전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

본 절차의 전체적인 목표는 생쥐 정자를 냉동 보존하는 것입니다. 이는 먼저 냉동 보존용 스트로를 사용하여 생쥐의 부고환(EPIs)에서 정자를 수집함으로써 수행됩니다. 그 후 스트로를 액체 질소에 넣어 냉동시키며, 온수에 해동하여 회수할 때까지 보관합니다.

회수된 마우스 정자는 최종적으로 체외 수정에 사용됩니다. 기존 방법과 비교하여 이 키트의 주요 장점은 마우스 정자를 동결 보존하고 회수하는 데 필요한 모든 필수 재료가 포함되어 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 스트로(straw)의 취급 및 로딩 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선 동결 보존할 마우스 라인당 15개의 정자 동결 보존용 스트로를 준비하는 것으로 시작하십시오.

먼저, 각 0.25 milliliter 빨대를 1 milliliter 주사기에 연결하며, 이때 솜 마개가 주사기와 가장 가깝게 위치하도록 합니다. 둘째, 각 빨대에 IVF 배지 8 centimeters를 채운 후, 1 centimeter의 공기를 주입합니다. 셋째, 냉동 보존할 각 계통의 이름을 15개의 빨대 각각에 표시합니다.

4-웰 디쉬의 웰 하나에 240 µL의 동결보호제를 채웁니다. 냉동 용기의 손잡이를 연장하기 위해 1 mL 피펫을 손잡이에 부착합니다. 마지막으로, 키트에 제공된 폼 단열 박스에 15 cm 높이까지 액체 질소를 채우고 뚜껑을 닫아 안락사시킵니다.

가임기 성체 수컷 마우스 2마리를 준비합니다. 동결 보존 및 수술이 필요한 각 라인에 대해, 미미골 상피(EPI)를 제거합니다. 마우스를 배측으로 눕히고 복벽을 절개합니다.

vast deference를 부드럽게 당겨 과도한 지방을 제거합니다. 다음으로 부고환을 찾아 소량의 fast deference와 함께 손상 없이 제거합니다. 해부 현미경 하에서 CPA가 채워진 준비된 4-웰 디쉬의 웰에 부고환(EPIs)을 넣습니다.

각 부고환에 5~7개의 세로 절개를 넣습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 각 절개 부위를 부드럽게 짜줍니다. 정자가 배출되도록 CPA와 부고환 혼합물을 상온에서 3~5분 동안 배양합니다.

배양 중에 접시를 손으로 2~3회 가볍게 흔들어 줍니다. 이렇게 하면 정자가 흡입을 통해 밖으로 헤엄쳐 나올 수 있습니다. 준비된 각 스트로에 정자 현탁액 5 mm를 넣은 다음, 1 cm의 공기층을 둡니다.

냉동 과정에서는 모든 스트로에 동일한 양이 충전되는 것이 중요합니다. 15개의 스트로를 모두 충전한 후, 각 스트로의 양끝을 조심스럽게 열 밀봉하십시오. 정자의 생존율을 보장하기 위해 10분 이내에 15개 스트로 전체에 대한 공정을 완료하십시오.

모든 스트로의 준비가 완료되면, 이를 정액 냉동용 캐니스터 컬럼에 장착하십시오. 먼저, 캐니스터를 폼 박스에 넣고 액체 질소 속에 수직으로 떠 있도록 합니다. 정자의 냉동 속도에 영향을 줄 수 있으므로, 캐니스터는 반드시 10분 동안 수직 상태로 떠 있어야 합니다.

그 후 캐니스터를 액체 질소에 담급니다. 이렇게 정자는 동결 보존되어 액체 질소 내 장기 보관이 가능한 상태가 됩니다. 계획된 정자 회수 약 60시간 전에.

IVF 전 암컷의 초배란을 위해 작성된 프로토콜을 따르십시오. 해동할 각 스트로에 대해 모든 배지를 준비하고 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 최소 1시간 동안 평형화하십시오. 이 재료에는 오일로 덮인 90 µL의 정자 처리 배지 방울이 담긴 35 mm 페트리 접시가 포함됩니다.

절단용 접시로 사용할 3mL의 IVF 배지가 담긴 35mm 페트리 접시를 준비하고, 과배란 유도된 암컷 5마리당 500μL의 IVF 배지가 채워진 4웰 플레이트의 1개 웰을 IVF 접시로 준비합니다. 각 IVF 접시마다 3mL의 KSOM이 담긴 35mm 페트리 접시를 세척 접시로 준비하고, 오일로 덮인 50μL의 KSOM 배지 방울들이 담긴 35mm 페트리 접시를 배아 배양 접시로 준비합니다. 필요한 모든 재료가 준비되면 보관함에서 스트로를 빠르게 꺼내 37°C 항온수조에 2~3분 동안 둡니다.

빨대의 물기를 말립니다. 그런 다음 솜 마개 아래의 공기 기둥 부분에 사선으로 컷팅합니다. 빨대의 반대쪽 끝에서도 다른 공기 기둥 위로 다시 한번 사선으로 컷팅합니다.

정자 층이 끊어지지 않도록 주의하십시오. 이제 200 µL 파이펫을 사용하여 스트로 끝에서 정자 현탁액을 흡입한 후, 정자 처리 배지 방울의 중앙에 분주하십시오. 그 다음 디쉬를 45분에서 60분 동안 배양하십시오.

정자 배양 동안, 과배란 유도된 암컷의 자궁관을 분리하여 절단 접시에 옮깁니다. 30게이지 바늘이나 핀셋을 사용하여 각 수란관을 찢어 난구세포-난자 복합체를 방출시킵니다. 다섯 마리의 암컷으로부터 얻은 COCs를 각각의 IVF 접시에 옮깁니다.

최소량의 배지를 사용하십시오. 오염된 배지는 수정 효율을 저하시키므로 지방과 혈액이 전이되지 않도록 주의하십시오. 배양 후, STM 방울의 주변부에서 10 to 15 µL의 정자 현탁액을 채취하여 하나의 IVF에 주입하십시오.

이제 수정이 이루어질 수 있도록 세포를 4~6시간 동안 공배양합니다. 수정 후, 세척 접시에서 배아를 최소 2K SOM으로 2회 이상 세척합니다. 그 후 배양합니다.

원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배아를 KSOM에 둡니다. 다섯 가지 Charles River 근교계 마우스 계통의 정자를 동결했습니다. 해당 정자들의 정자 운동성 및 빠른 전진 운동성의 보호율은 다섯 가지 계통에 걸쳐 81%에서 47% 사이였습니다.

동결 해동 정자를 이용한 IVF 성공률은 1년 반 동안 다양한 계통에서 26%에서 88%까지 다양하게 나타났습니다. 총 49종의 GM 마우스 라인이 정자 동결 보존을 통해 보관되었으며, 이후 4가지 서로 다른 암컷 계통에서 IVF를 통해 회복되었습니다. C 57 black six BC DBA one 및 1 29 SV 등이 이에 해당합니다. 정자 동결 보존 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차에서는 캐니스터로 수직으로 흐르게 하는 것과 액체 질소를 사용하는 것이 중요합니다.