Name: 전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 학습하세요 마우스 정자 동결보존 및 복구 기술을 I•Cryo 키트를 사용하여 체외수정에 활용하는 방법을. 유전자 변형 마우스 계통 보존에 필수적인 생식생물학 기법입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

여기에 제시 연구는 찰스 강에 의해 지원되었다. 저자는 동물 보호와 호르몬 주사를위한 유전자 조작 모델 및 서비스 그룹과 발생학 직원에게 가장 감사하고 있습니다.

1. 마우스 정자 cryopreservation <ol><li> cryopreserved하는 각 라인에 대한, 시작하기 전에 다음 사항을 준비합니다. <ol><li> 키트 CPA의 2백40리터과 4 잘 요리 잘 하나 </li><li> 다음과 같이 15 정자 cryopreservation의 빨대 <ol><li> 주사기에 가장 가까운 면화 플러그 하나 ML 주사기로 0.25 ML 빨대를 연결합니다. 각 짚으로 다음 IVF 매체의 8cm (약 160 μl), 공기의 1cm를로드합니다. 보존하는 라인의 이름으로 빨대를 분류. </li></ol></li></ol></li><li> 아까 2 폼 상자에 깊이 15cm해야합니다. 뚜껑을 닫습니다. </li><li> cryopreserved 수 각 라인에서 2 수컷 쥐를 안락사. 마우스는 10 및 60 주 된 사이 여야합니다. 각 마우스의 중이야 deferens과 함께 두 개의 꼬리 epididymides를 제​​거합니다. </li><li> 이전에 준비한 4 잘 요리 (단계 1.1)의 잘 CPA 함유로 epididymides를 놓습니다. </li><li> 5-7 세로 각 epididymis의 상처와 부드럽게 만들기정자를 밀어 각 중이야의 deferens를 당겨요. </li><li> 3~5분에 대한 실온에서 부드럽게 손으로 CPA와 epididymis 혼합물을 흔들어. 이것은 정자가 수영을하실 수 있습니다. </li><li> 이전에 준비 빨대를 사용하여 정자 서스펜션의 5mm를 (약 10 μl) 대기음 그리고 공기의 1cm. </li><li> 15 빨대 총까지이 과정을 반복합니다. 로드와 최고의 정자 생존을위한 10 분 이내에 빨대를 밀봉. </li><li> 조심스럽게 빨대의 양쪽을 밀봉 가열. 먼저 정자 칼럼과 냉동 용기에 빨대를 놓습니다. </li><li> 손잡이를 연장 용기에 키트의 일부로 제공 제 1 ML의 피펫을 첨부합니다. 뚜껑에있는 구멍을 통해 거품 상자에 아까 2 용기를 놓으십시오. 10 분 후면 2 세로 부동에게 용기를 허용합니다. </li><li> LN2에 용기를 담가. 정자는 현재 cryopreserved되고 장기 에선이 스토리지로 이동하실 수 있습니다. </li><li> 용기는 사용하지 않아야다음 라인은 그 때까지 실내 온도 예열합니다. </li></ol> 2. 마우스 superovulation <ol><li> 일반적으로 정자 기증자와 같은 배경의 젊은 여성 생쥐를 사용합니다. </li><li> 마우스는 ~ 12g (세 3-4주)하여야한다. </li><li> 임신 암말 혈청 gonadotropin (PMSG)의 50-10 IU와 intraperitoneal 주사를 수행합니다. </li><li> 46-48시간 기다립니다. </li><li> 인간 chorionic gonadotropin (hCG)의 50-10 IU와 intraperitoneal 주사를 수행합니다. </li><li> 아래에 설명된대로 hCG 주사 후 수확 oocytes가 14-16 H. </li></ol> 3. 마우스 정자 복구 및 IVF <ol><li> IVF 전에 해동하는 각 빨대에 대해, 37 ° C CO 2 배양기에서 적어도 한 시간 동안 다음을 준비하고 평형. <ol><li> 정자의 배양 접시 하나 35mm 페트리 접시, 기름으로 덮여 정자 치료 매체 (STM)의 90 μl 드롭과 함께. </li><li> 접시를 절단 : oocyte 컬렉션 10 s의 최대의uperovulated 여성, IVF 매체 3 ML 하나의 35mm 페트리 접시. </li><li> IVF 잘 : IVF 5 superovulated 여성, IVF 미디어 500 μl (... 