에 사용된 이미지를 제공하고, 로드니 데일 동영상에 대한 준비에 도움. 우리는 또한 zebrafish와의 축산 직장 CMRC 동물 관리 직원을 인정합니다. 이 작품은 SCA에 NIH 교부금 R21 AA13596에 의해 재정 지원되었다.

1. 태아의 에탄올 처리 <ol><li> 야생 형 matings에서 파생된 Zebrafish 배아는 28에서 자랐던 배아 물 5 ML에서 ° C에서. (밀리 Q 60 밀리그램 / 패 인스턴트 오션과 물). 야생 형 배아의 다양한 변종이 노출 9 에탄올 위해 약간 다른 공차 있습니다. </li><li> 에탄올에 대한 노출은 최대 24 시간 펄스로, 시간의 원하는 길이에 대한 돔 무대 (~ 4.3 시간 포스트 기름지게, hpf)에서 시작 됐습니다. 이것은 시작 단계 gastrulation에 직전 포유 동물 배아의 주입 단계와 대략적으로 비슷합니다. 에탄올 농도는 0.2 %에서 -2.5 %, 볼륨 / 볼륨 범위를 사용했습니다. 검사 물에 솔루션의 25-50 사이의 %는 개발 배아 10, 11에 끝나는 것을 증명하고있다. 태아도 시간의 원하는 길이에 대해 28 ° C에서 유지 관리됩니다. 에탄올 노출의 원하는 길이 후, 에탄올 - 물 용액이 제거 및 교체 정규 zebrafish 물 세 세차장와 함께 구경이 유지됩니다시간의 R 원하는 길이. 결함의 특이성은 발병, 복용량 및 에탄올의 펄스 길이의 시간에 따라 달라집니다. </li></ol> 2. 원위치 하이브리드화, 항체, 그리고 연골 염색법의 RNA에 대한 태아의 수집, <ol><li> qPCR에 대한 mRNA를 수집하려면, 연령 일치하는 배아는 eppendorf 튜브에 수집됩니다. zebrafish 물의 제거 후 TCEP과 용해 버퍼가 추가됩니다. 동력 pulverizer는 물리적으로 용해 용액의 배아를 떼어 놓다하는 데 사용됩니다. 이것은 그때 어떤 undissociated 큰 조각을 제거 preclear 칼럼을 통해 전달됩니다. 결과 솔루션은 용해 과정에서 릴리스된 모든 macromolecules가 포함되어 있습니다. RNA는 다음 세차장 및 DNAse 치료 뒤에는 칼럼에서이 솔루션을 실행하여 추출됩니다. 용리 그런 다음 물 또는 제조 업체 (5&#39;-프라임)에 의해 제공 용출 용액을 사용하여 수행됩니다. RNA은 마이크로에서 qPCR에 대한 표준 기술을 사용하여 cDNA로 변환하거나 사용할 수 있습니다배열 분석. </li><li> 원위치 하이브리드화 및 항체 염색법, 6-24에서 배아에 들어 hpf은 4 ° C.에 밤새 4 % paraformaldehyde에서 해결되었다 이것은 PBS에서 3 세차장 + 0.1 % 십대 초반 (PBT), 같이 가겠다는에서 배아를 유지하기 위해 다음됩니다. 태아도 다음 세 메탄올 일련의를 통해 전송됩니다 PBT들은 -20 ° C.에 저장될 수있는 시점에서, 100 % 메탄올로 세척 이러한 배아는 원위치 하이브리드화 또는 항체 염색법에 사용할 수 있습니다. 일부 항체는 메탄올 처리 후, 이번 경고가 고려하여 특정 항체 그것 메탄올 처리 후 작동하는지 확인하기 위해 테스트를해야 작동하지 않습니다. </li><li> 연골의 염색법의 경우 배아는 5 ~ 6 일 게시물 기름지게 (dpf)에 제기해야합니다. 그들은 다음 4에서 하룻밤 사이에 4 % paraformaldehyde에서 해결된 ° C는 PBT 3 세차장으로 따라갔다. </li></ol> 3. 평가 에탄올을 유발 유전자 발현 변경 및 발달 결과들 <ol><li&gt; 유전자 발현 수준이 변경된 것을 확인하려면, 대상 유전자는 모두 qPCR 의해 원위치 하이브리드화에서 검사합니다. qPCR 그 다음 세 별도의 생물 학적 샘플을 사용하여 유효성을 검사할 통합의 DNA 기술 (IDT) 소프트웨어 설계 primers를 사용하여 이루어진다. 일단 primers가 확인되었으며, qPCR는 수집 RNA 샘플에서 생성된 cDNA에서 수행됩니다. 각 예제는 세중의에서 실행됩니다. PCR 반응은 여러 가지 빛깔의 감지 시스템과 채도-4 PCR 기계 (BioRad) 또는 이와 유사한 PCR 기계에서 플래티넘 SYBR 녹색 qPCR 슈퍼 믹스 (Invitrogen)를 실행하고 있습니다. 심문하는 유전자 이외에, 그것은 primers 세트 컨트롤이 cDNA 또는 RNA 준비의 작은 차이의 균형을 위해 사용되는 것이 중요합니다. 우리 zebrafish 배아 들어, gapdh를 사용 5&#39;GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 &#39;과 5&#39;TTGCACCACCCTTAATGTGA3&#39;. 