Name: 마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 배우세요 마우스 오금 림프절의 intravital 이미징 방법으로 면역세포의 실시간 이동과 상호작용을 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 면역학 연구에서 생체 내 세포 역학을 분석하는 데 필수적입니다.

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이 작품은 NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, 암 연구소, 세인트 Baldrick의 재단, 다나 재단, 가브리엘의 천사 재단과 미국의 현대 자동차 &quot;희망 - 온 - 휠&quot;프로그램에서 교부금에 의해 지원됩니다.

1. 마우스 홀더 어셈블리 <ol><li> 아래로 향하게 100 mm 플라스틱 배양 접시의 뚜껑 위에 100 mm 유리 페트리 접시의 뚜껑을 입혀라. 유리는 거의 플라스틱 접시의 중심점를 만지고해야합니다. 유리를 사용하면 스텐실로, 플라스틱 접시에 마크를 추적. </li><li> 초승달 모양의 플랫폼을 만드는 100 mm 플라스틱 접시 뚜껑의 일부를 제거하는 핸드 드릴 (예 : Dremel)를 사용합니다. 이 초승달 모양의 플라스틱 뚜껑은 마우스 (그림 1A)의 상반신에 대한 지원이 될 것입니다. 금속 트위스트 넥타이로 방독면을 확보하기 위해 초승달 모양의 뚜껑에 두개의 구멍을 드릴 다운합니다. 슈퍼 접착제 또는 equivalently 강한 접착제 (그림 1B)를 사용하여 유리 페트리 접시의 가장자리에 플라스틱 뚜껑을 고정합니다. </li><li> 접착제이 돔형 - 캡 PCR 튜브 (경첩에서 잘라내) 떨어져 오금 피부 펄럭를 고정의 목적을 위해 바닥 접시의 중앙에 1cm의 뚜껑. </li></ol> 2. 마우스 준비 <stroNG&gt; 참고 : 충분한 연습을 통해, 하나 20-30분에 마우스 준비와 수술 단계를 수행할 수 있어야합니다. <ol><li> (유도 2 ~ 2.5 %, 수술 / 이미지를위한 1.5-2 %) 1시 1분 O 2 isoflurane admixed와 마우스를 마취 : 1L/min의 유속에서 공기 혼합물은 IACUC 승인 절차를 사용합니다. 일단 마우스가 anesthetized이며, 테이프와 코 위에 방독면을 확보하라. 마우스 발가락 및 / 또는 꼬리 pinches에 대한 응답의 부족에 의해 완전히 anesthetized 있는지 확인합니다. isoflurane의 수준은 동물이 완전히 숨을 60-80 / 분 사이에 꾸준한 비 고심한 흔적 호흡 속도와 함께 안정을 취해되도록 적절하게 조정할 수 있습니다. </li><li> 뒷다리 다리와 마우스를 사타구니 지역에 머리카락을 제거하는 전동 트리머를 사용합니다. </li><li> 멀리 느슨한 머리를 빗질하고 부드럽게 면봉으로 면도 지역에 나이르 로션의 겸손한 코트를 적용합니다. 초기 애플 리케이션 1 분 후 나이르를 제거하고 습기가있는 노출된 피부를 깨끗하게종이 타월. 마우스가 깨끗하고 진행하기 전에 건조한지 확인하십시오. </li><li> 신근 힘줄 노출 오른쪽 무릎에 가위로 작은 2~3밀리미터의 절개를합니다. </li><li> 마우스 몸체와 다리가 위치됩니다 마우스 홀더의 중앙을 따라 Vetbond 적용합니다. 조심스럽게 오른쪽 오금 fossa을 폭로하기 위해, 아래 오른쪽 무릎으로 홀더에 마우스를 확보. 이미지 필드를 안정화하는 데 도움이 피부 플랩 보유자 사이에 Vetbond과 오른쪽 무릎 힘줄 고정합니다. </li><li> 스트레치 테이프 팔, 홀더의 위쪽 플랫폼에 왼쪽 다리. </li><li> 장소에서 방독면을 확보하기 위해 트위스트 넥타이를 사용합니다. </li><li> 해부 현미경 하에서 홀더를 놓습니다. 더구나, 물론 여전히 마우스 호흡 운동의 독립 남아 있어야합니다. 다리의 안정성을 최적화하기 위해 수술을 수행하는 동안 따라서 예방 조치들이 취해 있어야합니다. 최고에 기여할 꼬리 (일반적으로 머리 위)의 순위를 결정오른쪽 다리와 테이프 아래에서 꼬리까지 안정. </li></ol> 3. 외과 <ol><li> 절개 범위 아래에 있지만, 우주 히터 또는 가열 패드를 사용하여 마우스 체온을 유지하고 있습니다. 