당신은 10 superovulated 암컷을 사용하는 경우, 예를 들어, 2 우물이 필요합니다)와 함께 4 잘 요리 잘 한 각 그룹에 대한 </li><li> 사용하는 4 잘 IVF 요리의 각 잘 세척을위한 칼륨 단순 3 ML 최적화된 미디어 (KSOM) 하나의 35mm 페트리 접시 : 접시를 세척 </li><li> 문화 요리 : IVF 요리의 각 우물에서 배아 문화의 기름으로 덮여 KSOM 매체 50 μl 방울 한 35mm 페트리 접시. </li></ol></li><li> 후면 2 밀짚 후 2-3 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에서 장소를 제거합니다. </li><li> 물 목욕에서 짚을 제거하고 여분의 물을 제거하는 닦아냅니다. 면화 플러그 가까운 최초의 공기 열에 가까운 첫 번째 절개를합니다. 여전히 정자 칼럼 전에 보이는 공기 칼럼있을 것입니다 IVF 미디어에서 짚을 잘라. </li><li> 다음의에서 빨대의 끝을 잘라econd 공기 열, 정자 열을 절단되지 않도록주의하고. 45 각도로 절단 - 이것은 정자를 대기음하는 것이 훨씬 쉽게됩니다. </li><li> 200 μl pipettor와 빨대의 말초 끝에서 정자 현탁액을 기음. </li><li> STM 드롭의 중심에있는 정자 현탁액을 놓고 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 45~60분을위한 요리를 품어. </li><li> 정자 보육 동안 절단 접시에 superovulated 여성의 oviducts을 해부하다. 적운 - oocyte의 단지 (COCs)를 발표, 각 수란관를 조각조각 30g 바늘이나 집게를 사용합니다. 더러운 미디어가 추가 세척 단계를 만들면서 IVF 미디어의 지방과 혈액을 피하십시오. </li><li> 일단 모든 oviducts가 찢어진되었습니다, 5 암컷에서 각 IVF 우물에 COCs을 전송. superovulation에 의해 만들어진 COCs의 수는 매우 의존 변형입니다. </li><li> STM 드롭의 주변에서 정자의 10-15 μl를 수집 한 IVF 거름을 잘 약 14-16시간은 hCG inj을 게시ection. 각 잘 사용에 대한 수정을 반복합니다. 최종 정자 농도는 약 1,000,000 / ML 것입니다. </li><li> 37 ° C 5% CO 2 배양기에서 4~6시간에 대한 Coculture의 정자와 oocytes. </li><li> 37 ° C 5% CO 2 배양기에서 개발 KSOM의 방울에 2 회 문화 KSOM 최소 배아를 씻으십시오. </li><li> IVF 속도는 밖으로 야간 문화 이후에 사용되는 총 oocytes의 두 세포 단계의 배아로 계산되었다. </li></ol> 4. 대표 결과 5 찰스 리버 마우스 근친 계통에서 정자가 냉동했습니다. 보호 비율은 신선한 정자 평가 가치에 의해 냉동 정자 평가 가치를 나누어 계산됩니다. 정자 운동성의 보호 비율은 각각 60.2 %, 81.3 %, 78.6 %, 66.5 %, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl 및 BALB / cAnNCrl에 대한 61.0 %, 있었다. 빠른 진보 운동성에 대한 보호 비율은 47.3 %, 69.4 %, 57.0 %, 52.8 %, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas에서 54.1 % 있었다<html> CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, 각각 BALB / cAnNCrl (그림 1). 냉동 - 해동 정자로 IVF 요금은 55.7 %, 26.4 %, 87.3 %, 87.8 % 각각 26.2 C57BL/6NCrl에서 % 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl 및 BALB / cAnNCrl, (그림 2)되었습니다 . 1.5 년 동안, 49 GM 마우스 라인 정자 cryopreservation에 의해 보관되었습니다. 이 라인은 나중에 성공적으로 네 여성의 종자에서 IVF (C57BL / 6, BALB / C, DBA / 1 129Sv) (그림 3)에서 (로 태어나 살고 새끼에 의해 정의된) 복구되었습니다. <img alt="그림 1." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" /> 그림 1. 마우스의 정자 운동성 및 신속한 프로 그레시브 운동성의 보호 비율 <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" /> 마우스에서 냉동 - 해동 정자와 함께 그림 2.에서는 시험 관내 수정 3713fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. GM의 마우스에서 냉동 - 해동 정자와 체외 수정을의