분석중인 유전자 그러면 유전자 발현의 상대적인 양을 정함은 2 Pfaffl 메서드 편차를 사용하여 계산됩니다 gapdh 수준으로 정규화 <sup&gt; - CT, 야생 유형 12 ~ 실험 상대의 배 차이 같은 데이터가 표시됩니다. 일반적인 계산은 모든 유전자가 모든주기 위해 두 DNA를 복제하고 있다고 가정하며 따라서 정수 &quot;2&quot;이상의 전력 계산으로 표현, 기준 유전자의 변화를 통해 실험적인 유전자의 변화의 비율로 데이터를 표현 완벽한 PCR 반응에서 볼주기에 따라 DNA의 두 배로의 효율성이되는 것입니다. Pfaffl 메서드는 선택한 PCR primers에 대한 진정한 효율성을 생성한 실험자와 일반 &quot;2&quot;를 대체합니다. 그것은 PCR 반응의 차이보다 정확한 반영을 반영합니다. 전체 수식은 다음과 같습니다 <table border="0"><tbody><tr><td> (실험적인 유전자의 효율성) (처리 샘플 컨트롤 샘플 CT-CT) </td></tr><tr><td> -------------------------------------------------- ----------------------------------- </td></tr><tr><td> (참고 유전자의 효율성) (CT의컨트롤 샘플 - 시료의 처리 CT) </td></tr></tbody></table></li><li> 원위치 하이브리드화의 내용은 digoxigenin은 (발굴) - 라벨 riboprobes는 관심 유전자의 일부를 포함하는 plasmids에서 구축하고 있습니다. 연령 일치하는 배아가 표준 조건 13 사용 riboprobes에 노출 및 컬러 반응 (NBT / BCIP)을 사용하여 레이블 riboprobes의 위치를 수 알칼리 인산 분해 효소에 결합 백신 발굴의 항체를 사용하여 감지됩니다. 태아도 그때 Leica 해부 현미경 (그림 1B-G)를 사용하여 시각 있습니다. </li><li> morphogenic 발전을 평가하기 위해 배아가 원하는 시간에 수집하고 해부 현미경으로 검사합니다. 체절 형태의 경우, 라이브 배아는 14 군데있다. 상호 눈의 거리와 몸 길이의 경우 배아는 PFA에서 수정되었습니다. 모든 경우에있어서, 원하는 지역의 이미지는 어도비 포토샵 softwar를 사용하여 촬영한 고정 배율 및 측정의 해부 현미경에 캡처되어E 10,14. </li><li> 애벌레 zebrafish의 개발 연골 구조에 대한 치료의 효과를 조사하기 위해, 우리는 Alcian 블루 염색법을 사용합니다. 몇 시간이나 야간 20 % 빙초산 (산성 알코올) : 고정 zebrafish 애벌레는 80 % 에탄올에 녹아있는 Alcian 푸른 솔루션으로 취급됩니다. 애벌레는 1 %의 코이에 전송되기 전에 산성 알코올의 몇몇 세차장에서 destained됩니다 안료 세포의 더욱 지워 위해 3 % 과산화수소 용액. Zebrafish는 연골 구조를 보여줄 오래된 최소 4 일이 될 필요가 있으며 이들은보다 5 ~ 6 일이 지나면 물고기는에 정의됩니다. </li><li> 살아있는 배아에서 세포 사망은 Acridine 오랜지 (AO)를 사용하여 평가됩니다. AO는 살아있는 세포에 대한 세포 투과되지이며, apoptosis과 괴사를 겪고 포함 훼손 세포막과 세포의 DNA에 바인딩합니다. 생활 배아는 PBS 3 세차장 다음, 1 시간 동안 PBS에 5 밀리그램 / ML AO와 incubated있다. 태아도 다음 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 디지털 Z-백산이거야 이미지 합성을 만들 결합됩니다. </li></ol> 4. Zebrafish 배아를 조작 <ol><li> 에탄올 노출에 의해 감소​​되는 유전자의 식별 후, 부족한 부분이 유전자를 대체하기위한 mRNA의 분사를 사용하여 그들을 바꾸려고하는 것이 가능합니다. 뒤덮힌 mRNA는 제조 업체 지침 (mMessage 기계, 응용 Biosystems)에 따르면 시험 관내 전사 키트에서 RNA의 효소를 사용하여 선형의 DNA plasmids에서 베꼈는데됩니다. 25-200 사이 RNA의 PG / NL은 0.1 M KCl의 솔루션, 1-2 세포 단계 zebrafish 달걀에 주입된다. 태아도 후 (그림 5) 위에서 설명한대로 에탄올로 치료되기 전에 복구하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 에탄올 노출에 의해 증가하고있는 유전자 사본의 경우, 그들은 &quot;노크 다운&quot;안티 센스 morpholino 기술을 사용하여 축소하거나 할 수 있습니다. 