오금 에선 성공 이미징 들어, 지속적으로 노출된 조직에 따뜻한 PBS를 적용하여 조직의 수분을 유지하기 위해뿐만 아니라 수술에 걸쳐 적절한 체온을 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> Betadine으로 피부를 소독. 멸균 가위를 사용 중반 송아지 오른쪽의 피부를 통해서 중간선 절개를하고, 오른쪽 허벅지의 우수한 부분을 수직으로 절단까지 계속됩니다. </li><li> 양쪽에 피부 펄럭를 만드는 수직 절개 라인의 상단에 두명의 수평 피부 incisions을 만듭니다. </li><li> Vetbond로 모두 피부 아래 펄럭 철회 및 접착제. Vetbond를 적용하기 전에 긴장된 피부를 당기는 것은 더욱 다리의 안정성을 홍보할 수 있지만, (vesse 즉 변화 피부의 긴장은 혈액 흐름을 막다하지 않도록난 색상이나 직경). 그 종이를 노출하기 전에 다리의 안정성을 보장하기 위해 피부의 다른 영역에 다운 접착제로 진행합니다. 마우스의 크기는 여분의 피부가 접착제로 필요한 양을 결정합니다. 일반적으로 더 큰 생쥐보다 피부가 홀더에 붙어 수 있어야합니다. </li><li> 아까 오른쪽 중 오금 fossa 안에 존재하거나 오금 정맥 왼쪽, 홀더에 마우스의 위치에 따라해야합니다. 마이크로 해부 족집게와 집게를 사용하여 주위의 지방 조직 및 근육에서 종이를 조심스럽게 분리. 출혈과 충격을 최소화하기 위해 별도의 조직으로 핀셋을 마이크로는 해부와 splaying 기법을 사용합니다. 조심스럽게 수입 성의와 efferent 혈관과 수입 성의 림프 혈관의 무결성을 위태롭게하지 않고 오금 에선 노출. </li><li> 추가된 조직의 안정성 들어, 사각형 커버 유리가 혈관 폐색을 피하면서 살짝만 종이를 만지고, 젖은 종이 위에 배치됩니다. 커버 유리는 secur 수 있습니다마우스의 양쪽에 점토 모델링과 에드. </li><li> 다양한 크기 (예 : TRITC-dextran, 70kDa 최소)의 형광 선박 염료는 이미징 동안 종이의 구조적 관계와 무결성을 강조하기 위해이 시점에서 정맥 도입 수 있습니다. </li></ol> 4. 2 - 광자 이미징 취득 ** <ol><li> 에선가 적절하게 노출되고 안정성이 달성되면 즉시 37으로 유지 환경 현미경 챔버에서 프로그래밍 온도 피드백 제어 가열 패드를 들으며 현미경 스테이지 ° C.에 전체 마우스 홀더 어셈블리를 전송 추가 충분한 멸균 따뜻한 (37 ℃) PBS 또는 HBSS 잠수함 에선를합니다. 볼륨은 마우스의 크기와 위치에 따라 변경됩니다. 또는 따뜻한 PBS 또는 HBSS는 연동 펌프에 장착 미세 유리 피펫을 통해 해부 에선 직접 적용 침지 렌즈 목적의 열 테이프로 붙여져 수 있습니다. 액체의 흐름은되어야한다고안정적인 물 열은 렌즈와 조직 사이에 유지 수 있습니다. </li><li> 37 PBS 또는 HBSS 온도를 유지 ° C 피드백 프로브와 함께 가열 패드를 사용합니다. 별도의 온도 프로브는 37.5 ° C.에 36.5의 범위에 PBS의 온도를 확인하는 마우스 홀더에 배치되어야합니다 직장 프로브는 또한 이미징 세션에 걸쳐 실험용 마우스의 핵심 체온을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 목표하에 안내 하냐구요 배치를 돕기 위해 에피 형광 램프를 사용하십시오. 원하는 세포 상호 작용 (각 XYZ 이미지 스택 사이에 일반적으로 10 초로 1 분)에 적합한 시간 간격을 사용하여 형광 이미지 스택을 습득. </li><li> 육안 검사에 의한이나 동물의 모니터링 시스템을 사용하여 자주 현미경 챔버의 동물의 상태를 모니터링합니다. 마우스 발가락 및 / 또는 네일 pinches에 대한 응답의 부족에 의해 완전히 anesthetized 있는지 확인하고, 60-80 B 사이에 꾸준한 비 고심한 흔적 호흡 속도reaths / 분. isoflurane의 수준은 동물이 완전히 회복될되도록 적절하게 조정할 수 있습니다. 적절한 모니터링 및 수화를 통해 동물 4~6시간 동안 몇 군데, 또는 아마 더 이상 할 수 있습니다. </li><li> 이미징 실험 후 IACUC 승인 안락사 프로토콜을 사용하여 CO 2 챔버에서 동물을 안락사시켜야. 동물 전에 안락사에 마취 반발을 허용하지 말아야합니다. </li></ol> **이 수술 또한, 2P-LSM 이외 intravital 이미징 다른 형태 유용할 수 있습니다. 5. 