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

저자는 찰스 리버,이 키트의 제조 업체의 직원입니다.

1990 년 이후 18 %의 raffinose 3 % 탈지 우유를 사용하여 기본적인 정자 동결 프로토콜은 마우스의 여러 변종에 신뢰성이 입증되었으며 마우스 라인의 다수는 1,2,3,4,5,6,7를 cryopreserved되었습니다. 동결 융해 과정 동안 정자 세포 손상의 주요 원인은 얼음 형성 8,9 및 반응 산소 종의 10과 관련된되었습니다. 냉동 매체 등 monothioglycerol 등의 아미노산과 같은 자유 라디칼 청소부, 그리고 감소 에이전트, 함께 보완은 조사와 크게 C57BL / 6 11,6 포함하여 근친 계통에서 냉동 - 해동 정자로 IVF 속도를 증가 입증되었습니다. 현재 프로토콜에서, 우리는 상용 산화 억제제와 얼음 차단제와 함께 기본 CPA를 최적화하여하고 정자 동결 IVF 절차를 수정하여 마우스 정자 cryopreservation을위한 새로운 I • Cryo 키트를 개발했습니다. 정자 운동성의 보호 비율(&gt; 60 %) 및 ​​신속한 프로 그레시브 운동성은 (&gt; 45 %) I • Cryo 키트 냉동 오 근친 마우스 종자의 정자에 대한 보였다. 5 마우스 근친 계통에서 냉동 - 해동 정자와 함께 2 - 세포 배아 단계 개발 속도는 현저하게 기본 CPA 11,6과 그에 비해 향상되었다. 키트를 사용하여, 사용자는 각 라인 2 남성의 냉동 정자로 정자 집중 서스펜션을 만듭니다. 단 냉동 15 빨대으로 과정이 빠르고, 쉽고, 단기 또는 장기 저장을위한 더 적은 저장 공간을 차지합니다. 대부분의 시간은, 마우스 라인은 1 개 또는 2 개 빨대를 해동하여 복구할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>키트에 포함됨</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>키트에 포함됨</td></tr><tr><td>IVF 배지</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>키트에 포함됨</td></tr><tr><td>0.25 ml 플라스틱 스트로</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>키트에 포함됨</td></tr><tr><td>정자 냉동 캐니스터</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>키트에 포함됨</td></tr><tr><td>케인 및 고블릿</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>키트에 포함됨</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>배아 테스트 완료 제품이어야 함</td></tr><tr><td>KSOM 배지</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 페트리 접시</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>열 밀봉기</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>4-웰 멀티디쉬</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>피펫터</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 배양기</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 보관 시스템</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 항온수조</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>26G 3/8 바늘 포함 1cc 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>30 gauge &amp;frac12; 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