안티 센스 morpholinos (아모스)은 회사의 유전자 도구에 의해 디자인, 그리고 단백질로 RNA의 번역을 차단하거나, blo있다실험적인 필요성에 따라 RNA의 CK는 성숙과 접합. morpholinos의이 작업은 타겟 유전자, 그들이 가능한 경우 anitibodies를 사용하여 측정할 수 적자에 대해 활성 단백질의 양을 제한합니다. RNA의 접합에 morpholinos의 효율성 spliced​​ 및 unspliced​​ 성적의 상대적 양을 감지하는 RT-PCR을 사용하여 측정할 수있다. morpholino의 Titrating 것은 선량 종속적인 활동을 15 발생할 수 있습니다. 아모스는 Danieau 솔루션에서 작업 농도 (NG 농도를 PG를 titrated) (58 MM NaCl 0.7 MM KCl, 0.4 MM MgSO 4, 0.6 MM 칼슘 (NO 3) 2, 5 밀리미터 HEPES, 산도 7.6)으로 희석한다. 사출은 배아는 위의 치료를 에탄올에 노출되기 전에 개발을 허용하는 다음 1-2-세포 단계에서 이루어진다. </li></ol> 5. 대표 결과 관련된 발달과 유전적 결함의 수가 에탄올 결과에 Zebrafish 배아 노출phenotypes는 다른 척추 동물에서 발견. 우리는 notochord (데이터가 14 보이지 않음)를 포함하여, 축방향 조직의 비정상적인 발전을 문서화했습니다. 에탄올에 의해 생산된 발달 지연은 분명히 단축하고 때때로 중단 notochord (데이터가 14 보이지 않음)로 이어지는, 올바른 notochord 신장의 장애로 안내합니다. 이것은 초기 지연과 notochord 결함 가능성이 경과 컨트롤에서 본 것처럼 그들의 강한 셰브론 모양을 잃었 somites에서 나중에 이상 (그림 2)에 부분적으로 주도하고, 본 phenotypes의 특징 U 형 somites에 가까이있다 음파 신호가 14 감소합니다. somites의 각도가 표준 소프트웨어 및 92.1에서 ± 4.6 ° 치료 컨트롤에서 122.6로 ± 6.6 ° 에탄올 취급 배아 (P &lt;0.001)의 각도 증가를 사용하여 측정할 수있다. downstrea있을 에탄올 노출의 또 다른 결과초기 발달 지연과 나중 notochord 결함의 상부 배아의 단축 길이 (그림 3)입니다. 심지어 배아는 계좌로 에탄올 노출에 의해 생산되는 곡률을 측정하기 위해, 에탄올 노출 (3E 14 그림) 배아에 노출되었다 에탄올의 복용량에 따라 달라집니다 단축 트렁크로 안내합니다. 이 조사는 zebrafish 모델은 인간의 선천성 이상에 대한 이해를위한 관련성을 제안, 개발 16, 17 중 에탄올에 노출된 어린이에서 발견 prepuberty 짧은 성장의 지속성과 비슷합니다. FAS의 고전적인 특징 중 하나는 낮은 턱, 작은 눈 개방, 그리고 부드러운 philtrum 포함한 고전 facies입니다. 대부분 이러한 기능의 대부분은 중간선 조직의 감소와 관련있다. 이것은 심각한 에탄올 노출 synopthalmia 및 cyclopia 포함한보다 발음 phenotypes,로 연결되는 동물 모델에서 증명되었습니다. 언제 엑스포에탄올의 증가 복용에 zebrafish의 배아를 부르 intraocular 거리 (IOD)는 인간의 출생 결함의 특성과 일치합니다 (그림 4) 복용에 의존 방식으로 줄어 듭니다. Cyclopia은 매우 다량으로 복용과 함께 발견되지만 낮은 복용이 동물 모델은 중간선 얼굴 개발에 10의 유사한 결함을 갖고 제안, IOD (그림 4)에서 상당한 감소를 생산 않습니다. 에탄올 노출에 의해 생산 몸과 얼굴 모두에서 결함의 기본 메커니즘을 이해하려면, 우리는 개발 초기에 발생하며이 합리적으로 나중에 발달 결함에 기여할 것으로 기대 수도 유전자 발현 변화를 설립 모색하고 있습니다. 우리는 두 가지 방법으로이 작업을 수행, 배아에서 mRNA의 추출 컨트롤 (그림 1A)에 비해 에탄올 취급 배아의 유전자 발현의 수준의 양적 평가 수 있습니다. 또한 현장에서 수행할 수하이브 리다이 제이션에 관계없이 신호 (그림 1B-G 18) 감소 여부, 유전자의 패턴을 볼 수 있습니다. 이 예제에서는 누구의 표현 에탄올에 노출 후 감소 둘이 같이 유전자는 gli1 및 six3b가 표시됩니다. 우리가 six3b위한 원위치 패턴으로 검사했을 때, 우리는 에탄올에 노출된 태아에서이 유전자의 표현의 공간적 범위 (그림 1 EG)의 감소를 찾았지. 유사한 감소는 유전자 gsc (그림 BD)에서 발견되었다. six3b 및 gsc 모두 craniofacial 중간선 조직에 공헌하고 운명 티슈로 표현됩니다. 