Name: 커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 학습하세요 커널 바이오어세이를 이용한 곰팡이 콜로니, 포자형성 및 진균독소 생산 정량화 방법입니다. 고성능 액체크로마토그래피를 활용하여 종자-곰팡이 상호작용을 연구하고 실험실 간 표준화된 결과를 얻을 수 있습니다.

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우리는 그들의 기술 지원을 위해 브랜든 Hassett과 카를로스 오르 티즈 감사드립니다. 이 작품은 박사 마이클 Kolomiets에 NSF 교부금 IOB-0544428, IOS-0951272, 그리고 IOS-0925561에 의해 지원, 그리고 식량 농업 USDA의 국립 연구소 (NIFA), AFRI 공장 사육 및 교육 그랜트 # 2010-85117하여 -20539 Drs 있습니다. 세스 머레이, 토마스 Isakeit, 그리고 마이클 Kolomiets.

1. 옥수수 커널 Bioassay <ol><li> 두 주 전에, 문화 28의 감자 덱스 트로 오스 한천 배지 (PDA)에서 곰팡이 병원균 ° C. </li><li> 그들이 bioassay의 튜브의 바닥과 수준, 50 ML 팔콘 튜브의 위치를​​ 누워 있도록 선호 평평 비슷한 크기와 모양으로 커널을 선택합니다. 선택된 커널은 유사한 종자 연령 및 신진 대사 조성을 위해 동일한 환경에서 동시에 생산된 것이어야합니다. </li><li> 6 % 나트륨 차아 염소 산염과 70 % 에탄올, 멸균 물 1 분, 10 분 : 5 분 동안 실온에서 튜브를 흔들어하여 커널을 소독 표면 이군. 계속 떨고 동안 멸균 물을 때마다 5 분, 세 번 씻어. autoclaved 수건에 건조한 팻 커널. </li><li> Aspergillus flavus의 감염을 촉진하기 위해서, 0.5 cm의 깊이에 18 G 바늘로 배아 사이드에 작은 상처를 만듭니다. 그러나 우리의 경험에 큰 상처가 Fusarium의 verticillioides 감염 필요합니다. 일erefore, 0.5 mm의 깊이에서 배아 사이드로 잘라 면도날을 사용합니다. </li><li> 포자를 해방하고 autoclaved 일종의 투박한 무명의 최소 4 레이어를 통해 필터링 중력에 균사체를 제거하는 autoclaved 0.01 % 십대 초반-20 솔루션의 약 5 ML에 교양 번호판을 위해서 힘든하여 inoculum 서스펜션을 준비합니다. hemocytometer로 포자 농도를 계산하고 10 6 포자 / A 용 ML 조정 flavus 또는 F. verticillioides. 다른 종의 병원균이나 호스트를 사용하는 경우, 적절한 감염 inoculum의 농도를 평가하는 것이 중요합니다. </li><li> 종이 타올 다섯 시트 및 멸균 물 100 ML 줄지어 플라스틱 컨테이너 (29.2 cm X 18.7 cm X 8.3 ㎝)의 습도 챔버를 만듭니다. 상공 회의소가 아닌 물 또는 공기 꽉 및 추가 물은 종이 타올은 습기가 유지하는 실험을하는 동안 추가되어야합니다. </li><li> 장소 네 autoclaved 20 ML 유리 섬광 유리병에 커널과 그 질량을 기록합니다. 200 μl 포자 현탁액과 예방모자 및 정지로 고르게 코트 커널에 소용돌이. 자유롭게 습도 챔버로 공기 교환 및 장소를 허용하도록 뚜껑을 풀어. </li></ol> 주 : 씨앗 또는 이러한 방법에서 설명한 이외의 진균류의 경우 inoculum 필수의 금액이 다를 수 있으며 실험적으로 도출되어야한다. <ol start="8"><li> ° C에서 7 일간이나 28이나 원하는까지 12-h-light/12-h-dark photoperiod 미만의 커널을 품어. </li></ol> 2. Conidia의 열거 <ol><li> 감염 기간 후 1 분 철저하게 감염된 커널과 소용돌이를 포함하는 섬광 튜브에 autoclaved 0.01 % 십대 초반-20의 5 ML에 추가합니다. </li><li> 넓은 구멍 피펫 팁 사용하면, 즉시 0.01 % 십대 초반-20 (또는 감염에 따라 필요에 따라 희석)의 1.8 ML을 포함하는 2.0 ML Eppendorf 튜브에 포자 현탁액의 두 개의 서로 다른 200 μl aliquots를 전송하여 희석. </li><li> hemocytometer 4 회 각 200 μl 나누어지는을 열거그리고 트리 트먼트 사이 conidia의 수준을 비교합니다. </li></ol> 3. 