전 · cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 cryopreservation 및 복구

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

마우스의 새로운 유전자 변형 (GM) 종자의 수천 transgenesis와 녹아웃 기술의 출현 이후 개발되었습니다. 이러한 귀중한 동물의 대부분은 긴급의 경우에도 백업 계획, 살아있는 동물로만 존재합니다. 배아의 Cryopreservation이 백업을 제공하지만 비용이 많이 드는 수 긴 절차 수 있으며, 일반적으로 성공을 위해 동물의 많은 요구하실 수 있습니다. 마우스 정자가 성공적으로 18%의 raffinose 3 % 탈지 우유로 구성된 기본 cryoprotective 에이전트 (CPA)와 cryopreserved 수있다는 발견 이후, 정자 cryopreservation는 보관 배포 이러한 귀중한 종자의 복구를 위해 허용하고 비용 효율적인 절차되고있다 . 여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 타고난 생쥐 다섯 일반적으로 사용되는 종자의 정자는이 키트를 사용하여 동결 후 회복되었다. 정자 운동성 높은 보호 비율 (&gt;60 %)과 제어 (기본 CPA)에 비해 빠른 진보적인 운동성은 (&gt; 45 %) 5 근친 마우스 변종이 키트와 함께 냉동 정자에 대한 보였다. 복구 정자로 IVF 후 두 세포 단계의 배아 개발은 검사 모든 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 GM 마우스 라인은 I • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 IVF로 회복되었습니다.

여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 냉동 - 해동 정자와 두 개의 세포 단계의 배아 개발이 키트의 사용 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 유전자 변형 마우스 라인 전 • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 성공적으로 IVF로 회복되었습니다.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

형질전환 및 유전자 적중(knockout) 기술의 등장 이후 수천 종의 새로운 유전자 변형(GM) 마우스 계통이 제작되었습니다. 이러한 계통 중 상당수는...