그래서 8 hpf에서 이러한 유전자의 감소는 나중에 그림 4와 같이 발견 IOD의 감소와 일치합니다. 에탄올의 영향을받는 유전자가 발견되면, 그들의 표현이 증가 또는 감소시킬 수있는 의해 메커니즘이 있습니다. 이 특정 EXA에서mple, 우리는 qPCR에 의해 감소되는 두 유전자 (gli1 및 six3b) 보여주었다. 우리는이 유전자 변화를 반대하는 것은 결과를 향상시킬 수 있는지 확인하기 위해 mRNA를 투입하기로 결정했습니다. 본 실험 대신 gli1 주입으로, 우리는 쉬, gli1 수준을 증가 리간드를 투입하기로 결정했습니다. six3b 들어, six3b 자체를 주입 수 있었다. 우리는 six3b합니다 (데이터가 표시되지 않음) 주입하지만, 근본적으로 보완 쉬 주사 (그림 5)와 zebrafish 배아의 총 결함을 구조할 수 있었다 아무런 변화가 없습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig1.jpg" /> 그림 1. 에탄올 노출 초기 패턴과 선택된 발달 유전자의 유전자 발현 수준을 변경합니다. 8hpf에서 배아의) qPCR 결과입니다. 이 유전자에 대한 결과가 표시됩니다 six3b 및 gli1합니다. 결과는 별도의 세 가지 실험을 평균으로 표시그리고 표시된 에탄올의 복용량은 2.5 %이다. 두 유전자가 제어 (T-테스트, P &lt;0.05)에서 중요하다 방식으로 감소됩니다. 8 hpf의 zebrafish의 배아의 원위치 하이브리드화에서 BG). gsc 및 six3b 패턴이 모두 컨트롤에 비해 현재의 시점에서 변경될 수 있습니다. (Loucks 외. 2007 년부터 허가 수정). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig2.jpg" /> 그림 2. 체절 개발은 대우 배아로 변경됩니다. 체절 구조와 앵글은 48 hpf에서 검사합니다. 제어 배아에서 () somites는 셰브론 형상과 날카로운 각도로되어 있습니다. 에탄올 노출 zebrafish는 더 또는 U 형 somites하고, 덜 날카로운 각도로되어 있습니다. (Loucks 및 Ahlgren 2,009의 허가와 함께 수정). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig3.jpg" /> 그림 3. 에탄올 치료는 크게 zebrafish에서 몸 길이를 줄입니다.치료 및 에탄올 노출된 태아의 길이는 5 일 postfertilization에서 측정되었다. 길이가 크게 감소 (ANOVA, P &lt;0.001) 모든 치료 배아에서 본되었다. BD. 큰 감소는 2.0 %와 2.5 %의 에탄올과 함께 복용한 배아 모습을 본 반면, 1.0 % 및 1.5 %의 에탄올로 치료 배아의 전체 길이는 약간이지만 상당한 감소가 발생했습니다. 각 클러치의 크기 차이에 대한 제어하려면 E., 각 실험의 제어 배아는 100으로 정규화하고, 형제 취급 배아는 100의 비율로 표현되었다. (Loucks 및 Ahlgren 2,009의 허가와 함께 수정). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig4.jpg" /> 그림 4. zebrafish 배아에서 intraocular 거리 (iod)의 감소에서 에탄올 노출 결과. ) 배아의 정면 전망 정상과 융합된 눈 phenotypes를 보여줍니다. 나) 에탄올의 다양한 복용은 gastrulation의 고해상도 동안 3 시간 동안 실시물고기는 24 시간 후에 검사하는 경우에 ults이 iod 감소. 융합된 눈과 cyclopia은 (2.4 %) 검사 높은 복용량에서 볼 수 있습니다. *이 컨트롤에 비해 iod에 큰 감소를 나타냅니다. (Ahlgren 2004에서 허가 수정). <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig5.jpg" /> 그림 5. 쉬 - N 개의 mRNA 주입은 zebrafish의 에탄올 노출에 의해 생산되는 총 결함을 구출. 하나, 둘, 세포 배아는 100 PG / NL 쉬 - N의 mRNA와 주입된 배아의 절반은 4.3-24 hpf에서 표준 에탄올 접종에 노출되었다 주사되었다. 태아은 5 dpf에서 분석했다. 2.0 %의 에탄올로 치료 태아는 dorsally 짧은 꼬리, 난 모양 somites 및 cyclopia 포함한 시력 결함 구부러져냅니다. 이러한 phenotypes의 구조는 주입된 배아 (93 %)의 76분의 71에서 볼 수있다. 이러한 배아에서 몸은 똑바로, somites는 셰브론 모양입니다 있으며, 눈은 완전히 구분됩니다.