아플라톡신의 부량 <ol><li> 80 % 메탄올 및 0.05 g NaCl, 1 분 고속으로 표지 및 조화 20 ML : 1 개 시료 50 ML 믹서 컵에 커널을 추가합니다. </li><li> 깨끗한 수거 용기를 통해 홈 붙이 필터 용지를 삽입하고 필터로 추출을 붓는다. </li><li> 깨끗한 그릇에 여과액 10 ML 전송 20 ML 증류수 H 2 O를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 깨끗한 컵에 1.5 μm의 유리 microfibre 필터를 통해 필터 샘플. </li><li> Afla 테스트 열에 필터링된 추출물의 1 ML을 적용하고, 압축 공기를 사용하는 비운까지 1-2 드랍스 / 초의 속도로 칼럼을 통해 여과 추출물을 강제. </li><li> 증류수 H 2 O 1 ML에 두 번 칼럼을 씻어 놓기 / 초 공기를 넘지 때까지 1-2에서 컬럼을 통과. </li><li> 드롭 / 유리 cuvette에 수집된 초 속도 1-2에서 1ml 100 % HPLC 급 메탄올과 Elute 칼럼. </li><li> 추가한 eluate로 Afla 시험 개발자의 ML과 잘 섞는다. 장소 보정 fluorometer로 cuvette 60 초에서 읽어보세요. </li></ol> 참고 : Aflatest FGIS 프로토콜을 사용하는 경우 fluorometer의 측정 100 ML에서 추출한 시료의 초기 50g를 기반으로 계산됩니다. 네가 물과 시료의 희석을 고려하면 한 ML이 샘플의 0.166 g을 나타냅니다 칼럼에 적용. 그래서 프로토콜을 수정할 때, 당신은 계정으로 표본의 크기의 차이와 초기 추출 솔루션을해야합니다. 예를 들어, 커널 2g 20 ML 80 % 메탄올로 추출됩니다. 이것은 0.1 g / ML입니다. 이 샘플 1 ML은 2 ML 워터와 혼합되면 액체의 시료의 비중은 이제 0.033 g / ML입니다. 이 샘플은 100 ppb의 fluorometer 읽기를 제공하는 경우 실제 농도는 ppb = (0.166 g X 100 ppb) / 0.1 g), 또는 166 ppb는 0.166으로 시료의 비중에 따라 달라집니다. 대안 아플라톡신 quantifi위한양이온 방법, 참고 7 참조하십시오. 4. Fumonisin B1 (FB1) 분석 <ol><li> 곰팡이가 옥수수 커널에서 재배되면 교반하지 않고 상온에서 acetonitrile / 물 (50분의 50, V / V)의 10 ML과 하룻밤 샘플을 추출합니다. 그 후, 탈이온수 (6 ML)으로 추출 (2 ML)를 섞어, 그리고 C-18 고체 상 추출에 직접 (8 ML)이 믹스를 적용합니다. </li><li> 샘플을 로딩하기 전에 전제 조건 물 2 ML 다음 acetonitrile 2 ML과 rinsing에 의한 C-18 고체 상 추출 칼럼. </li><li> 샘플을 로딩 후 열은 acetonitrile / 물 (85분의 15, V / V) 2 ML 뒤에 물을 2 ML로 씻어 있습니다. HPLC 분석 (FB1를 포함)에 대한 샘플은 acetonitrile / 물 (30분의 70, V / V) 2 ML로 eluted있다. </li><li> 0.1 ML borate 완충액 (0.05 M 붕소의 acid/0.05 M 나트륨 borate는 [50분의 50, V / V], 산도 8.5)과 0.1가 담긴 병을로 열 eluate의 0.1 ML를 전송하여 O-phthaldehyde (오파)으로 FB1를 Derivati​​ze ML 오파 (aceton에서 0.1 밀리그램 / ML메르 캅 토 에탄올) - 0.5 %로 itrile. </li><li> acetonitrile/0.01 M 붕산 (60분의 40, V / V) 0.5 ML을 추가하여 10 분 후에 반응을 중지합니다. </li><li> 분석 Zorbax ODS 컬럼 (4.6 150mm)과 가변 파장 Shimatzu RF-10Axl 형광 검출기 (여기 335 nm의 / 방출 440 nm의)이 장착된 HPLC Shimadzu