본 절차의 전체적인 목표는 생쥐 정자를 냉동 보존하는 것입니다. 이는 먼저 냉동 보존용 스트로를 사용하여 생쥐의 부고환(EPIs)에서 정자를 수집함으로써 수행됩니다. 그 후 스트로를 액체 질소에 넣어 냉동시키며, 온수에 해동하여 회수할 때까지 보관합니다.회수된 마우스 정자는 최종적으로 체외 수정에 사용됩니다. 기존 방법과 비교하여 이 키트의 주요 장점은 마우스 정자를 동결 보존하고 회수하는 데 필요한 모든 필수 재료가 포함되어 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 스트로(straw)의 취급 및 로딩 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선 동결 보존할 마우스 라인당 15개의 정자 동결 보존용 스트로를 준비하는 것으로 시작하십시오.먼저, 각 0.25 milliliter 빨대를 1 milliliter 주사기에 연결하며, 이때 솜 마개가 주사기와 가장 가깝게 위치하도록 합니다. 둘째, 각 빨대에 IVF 배지 8 centimeters를 채운 후, 1 centimeter의 공기를 주입합니다. 셋째, 냉동 보존할 각 계통의 이름을 15개의 빨대 각각에 표시합니다.4-웰 디쉬의 웰 하나에 240 µL의 동결보호제를 채웁니다. 냉동 용기의 손잡이를 연장하기 위해 1 mL 피펫을 손잡이에 부착합니다. 마지막으로, 키트에 제공된 폼 단열 박스에 15 cm 높이까지 액체 질소를 채우고 뚜껑을 닫아 안락사시킵니다.가임기 성체 수컷 마우스 2마리를 준비합니다. 동결 보존 및 수술이 필요한 각 라인에 대해, 미미골 상피(EPI)를 제거합니다. 마우스를 배측으로 눕히고 복벽을 절개합니다.vast deference를 부드럽게 당겨 과도한 지방을 제거합니다. 다음으로 부고환을 찾아 소량의 fast deference와 함께 손상 없이 제거합니다. 해부 현미경 하에서 CPA가 채워진 준비된 4-웰 디쉬의 웰에 부고환(EPIs)을 넣습니다.각 부고환에 5~7개의 세로 절개를 넣습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 각 절개 부위를 부드럽게 짜줍니다. 정자가 배출되도록 CPA와 부고환 혼합물을 상온에서 3~5분 동안 배양합니다.배양 중에 접시를 손으로 2~3회 가볍게 흔들어 줍니다. 이렇게 하면 정자가 흡입을 통해 밖으로 헤엄쳐 나올 수 있습니다. 준비된 각 스트로에 정자 현탁액 5 mm를 넣은 다음, 1 cm의 공기층을 둡니다.냉동 과정에서는 모든 스트로에 동일한 양이 충전되는 것이 중요합니다. 15개의 스트로를 모두 충전한 후, 각 스트로의 양끝을 조심스럽게 열 밀봉하십시오. 정자의 생존율을 보장하기 위해 10분 이내에 15개 스트로 전체에 대한 공정을 완료하십시오.모든 스트로의 준비가 완료되면, 이를 정액 냉동용 캐니스터 컬럼에 장착하십시오. 먼저, 캐니스터를 폼 박스에 넣고 액체 질소 속에 수직으로 떠 있도록 합니다. 정자의 냉동 속도에 영향을 줄 수 있으므로, 캐니스터는 반드시 10분 동안 수직 상태로 떠 있어야 합니다.그 후 캐니스터를 액체 질소에 담급니다. 이렇게 정자는 동결 보존되어 액체 질소 내 장기 보관이 가능한 상태가 됩니다. 계획된 정자 회수 약 60시간 전에.IVF 전 암컷의 초배란을 위해 작성된 프로토콜을 따르십시오. 해동할 각 스트로에 대해 모든 배지를 준비하고 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 최소 1시간 동안 평형화하십시오. 이 재료에는 오일로 덮인 90 µL의 정자 처리 배지 방울이 담긴 35 mm 페트리 접시가 포함됩니다.절단용 접시로 사용할 3mL의 IVF 배지가 담긴 35mm 페트리 접시를 준비하고, 과배란 유도된 암컷 5마리당 500μL의 IVF 배지가 채워진 4웰 플레이트의 1개 웰을 IVF 접시로 준비합니다. 각 IVF 접시마다 3mL의 KSOM이 담긴 35mm 페트리 접시를 세척 접시로 준비하고, 오일로 덮인 50μL의 KSOM 배지 방울들이 담긴 35mm 페트리 접시를 배아 배양 접시로 준비합니다. 필요한 모든 재료가 준비되면 보관함에서 스트로를 빠르게 꺼내 37°C 항온수조에 2~3분 동안 둡니다.빨대의 물기를 말립니다. 그런 다음 솜 마개 아래의 공기 기둥 부분에 사선으로 컷팅합니다. 빨대의 반대쪽 끝에서도 다른 공기 기둥 위로 다시 한번 사선으로 컷팅합니다.정자 층이 끊어지지 않도록 주의하십시오. 이제 200 µL 파이펫을 사용하여 스트로 끝에서 정자 현탁액을 흡입한 후, 정자 처리 배지 방울의 중앙에 분주하십시오. 그 다음 디쉬를 45분에서 60분 동안 배양하십시오.정자 배양 동안, 과배란 유도된 암컷의 자궁관을 분리하여 절단 접시에 옮깁니다. 30게이지 바늘이나 핀셋을 사용하여 각 수란관을 찢어 난구세포-난자 복합체를 방출시킵니다. 다섯 마리의 암컷으로부터 얻은 COCs를 각각의 IVF 접시에 옮깁니다.최소량의 배지를 사용하십시오. 오염된 배지는 수정 효율을 저하시키므로 지방과 혈액이 전이되지 않도록 주의하십시오. 배양 후, STM 방울의 주변부에서 10 to 15 µL의 정자 현탁액을 채취하여 하나의 IVF에 주입하십시오.이제 수정이 이루어질 수 있도록 세포를 4~6시간 동안 공배양합니다. 수정 후, 세척 접시에서 배아를 최소 2K SOM으로 2회 이상 세척합니다. 그 후 배양합니다.원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배아를 KSOM에 둡니다. 다섯 가지 Charles River 근교계 마우스 계통의 정자를 동결했습니다. 해당 정자들의 정자 운동성 및 빠른 전진 운동성의 보호율은 다섯 가지 계통에 걸쳐 81%에서 47% 사이였습니다.동결 해동 정자를 이용한 IVF 성공률은 1년 반 동안 다양한 계통에서 26%에서 88%까지 다양하게 나타났습니다. 총 49종의 GM 마우스 라인이 정자 동결 보존을 통해 보관되었으며, 이후 4가지 서로 다른 암컷 계통에서 IVF를 통해 회복되었습니다. C 57 black six BC DBA one 및 1 29 SV 등이 이에 해당합니다. 정자 동결 보존 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차에서는 캐니스터로 수직으로 흐르게 하는 것과 액체 질소를 사용하는 것이 중요합니다.