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<li>Chrisman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+ethanol+exposure+disrupts+the+expression+of+FGF8+and+Sonic+hedgehog+during+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Gestational ethanol exposure disrupts the expression of FGF8 and Sonic hedgehog during limb patterning.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 70 (4), 163-171 (2004).</li>
</ol>

우리는 공개 할게 없다.

방법은 여기서 설명하고 표시된 결과는 zebrafish가 발달 결함을 심문하는 데 사용할 수있는 방법 중 팁을 보여줍니다. 때문에 태아의 접근으로, 각 클러치, 그리고 결과의 높은 재현성을 위해 알을 낳았의 높으면 이러한 척추 동물은 teratogenic 연구에 이상적입니다. 물고기는 또한 특정 유전자 또는 이익 19 경로에 대한 시각적 기자로 사용하는 형광 분자를 포함하도록 조작할 수 있습니다. 에탄올 연구에 사용되는 접종은 포유류의 혈중 알코올 농도 수치에 비해 상당히 높은 나타납니다. 그러나 이러한 수치는 물 속에 존재하는 것을 반영하고, 모든 에탄올의 대부분은 태아에게 전달됩니다. 함께 촬영, 설명 그리고 위의 설명된 방법은 zebrafish 배아는 에탄올 노출에 관련된 인간의 출생 결함을 모델링에 매우 유용하는 것이 좋습니다. 또한, zebrafish에있는 유전자 발현 변경은 다른 사용자가 확인되었습니다에탄올의 발달 효과는 척추 동물에 걸쳐 유지되는 제안 포유 동물 모델 시스템 20 인치 위에서 보여주는 기술 중 대부분이 쉽고 빠르게 잠재 teratogens를 검색하고 특정 물질의 teratogenesis에 기여하는 기본 메커니즘을 결정하기 위해 다른 환경이나 제약 모욕 함께 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 조직 RNA 키트 : 5 - 프라임 PerfectPure </td><td> 피셔 과학 </td><td> FP2302410 </td></tr><tr><td> 플래티넘 SYBR 녹색 qPCR SuperMix-UDG </td><td> Invitrogen </td><td> 11733038 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine 높은 수율은 RNA의 전사 키트를 공을 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 당신의 플라스미드에 RNA의 효소에 따라 다름 </td></tr></tbody></table>