대표 결과 각종 순환 면역 세포는 입양 전송에 따라 다른 속도로 종이를 모집하고 있습니다. CD4 + 및 CD8 내용 + lymphocytes,이 전지는 2~4시간 6,17-18 뒤 오금 종이에 도착 상당한 숫자 IV 전송 후 높은 내피 venule (HEV) 분도 종이에 도착하기 시작. B cel의 경우이거, 상당한 숫자 8~24시간 19 이후에 축적됩니다. 활성의 DC가이 노상 강도 주입 3,11,16-17 따라 배수 오금 에선 8-16시간에 나타나기 시작합니다. 그림 2A도 다른 랜드마크없이 같은 B 세포 모공과 같은 구조 2P-LSM 19 세 이하 보이는 둥근 구면 세포 축적에 의해 쉽게 분별 수 있도록 보여줍니다. 같은 ubiquitin-GFP의 splenocytes (그림 2, 보충 비디오 1 및 2)와 같은 내생 형광 리포터를 사용하면, 하나가 아닌 stimulatory physiologic 조건에서 일주일에 며칠 동안 이러한 림프구 마이 그 레이션과 행동을 추적할 수 있습니다. 다중 채널 고감도 탐지기로, 그것은 여러 세포 파트너 17,19 간의 구조적인 정보는 물론 상호 작용 역학을 포함 멀티 플렉스 이미징 데이터 세트를 취득하는 것이 가능합니다. 수술 기법이 제대로 실행 및 환경 조건은 주의깊게 모니터링하고 lymphocy오셨는 다른 13-14,16 그림 2C, 2D와에서 보여준 특징적인 마이 그 레이션 속도를, 전시한다. Lymphocytes 또한 에선 겪고 이미징의 하위 영역에 따라 마이 그 레이션 속도에 차이가 발생할 수 있습니다, 이러한 혈관 (같은 선박 염료의 도입에 의해 강조)만큼 추가적인 랜드마크는 전체적인 이미지 품질 (즉, 적절한 온도 제어를 결정하는 데 도움이됩니다 , 종이 등에 최소한의 외상) 3,6,20. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> 1 그림. 마우스 오금 에선 이미징을위한 마우스 홀더 건설) 마우스 홀더 어셈블리의 설계도,. b)는 대표 intravital 마우스 준비, C) 준공 마우스 홀더 조립, D) 수술 노출 후 오금 후면의 경관 업을 닫습니다. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> 그림 2. GFP + lymphocytes의 마이 그 레이션 분석오금 후면에. () 6 / C57BL받는 마우스에 오금 에선 2P-LSM 이미징 시퀀스에서 가져온 3D 스냅샷 adoptively 사전 이미징에 1x10 7 GFP + lymphocytes 일일 함께 양도. 대시 선의 B 세포 머리카락 경계를 나타냅니다, (b)는 지속적인 이미징 1 시간에 림프구 이주 트랙, 전반적인 림프구 마이 그 레이션 속도 C)은 유통. 속도를 평균 = 10.04 ± 4.26 μm의 / 분 (분석 15,125 트랙의 총), D)의 B 세포 대과에서 발견된 세포의 차동 세포 마이 그 레이션 속도 분포 (오픈 바, 총 1525 트랙 분석; 속도 = 8.79가 ± 3.90 μm의 / 분 뜻 ) 및 T 세포 영역 (닫힌 바, 의미 속도 = 13.77 ± 5.93 μm의 / 분, 분석한 1250 트랙의 총). 스케일 막대 = 50 μm의. 보충 비디오 1. 같은 그림 2에 설명된 마우스 오금 제품 에선 시간 경과 intravital 2P-LSM 이미징. 1x10 7 lymphocytes의 총 고립되었다 금톰 ubiquitin-GFP + 공여 마우스와 adoptively 24시간 이미징 전에 C57BL / 6 마​​우스로받는 자에게 양도. XY의 일련 (750 μm의 X 750 μm의) 형광 이미지는 매 20 초 동안 반복되었다 XYZ 이미징 스택 (750 μm의 X 750 μm의 X 65 μm의)를 양보하기 위해 고정 Z 스택 (5 μm의 단계, 13 단계)을 통해 찍은 속도 분석 (그림 2C, 2D)에 대한 xyzt 이미징 순서대로 발생 60분의 총입니다. 재생 속도 = 450x. 스케일 막대 = 50 μm의. 타임 스탬프 = 분 : 초. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">보완 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a> . 보충 비디오 2 B 세포 대과에서 보충 비디오 1 이미징 시퀀스보기 확대 기능 -. T 세포 영역 테두리. 재생 속도 = 450x. 스케일 막대 = 25 μm의. 타임 스탬프 = 분 :. 초 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>추가 비디오를 시청하려면 여기를 핥지.