LC-20AT 시스템에 FB1를 분석합니다. </li><li> 선형 그라데이션을 사용 (용매 : acetonitrile/0.1 M의 인산 나트륨 (60분의 40), 산도 3.3, 용매 B : acetonitrile / 0.1 M의 인산 나트륨 (40분의 60), 산도 3.3)되어 다음과 같이하고 기울기 프로그램입니다 : 100 % 5 분, 10 분, 100 % B의 100 % B에. </li><li> HPLC에 의해 FB1 기준을 분석하고, 피크 면적 측정은 표준 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 그 후, FB1 표준 곡선과 피크 영역을 비교하여 시료의 FB1 수준을 계량. </li></ol> 5. Ergosterol 분석 <ol><li> 7~14일을위한 옥수수 커널의 문화 균류. </li><li> 필로폰 : 잠복기 후, 클로로포름 10 ML 추가각 유리병에 anol (2시 1분, V / V). 추가한 후에는 잘 샘플을 흔들 후 24 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 튜브를 품어. </li><li> 24 시간 후 샘플을 원심 분리기, 그리고 표면에 뜨는를 수집하고 0.45 음 나일론 막 통해 필터링합니다. </li><li> 직접 4.6 U ODS-C18 컬럼 (200, 250 ± 4.6 ㎜)와 Shimadzu SPD-20A의 UV / 282 NM에서 모니터링하도록 설정 VIS 검출기를 갖춘 HPLC Shimadzu LC-20AT 시스템으로 샘플을 주사. </li><li> 1.5 ML / 모바일 위상과 같은 분 유량에 메탄올 (100 %)를 사용합니다. HPLC 등급 ergosterol에서 생성된 표준 곡선에 샘플 피크 영역을 비교하여 샘플에 ergosterol의 부량를 결정합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 2~3일위한 습도 챔버에 접종 및 배양 후, 곰팡이 성장은 커널에 표시하기 시작합니다. 이레 게시물 치료, 치료 식물에 대한 식물의 성장은 whil 명확하게 표시합니다온라인 모의 컨트롤 (그림 1B, 상단) 감염되지 않은 있어야합니다. 더 이상 부화 기간이 더 풍부한 식물 성장 (그림 1B, 아래)에 도움이됩니다. 조건에서 본 설명 (그림 2G), A. flavus 야생 형 NRRL 각각 8, 6, 8 일간의 식민지, 아플라톡신 축적 및 conidia 생산의 3,357 표시된 최대 값 (그림 2, AC). 그러나 진균 독소 오염과 conidiation은 ergosterol의 단위당 비교했을 때, 가장 큰 수준 (그림 2, DE) 각각 4, 6 일간에서 관찰되었다. 그림 층이 곰팡이 바이오 매스에 의존 최대 가치 관찰을 요약한 것입니다. 흥미롭게도 4-6일 포스트 접종 사이 커널은 같은 시간 코스 (그림 2 시간, 아래)에 대한 시료로부터 총 RNA에 의해 볼 핵산 저하를 받고있다. 우리 자신을 포함하여 몇몇 연구, 조사할을 가지고에드 F. verticilliodies는 옥수수 커널 2,8,9,10,11,12에 감염 성공적으로 시간을 관찰을위한 포인트로 7-13일 사용됩니다. 방법을 사용하면 본 설명한 3,500-8,000 NG / G 커널 4,13 및 ergosterol 수준 범위에서 fumonisin 레벨 범위 fumonisin (상단) 및 ergosterol (하단위한 5,000-10,000에서 NG / G 커널 14,13. 그림 3은 쇼를 대표하는 봉우리 ) HPLC chromatograms에서. ergosterol의 측정도 흡광 스펙트럼 15를 통해 진행하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> 그림 1. 곰팡이 바이오 매스, sporogenesis 및 진균 독소 생산과 커널 bioassays에서 식물 성장을위한 대표적인 결과의 부량을위한 플로우 차트. 옥수수 커널에 곰팡이 pathogenesis을 평가하는 데 사용되는 기본적인 생물 학적 매개 변수의 부량위한 설명한 방법을 요약) 플로우 차트. B) 대표커널 bioassays에 대한 검색 결과. 