태아 알코올 노출의 zebrafish 모델에서 teratogenic 변경 사항 평가

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

태아 알코올 증후군 (FAS)은 에탄올에 배아 노출 심각한 징후이다. 그것은 얼굴과 섞여 및 손상된 뇌 발달로 인해 정신 지체를 포함한 장기에 특색있는 결함과 함께 소개합니다. 태아 알코올 스펙트럼 장애 (FASD)는 모성 알코올 소비로 인해 발생하는 선천적 결함의 연속체를 충당하기 위해 사용되는 용어이며, 미국에서 태어난 어린이의 약 4 %에 발생합니다. 어린이 베어링 연령 여성의 50 %가 알코올의 소비를보고, 모든 임신의 절반은 계획되지 않은 있기 때문에 무심코 노출은 지속적인 문제 2입니다. 최고의 에탄올에 의해 생산되는 피해를 이해 플러스 잠재적인 개입을 테스트하기위한 모델을 생성하기 위해, 우리는 zebrafish 배아를 사용하여 발달 에탄올 노출 모델을 개발했습니다. Zebrafish는 teratogen 연구 3-8 이런 종류의 이상적입니다. 각 쌍은 다음 성인을 해치지 않고 수집될 수 계란 수백을 낳는생선. zebrafish 배아가 투명하고 쉽게 얼룩의 번호를 몇 군데하실 수 있습니다. 이러한 배아 분석 에탄올 제작한 총 발달 결함이 인간의 선천성과 일치하는 기간 및 응용 프로그램의 다른 복용 및 시간에서 에탄올에 노출 후. zebrafish FAS 모델을 연구하고 조작하는 데 사용되는 기본적인 방법은 다음과 같습니다 여기서 설명했다.

에탄올로 유도된 발달 손상의 분자 메커니즘을 이해하려면, 우리는 에탄올 노출 zebrafish 모델을 개발하고 에탄올에 노출된 후 발생하는 신체적, 세포 및 유전자 개조를 연구하고<sup&gt; 1</sup&gt;. 그러면 잠재적인 개입을 찾아 신속하게이 동물 모델에서 그들을 시험을 추구합니다.