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</ol>

저자가 공개하는 게 아무것도하지 않습니다.

특히 현장 이미징 기법, 2P-LSM에서 고해상도의 최근 발전은 생체내의 역동적인 세포 행동의 연구에 관심이 점점 동반되었습니다. 살아있는 생쥐의 오금 종이에 4D 이미징 기술 undisrupted 조직 마이크로 환경 내에서 면역 세포의 역동적인 동작과 같은 해석이 가능합니다. 전체 가시 스펙트럼에 걸쳐 여러 메이커와 2P-LSM의 사용은 여러 세포 인구의 동시 이미징 데이터 수집을 허용합니다. 이것은 지금 (유기 형광 세포 염료를 사용하여 differentially 표시된 세포 인구의 입양 전송의 사용과 결합된 생체내 세포 고유의 형광 리포터 생쥐 (예 : Ubiquitin-eGFP,-RFP, 또는 eCFP)에의 사용을 통해 달성될 수 예 CFSE , SNARF-1, 그리고 그 종이 안에 세포 메커니즘과 기능을 검토하는 셀 트래커 오렌지). differentially 추적 간의 상호 작용의 직접적인 관찰 이외에엘자의 인구는 멀티 플렉스 이미징 데이터 세트가 더 셀 행동과 기능을 명료하게하다하는 상용 영상 처리 소프트웨어 프로그램 (예 : Imaris, BitPlane 주식 회사)와 자세한 분석을 받다 수 있습니다. 가능성의 광범위한 배열은 생체내 및 silico 기술의 이러한 사용하여 세포의 상호 작용 메커니즘을 연구하기 위해 존재합니다. 여기에서 설명한 실험적 접근 방법의 주요 한계는 수술 접근법에 내재된 기술적 복잡합니다. 이 기술은 관련 해부학 및 정확한 기술적 절차 및이 프로토콜이 요구하는대로 능력을 잘 알고있는가되는 엄격한 훈련이 필요합니다. 더 복잡한 요인 에선 탐사 기간 동안 조직의 손상을 최소화의 어려움, 이미징 동안 조직의 안정성을 최적화하고, 전 후면에 열 및 레이저 부상 방지 및 이미징 실험 중에 포함됩니다. 이러한 요소 중 하나에 섭동가 낮은 최적의 림프가 발생합니다ocyte 운동성 및 따라서 영상 데이터 분석 결과의 적절한 해석을 방해합니다.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 시약</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isoflurane, USP</td&gt;<td&gt; 박스터 헬스케어 주식 회사</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 나이르 - 제모 로션</td&gt;<td&gt; 나이르</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS, 1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040 - 이력서</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 생리대</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 난방 패드 컨트롤러</td&gt;<td&gt; Watlow</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 에어와 O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgas</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 온도 프로브</td&gt;<td&gt; 하버드 장치</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 족집게 뒤몽 # 5</td&gt;<td&gt; 세계 정밀 계측기, INC</td&gt;<td&gt; 14,101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td7cm 