mouse-sperm-cryopreservation-and-recovery-using-the-icryo-kit

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 - 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 cryopreserve하는 방법에 대한 단계별 데모를 제시한다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

이것은 zebrafish에 대한 높은 처리량 정자 cryopreservation 프로토콜입니다. 정자는이 프로토콜을 사용하면 이후의 체외 수정에 25 % 다산의 평균을 가지고 있으며, 수년 동안 안정 cryopreserved.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

비교 수종 접근 행동 neuroscientists가 특정 동물 모델의 특성으로 볼 구체적인 행동과 관련된 다양한 신경 생물학 요소를 탐험하실 수 있습니다. 자연 밀접하게 관련 종 사이의 행동의 차이를 발생의 활용이 기술은 침입 기법은 행동의 표현을 조작할 필요가 없습니다.

아버지의 응답의 신경 생물학을 맡은 이후로 비교 종의 접근법을 사용

이 비디오에서는 생물학적 시료를 보존하기 위한 초고속 극저온 유리화(cryo vitrification) 방법을 보여줍니다. 이 방법은 세포 내 얼음 결정 형성을 방지하여 생물학적 조직을 동결 손상으로부터 보호하기 위해 동결 보호제의 조합을 사용하는 것을 수반합니다.

유리화(Vitrification-based cryopreservation): 장기 보관을 위해 매우 낮은 온도에서 생물학적 시료를 보존하는 초고속 냉각 기술

MicroSecure Vitrification은 FDA 우수 제조 및 조직 취급 관행을 준수하는 비상업적인 무균 폐쇄 유리화 장치 시스템으로 개발되었습니다. 소수성 플러그 배아 빨대가 업계에서 철수함에 따라 유리화 절차는 표준 내부 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 수정되었습니다.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

이 연구의 주요 목적은 바늘에 맞게 vitrification (NIV) 절차 전체 zebrafish testes cryopreserve에 몰입 했다. 또한, 5 개의 다른 zebrafish 긴장에서 방법의 반복성 시험 되었다.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

이 프로토콜은 멸종 위기에 처한 산호 종의 정자 처리 및 냉동 보존의 효율성과 용량을 개선하기 위한 반자동 경로를 설명하여 유전적 다양성을 확보하고 산호초 복원 노력을 지원하는 것을 목표로 합니다.

바이오뱅킹 및 양식업을 지원하기 위한 산호 정자의 냉동 보존을 위한 반자동 워크플로우

학습하세요 마우스 정자 동결보존 및 복구 기술을 I•Cryo 키트를 사용하여 체외수정에 활용하는 방법을. 유전자 변형 마우스 계통 보존에 필수적인 생식생물학 기법입니다.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

더 많은 동영상 탐색