태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

태아 알코올 증후군(FAS)은 배아기의 에탄올 노출로 인해 나타나는 심각한 증상입니다. 이는 얼굴과 장기의 특징적인 결함으로 나타나며, ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 에탄올 노출이 발달 중인 제브라피쉬에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 초기 발달 단계의 제브라피쉬를 일반 배아 배양액에 포함된 에탄올 용량에 노출시킵니다. 그 다음, 에탄올을 제거하고 물고기가 원하는 시점까지 성장하도록 합니다.그런 다음, 대조군 배아와 비교하여 처리군 배아에서 외형적인 물리적 변화와 유전자 발현의 변화를 모두 분석합니다. 마지막으로, 에탄올로 유도된 발달 결함이 변화될 수 있는지 확인하기 위해 mRNA, morpholino 또는 약물을 사용하여 배아를 조작합니다. 궁극적으로, quantitative PCR과 in situ hybridization의 조합을 통해 발달 중인 제브라피시 배아에 미치는 에탄올의 영향이 유전자 발현 변화와 연관되어 있음을 보여줍니다.이후 유전자 발현 수준을 조절함으로써 에탄올로 유도된 발달 결함을 개선하거나 예방할 수 있습니다. 오늘 시연할 기술은 태아 알코올 증후군의 본질에 대한 지식을 확장할 뿐만 아니라 척추동물의 발달 과정을 보존합니다. 배아에 에탄올을 처리하는 과정은 저희 실험실의 기술원인 Steph Erhardt가 시연하겠습니다.야생형 교배를 통해 배아들을 배아수로 채운 28 °C 인큐베이터에서 돔 단계까지 배양합니다. 한 클러치의 배아들을 디시당 10~50개씩 나누어 원하는 개수의 디시에 분배합니다. 어류수로 희석하여 부피 비율 0.2~2.5%의 에탄올 용액을 배아에 첨가하고, 원하는 노출 시간이 지난 후 최대 24시간 동안 인큐베이터로 되돌려 둡니다.정량적 PCR을 위한 mRNA를 수집하기 위해, 배아의 특정 발달 기간 동안 물을 포함한 에탄올을 신선한 배아 배양액으로 교체합니다. H matched 배아를 에펜도르프 튜브에 넣습니다. 어류 배양액을 제거하고 TCEP가 포함된 용해 버퍼를 추가합니다.전동 분쇄기를 사용하여 배아를 물리적으로 해리시킨 후, 원심분리기에 넣고 저속으로 회전시킵니다. 용해물을 프리클리어 컬럼(pre-clear column)으로 옮긴 다음, 컬럼을 원심분리합니다. 이는 해리된 커다란 조각들을 제거하기 위함입니다.RNA 분리 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다. 그런 다음 QPCR 또는 마이크로어레이 분석을 위한 표준 방법으로 cDNA를 합성하여, embryo를 *in situ* hybridization 및 항체 염색에 맞게 준비합니다. PBS 및 0.1% tween으로 3회 세척한 후, 수정 후 6~24시간이 경과한 embryo를 4% paraformaldehyde에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다.현미경 하에서 날카로운 핀셋 두 개를 사용하여 외배엽(choon)을 제거합니다. 그다음, 메탄올 농도는 높이고 PBT 농도는 낮추는 연속적인 액체 교체 과정을 통해 배아를 메탄올로 옮깁니다. 배아를 100% methanol로 옮긴 후, 연골을 염색하기 위해 -20 °C에서 보관합니다.배아를 수정 후 5일 또는 6일까지 배양합니다. 4°C에서 4% paraform aldehyde로 하룻밤 동안 고정합니다. 그 다음 PBT로 세 번 세척하여 에탄올 노출에 의해 어떤 유전자 발현 수준이 변화했는지 확인합니다.먼저 프라이머를 설계하여 검증함으로써 QPCR을 수행합니다. 세 개의 생물학적 샘플을 대상으로 프라이머를 테스트하십시오. 이러한 대조군 생물학적 샘플은 관심 유전자가 해당 연령대에 발현되기만 한다면 어떤 연령대라도 무관합니다.프라이머 검증이 완료되면, 이전에 준비한 cDNA를 사용하여 qPCR을 수행합니다. 시료는 3회 반복 측정하며, 제브라피쉬 대조군을 위한 대조 시료를 포함합니다. 우리는 gapdh 프라이머를 사용하며, 결과를 gapdh 수준으로 표준화합니다. 그 다음, 2^(-ΔΔCt) 방법을 사용하여 유전자 발현의 상대적 수준을 계산합니다.야생형 대비 실험군의 차이를 보여주는 두 가지 delta delta CT 변이. C의 경우, 두 가지 하이브리드 작제물. 표적 유전자에 라벨링된 ribo 프로브.그 다음, 표준 조건에서 연령이 일치하는 배아와 함께 배양하고, 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 사용하여 하이브리드화 패턴을 검출합니다. 해부 현미경을 통해 샘플의 이미지를 촬영하여 형태 발생 발달 상태(예: 머리 모양)를 평가합니다. 살아있는 배아의 이미지를 촬영하여 안구 간 거리와 체장을 평가합니다. 먼저, 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 배아를 고정합니다. 그 다음, 유충 염색 단계에서 알코올 처리가 발달 중인 연골 구조에 미치는 영향을 조사하기 위해 이미지를 수집합니다.