굽은&gt; 포셉, Graefe 꽃창포,</td&gt;<td&gt; 세계 정밀 계측기, INC</td&gt;<td&gt; 14,141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 가위</td&gt;<td&gt; Roboz 외과 악기 (주) INC</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mm 유리 세포 배양 접시의&gt; 커버</td&gt;<td&gt; 코닝</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 밀리미터 폴리스티렌 세포 배양 접시의&gt; 커버</td&gt;<td&gt; 코닝</td&gt;<td&gt; 430,167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine 솔루션 (10 % Povidine - 요오드 연고제 솔루션)</td&gt;<td&gt; 퍼듀 제품, LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

마우스 오금 림프절의 intravital 이미징

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

림프절 (LNs)는 전략적으로 적응 면역 반응을 수상하기 위해 말초 조직에서 외국 항원의 트래핑 및 프레 젠 테이션을 할 수 있도록 신체 전반에 걸쳐있는 이차 림프​​ 기관입니다. 타고난 및 적응 면역 반응 사이 Juxtaposed, 아까 면역 세포 상호 작용에 1,2을 공부할 수있는 이상적인 사이트입니다. Lymphocytes은 (T 세포, B 세포와 NK 세포), 돌기 세포 (DC가) 및 macrophages는 뼈 후면의 세포 요소에게 골수 - 유래의 일괄 구성됩니다. 이러한 전지는 전략적으로 자기 항원 및 잠재 외국 항원 3-5의 효율적인 감시를 허용하도록 후면에 위치하고 있습니다. lymphocytes가 성공적으로 기원 항원가 발생하는 과정은 최근 몇 년 사이에 강렬한 수사 대상이며, 항원 수용체, 유착 분자, chemokines, 그러한 fibro-망상 네트워크 2,6-12 등 stromal 구조를 포함한 분자 연락처의 통합을 포함 . </p&gt; 이전에만 형태, 위치, 그리고 건축에 관한 해답을 제공하고 생체내 이미징, 정적인 이미지에 의존 조사단에서 고해상도 실시간 형광등의 발전합니다. 이 질문은 면역 세포의 행동에 대한 우리의 이해에 근본적인 반면,이 기술을 고유 제한 해독 림프구 밀매 및 동적 셀 행동에 영향을 미치는 환경 단서에 분석을 허용하지 않습니다. 최근 intravital의 발전은 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2P-LSM)는 수사관들이 현장 12-16에서 라이브 LNs 내에 역동적인 움직임 및 개별 세포의 상호 작용을 볼 수있었습니다. 특히, 우리와 다른 다양한 조직 하부 구조 11,17-18와의 소형 고밀도 자연 대규모 조직 영역을 통해 멀티 플렉스 데이터 수집의 장점을 제공 오금 에선, 내 이미지 세포 행동과 상호 작용이 기법을 적용 . 그것은 내가의 중요한이 기술 혈액 장애, 림프의 흐름, 그리고 시스템의 궁극적 세포 역학을 필요로 explanted 조직 이미징 기술, 이상의 추가적인 장점을 제공합니다하십시오. 또한 explanted 조직은 조직이 explant 후 이미징을위한 실용적 남아있는 시간은 매우 적어 있습니다. 동물의 환경 조건의 적절한 보습 및 모니터링을 통해 이미징 시간이 대폭이 intravital 기법으로 확장할 수 있습니다. 여기서는 intravital 이미징을 수행할 목적으로 마우스 오금의 종이를 준비에 대한 자세한 방법을 제시.

2 - 광자 현미경의 최근 발전은 실시간으로 활성화했습니다<em&gt;에서</em&gt; 원위치 동물 모델에서 라이브 조직의 이미징,이를 physiologic 및 pathologic 두 조건에서 세포의 행동을 조사하는 능력을 향상. 여기서는 마우스 오금 림프절의 intravital 이미징을 수행하는 데 필요한 준비를 설명합니다.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

림프절(LN)은 이차 림프기관으로, 신체 전반에 전략적으로 배치되어 외부 물질을 포착하고 제시할 수 있도록 합니다...

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내 이미징을 위해 팝리트 림프절(popliteal lymph node)을 노출시키고 안정화하는 것입니다. 이는 먼저 마우스용 홀더를 제작하여 절차 진행 중 다리를 고정할 수 있게 함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마취된 마우스를 홀더 위에 적절하게 배치하는 것입니다.세 번째 단계는 주변 혈관이나 림프절에 손상을 주지 않으면서 슬와 림프절을 조심스럽게 노출시키는 것입니다. 마지막 단계는 노출된 슬와 림프절에 대해 생체 내 영상을 촬영하는 것입니다. 궁극적으로, 생체 내 현미경을 통해 림프절 내 면역 세포의 실시간 이동과 상호작용을 관찰하고 분석할 수 있습니다.이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 수술 단계가 익히기 어렵고, 림프절을 손상시키지 않으면서 적절하게 고정하는 것이 결정적이기 때문입니다. 절차 시연은 Rachel Liu이 진행하겠습니다.실험실 기술자가 100 millimeter 유리 페트리 접시의 덮개를 똑바로 세워, 거꾸로 뒤집어 놓은 100 millimeter 플라스틱 페트리 접시 뚜껑 위에 올려놓습니다. 이때 유리가 플라스틱 접시의 중심점에 살짝 닿게 합니다. 유리를 스텐실로 사용하여 플라스틱 접시 위에 초승달 모양의 선을 그립니다. 다음으로, 핸드 드릴을 사용하여 100 millimeter 플라스틱 접시 뚜껑을 초승달 모양의 플랫폼으로 절단합니다.플랫폼에 구멍 두 개를 뚫은 다음, 강력 접착제를 사용하여 플라스틱 뚜껑을 유리 페트리 접시 가장자리에 고정합니다. 마지막으로, 돔형 PCR 캡 두 개를 튜브의 힌지 부분에서 잘라내어 바닥 접시 중앙에 1 cm 간격으로 붙입니다. 마우스가 마취되면, 테이프로 가스 마스크를 동물의 코 위에 고정합니다.동물이 완전히 진정될 수 있도록 isof fluorine 수치를 적절히 조절하십시오. 다음으로, 전기 트리머를 사용하여 생쥐의 오른쪽 뒷다리와 서혜부 영역의 털을 제거합니다. 떨어진 털을 털어낸 후, 면봉을 사용하여 제모 크림을 면도한 부위에 얇게 도포하십시오.초기 도포 후 1분이 지나면, 디토리 크림(detory cream)을 제거하고 노출된 피부를 젖은 종이 타월로 닦아냅니다. 생쥐의 피부가 마르면, 가위로 오른쪽 무릎 부위에 2~3 mm의 작은 절개를 가해 신근건을 노출시킵니다. 이제 생쥐 홀더의 중앙을 따라 벳본드(vet bond)를 도포하고, 생쥐의 몸체와 다리를 조심스럽게 배치합니다.마우스의 오른쪽 오금(popliteal fossa) 부위가 노출되도록 오른쪽 무릎을 아래로 향하게 하여 홀더에 고정합니다. 그다음, 영상 촬영 영역을 안정화하기 위해 두 피부 플랩 홀더 사이에 vebo를 사용하여 오른쪽 무릎 힘줄을 고정합니다. 이어서 마우스의 양팔과 왼쪽 다리를 펴서 홀더의 상단 플랫폼에 테이프로 고정합니다.두 개의 금속 트위스트 타이를 구멍에 통과시켜 가스 마스크를 뚜껑에 고정합니다. 마지막으로, 홀더를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 꼬리를 오른쪽 다리가 가장 안정적으로 고정될 수 있는 위치(일반적으로 여기에서 보여주는 것과 같이 머리 위쪽)에 배치합니다.그런 다음 꼬리를 테이프로 고정합니다. 해부 현미경으로 관찰하는 동안 공간 히터를 사용하여 마우스의 체온을 유지하십시오. 멸균 가위로 Betadine을 사용하여 피부를 소독함으로써 절차를 시작합니다.오른쪽 종아리 중간 피부에 정중선 절개를 가하고 오른쪽 허벅지 상단까지 수직으로 절개를 계속합니다. 그런 다음 수직 절개선 상단에 두 개의 수평 피부 절개를 만들어 양측에 피부 플랩을 생성합니다. 