이미징 전 배아를 고정하고 투명화하기 위해 lc와 blue를 사용하여 수 시간에서 하룻밤 동안 처리하였습니다. 살아있는 배아의 세포 사멸을 분석하기 위해 PBS에 희석된 5 mg/mL acridine orange 용액에서 1시간 동안 배양하였습니다. 배아를 PBS로 3회 세척한 후 슬라이드에 마운트하고, 공초점 현미경을 사용하여 샘플을 촬영한 뒤 Z-stack을 이용하여 합성 이미지를 생성하였습니다.에탄올 노출로 인해 발현이 감소한 유전자를 확인한 후, 관심 유전자의 캡핑된 mRNA를 1~2세포 단계에 25~200 pg/nL의 농도로 주입합니다. 알이 돔 단계(dome stage)에 도달할 때까지 28 °C로 가열된 배양기에서 회복시킨 후, 이전과 동일하게 에탄올로 처리합니다. 에탄올 노출 결과 발현이 증가한 유전자의 경우, 1~2세포 단계의 배아에 pg에서 ng 양의 안티센스 모르포(antisense morphos)를 주입하여 발현을 억제합니다.이 프로토콜은 캡핑된 mRNA에 대한 방법과 유사합니다. mRNA 또는 스플라이싱 morpho를 주입하는 경우, R-T-P-C-R을 사용하여 스플라이싱된 전사체와 스플라이싱되지 않은 전사체의 양을 비교하여 효율을 측정함으로써 용량 의존적 유전자 활성을 분석하십시오. 주입하는 morphino의 농도를 적정하고, 에탄올로 처리하기 전 배아가 원하는 단계까지 발달하도록 하십시오. 제브라피시 배아를 에탄올에 노출시키면 다른 척추동물에서 발견되는 표현형과 관련된 다수의 발달 및 유전적 결함이 나타납니다.Noor를 포함한 축 조직의 비정상적인 발달은 noord의 단축 및 때때로 단절을 초래하며, 이는 여기에서 보여지는 바와 같이 이후 체절의 이상으로 일부 이어집니다. 처리하지 않은 대조군은 강한 쉐브론(chevron) 모양을 띠는 반면, 에탄올 처리된 체절은 sonic hedgehog 신호 전달이 감소했을 때 나타나는 U자형 외형을 보입니다. 여기에서 확인할 수 있습니다.에탄올 노출의 또 다른 결과로, 초기 발달 지연 및 그에 따른 신경 결함의 하위 단계에서 발생했을 가능성이 있는 배아 길이의 단축이 나타납니다. 이러한 발견은 발달 과정 중 에탄올에 노출된 아동에게서 발견되는 사춘기 전 단계의 지속 및 저신장증과 유사하며, 이는 제브라피쉬 모델이 이러한 인간 선천성 결함을 이해하는 데 적합함을 시사합니다. 동물 모델을 통해 심각한 에탄올 노출이 소두증(microcephaly) 및 안구 기형(anophthalmia)을 포함하여 뚜렷한 태아 알코올 증후군 표현형을 유발한다는 것이 입증되었습니다.제브라피시에서 안구 간 거리(intraocular distance, IOD)는 인간의 선천성 결함 특성과 일치하게 에탄올 용량 의존적으로 감소합니다. 안구 결손(Opia)은 매우 고농도의 용량에서만 발견되지만, 저농도 용량에서도 IOD의 유의미한 감소가 나타나며, 이는 이 동물 모델이 안면 정중선 발달에서 유사한 결함을 가지고 있음을 시사합니다. 본 그림에서는 처리하지 않은 배아와 에탄올을 처리한 배아에서 six3b 및 glee1의 초기 유전자 발현 수준을 비교하였습니다.에탄올 처리된 샘플에서 두 유전자 모두 발현 수준이 감소한 것으로 나타났습니다. NC 두 하이브리드법을 사용하여 six3b 및 gooid의 발현 패턴을 분석한 결과는 다음과 같습니다. 여기서 두 유전자 모두 처리되지 않은 대조군에 비해 에탄올 처리된 배아에서 공간적 발현이 감소한 것을 보여주었습니다.두 유전자 모두 C 두개안면 중앙선 조직으로 발달할 조직에서 발현되므로, 수정 후 8시간째에 이들의 발현이 감소하는 것은 발달 후기에 IOD가 감소하는 것과 일치합니다. 에탄올의 영향을 받는 유전자가 식별되면, 해당 유전자의 발현을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 기전이 존재합니다. 이 예시에서는 gli1 수치를 높이는 리간드인 sonic hedgehog의 mRNA를 주입하였으며, 이를 통해 gli1 감소 및 에탄올 처리 배아에서 나타나는 외형적 결함을 회복시켰습니다.하지만 six three B를 주입해도 에탄올에 노출된 표현형을 회복시킬 수 없었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 발달 중인 제브라피시 배아에서 에탄올로 인해 발생하는 유전적 및 발달적 결함을 탐구하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 여기서 사용된 기술들은 발달 중인 척추동물 배아에 대한 다른 수용성 화합물의 독성을 연구하고자 하는 분들에게도 적용될 수 있습니다.

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연구

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Medicine

의학

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태아 알코올 노출의 Zebrafish 모델에서 Teratogenic 변경 사항 평가

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