노출된 조직에 따뜻한 PBS를 지속적으로 도포하여 조직의 습기를 유지하십시오.피부를 팽팽하게 잡아당긴 다음, 다리의 안정성을 더욱 높이기 위해 펄럭이는 피부 조각들에 vet bond를 도포합니다. 림프절을 노출시키기 전, 다리의 안정성을 높이기 위해 피부의 다른 부위들도 계속해서 접착제로 고정합니다. 주변 조직을 손상시키지 않고 림프절을 노출시키는 것이 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다.주변 혈관과 림프관이 손상되지 않도록 주의하며 지방 조직과 근육을 분리할 때 각별히 유의하십시오. 가장 좋은 방법은 분리 시 한 번에 두 가닥 정도의 근육 다발을 들어 올려 림프절로부터 멀어지게 하는 것입니다. 이제 미세 해부용 핀셋과 포셉을 사용하여, 유입 혈관, 유출 혈관 및 유입 림프관의 온전함이 훼손되지 않도록 주의하면서 주변 지방 조직과 근육을 조심스럽게 벌려 팝리탈(popal) 림프절을 노출시킵니다.림프절이 충분히 노출되고 고정이 완료되면, 림프절을 잠기게 할 만큼 충분한 양의 멸균 37 °C PBS가 들어있는 환경 현미경 챔버가 포함된 이광자 이미징 현미경 스테이지로 마우스 홀더 어셈블리 전체를 신속히 이동시킵니다. 피드백 프로브가 달린 가열 패드를 사용하여 PBS 온도를 37 °C로 유지하십시오. 마우스 홀더에 별도의 온도 프로브를 배치하여 PBS 온도가 36.5에서 37.5 °C 범위 내로 유지되는지 확인하십시오.실험 동물의 심부 체온을 모니터링하기 위해 직장 프로브를 사용할 수도 있습니다. 에피 형광 램프를 사용하여 대물렌즈 아래에 림프절이 적절히 배치되도록 안내하십시오. 그런 다음 원하는 세포 상호작용에 적합한 시간 간격으로 형광 이미지 스택을 획득하십시오.동작.현미경 챔버 내 동물의 상태를 시각적 검사를 통해 빈번하게 모니터링하십시오. 이 3D 스냅샷은 이미징 하루 전 1x10⁷개의 GFP 양성 림프구를 입양 전이시킨 마우스의 팝리테알 림프절을 이광자 레이저 주사 현미경(two photon laser scanning microscopy)으로 촬영한 이미징 시퀀스에서 얻은 것입니다. 다른 표식이 없더라도 확인이 가능합니다.점선으로 표시된 B세포 여포와 같은 구조는 둥근 구형 세포를 통해 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 그림에서는 1시간의 연속적인 이미징 동안 림프구 이동 경로의 축적 결과가 나타나 있습니다. 이를 통해 세포 이동 패턴을 추적할 수 있으며, 속도, 방향성, 세포 간 상호작용과 같은 세포 행동에 대한 복합적인 분석이 가능합니다.이동하는 림프구의 난형(OID) 형태에 주목하십시오. 여기서는 총 15,125개의 트랙을 분석하여, 림프절 샘플 내에서 추적된 입양 전이 림프구 이동의 전체적인 이동 속도 분포를 나타냈습니다. 평균 속도는 6~14 µm/min 사이인 것으로 확인되었습니다.이 그래프는 빈 데이터 막대로 표시된 B 세포 여포 내 세포와 채워진 데이터 막대로 표시된 T 세포 구역 내 세포의 세포 이동 속도 분포 차이를 보여줍니다. 평균적으로 B 세포 여포에서의 세포 이동 빈도가 T 세포 구역에서 추적된 세포 이동 빈도보다 높았습니다. 비록 마우스 팝리탈 림프절의 타임랩스 생체 내 이광자 레이저 주사 현미경 영상에서 T 세포 구역의 세포들이 더 높은 평균 속도로 이동하였으나, 영상에서 보는 바와 같이 유비퀴틴 GFP 양성 공여 마우스로부터 총 1 × 10⁷개의 림프구를 분리하여 영상 촬영 24시간 전에 수용 마우스에 정맥 내로 입양 전이하였습니다.이 기술을 통해 림프절 내 림프구의 행동을 동적으로 시각화할 수 있습니다. 여기서는 이전 영상에서 확인한 B세포 여포와 T세포 구역 경계 부위의 이미징 시퀀스 확대 뷰를 보여줍니다. 면밀한 분석을 통해 림프절의 서로 다른 미세환경에서 나타나는 세포 행동의 차이를 구분할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 슬개 림프절(popliteal lymph node) 이미징에 적합한 마우스 고정대를 제작하는 방법, 슬개 림프절을 외과적으로 노출시키는 방법, 그리고 C2에서 면역 세포의 거동을 관찰하기 위한 생체 내 현미경 검사(intra vital microscopy) 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

두 광자 영상은 기저 조건에서 림프절 이내에 면역 반응 한 중 림프구 세포 운동성 및 상호 작용을 밝혀있다. 여기, 우리는 T 세포, 림프절의 고립, 그리고 CD4의 영상 운동성 + explanted 림프절의 T 세포의 입양 전송을 보여줍니다.

해부와 마우스에서 주변 림프절의 2 광자 이미징

사타구니 림프절 (LN)의 intravital 현미경을 수행하기위한 기법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 실시간으로...

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

이 비디오는 쥐의 뒷다리에서 슬와골 배출 림프절을 채취하는 해부 기술을 보여줍니다. 림프절은 선천성 면역과 적응 면역을 연결하는 데 중요한 역할을 하며, 보존된 조직 구조와 세포 생존력을 가진 온전한 림프절을 채취하면 국소 및 전신 면역 반응을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

생체 외 이미징을 위해 쥐 슬와골 배출 림프절을 채취하는 해부 방법

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

마취된 마우스에서 생체 내 컨포칼 현미경을 사용하여 정상 상태 및 염증 상태에서 장간막 정맥의 호중구 및 단핵구의 거동을 모니터링하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

흡혈류 혈관의 외과 봉합에 의한 림프 흐름을 차단하는 프로토콜이 제시된다.

마우스에서 흡개 성 림프혈관을 봉합하여 림프 흐름 차단

이 프로토콜은 인도시아닌 그린(ICG) 근적외선 영상과 초음파를 결합하여 골절 후 림프관 배출을 평가하여 쥐에서 족저 ICG 클리어와 슬와림프절 확대를 정량화합니다.

골절 후 ICG 근적외선 영상 및 초음파를 이용한 림프 배출 평가

배우세요 마우스 오금 림프절의 intravital 이미징 방법으로 면역세포의 실시간 이동과 상호작용을 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 면역학 연구에서 생체 내 세포 역학을 분석하는 데 필수적입니다.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

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