탑, A. flavus (NRRL3357) B73 유전자를 배경으로 옥수수 커널에서 식물 성장. 씨앗 10 6 포자 / ML 및 사진 200 μl 7 일 게시물 접종 찍은 사진으로 주사되었다. 아래에, F. verticillioides는 B73 배경 13일 포스트 감염에 커널을 주사. 커널은 10 6 포자 / ML 200 μl으로 주사되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> 그림 2. Aspergillus flavus의 커널 bioassay 시간 코스. B73 커널은 10 6 포자 / ML Aspergillus flavus conidial 정지 200 μl로 주사하고 2~8일 (G)에 incubated했다. (; 평균 ± SE N = 3-4) 모든 값은는 4 커널의 건조 중량 평균으로 결정됩니다. ) 콜로니 (ergosterol을 기준으로), (B) 아플라톡신, 그리고 (C) conidiation은 위에서 설명한 방법을 사용하여 계량했다. E) 아플라톡신 및 (F) conidiation이 표시됩니다H ergosterol를 통해 측정으로 곰팡이 바이오 매스의 함수로. F) ergosterol, 아플라톡신 축적, 그리고 곰팡이 바이오 매스의 함수로 conidiation위한 최대 값 - 각 수량에 대한 최대 값을 100 %로 설정되었다 관찰했다. 시간 코스의 총 RNA의 차선 당 (H) 1 μg. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> 그림 3. fumonisin B1 (위)과 Fusarium의 verticillioides (M3125)에 감염된 커널과 분리돼 ergosterol (아래)를위한 대표적인 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC) chromatograms.

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<li>Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li>
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</ol>

<p class="jove_content"&gt; 저는 공개할 게 없다.</p

<p class="jove_content"&gt; 여기에 설명된 방식은 광범위하게 테스트 및 곰팡이 식민지, sporogenesis 및 mycotoxins의 생산을위한 같지는 결과의 세대에 견고한 것으로 입증되었습니다. 또한, 이러한 방법은 mycotoxigenic 진균류 (예 : 땅콩, 밀, 면화, 피스타치오 등)과 오염에 민감한 다른 식물 종 씨앗에 적용할 수 있어야합니다. 유능한 식물 - 병원균 상호 작용 분석을 위해, 씨앗은 생명을 유지하는 것이 필수적입니다. 씨앗의 생존을 유지하면서 커널의 배아 측면에 작은 상처 사이트 감염을 용이하게합니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 효과적으로 실행 커널 assays이 분야에서 병렬 결과에 표시되었습니다. 이전 연구에서<sup&gt; 4</sup&gt; 커널 bioassays가 보여준<em&gt; lox3-4 돌연변이</em&gt; 라인은 야생 형 식물보다 아플라톡신 오염에 더 취약했다. 이 결과 네 개의 독립적인 현장 실험에서 본 결과와 직접 라인에<sup&gt; 4</sup&gt;. 이것은...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> # 카탈로그 </td></tr><tr><td> 감자 덱스 트로 오스 한천 배지 </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> 십대 초반-20 </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> 플라스틱 배양 용기 </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> 혼합하는 것 </td><td> Vicam </td><td> 20,200 </td></tr><tr><td> 24cm 세로 홈을 판 여과지 </td><td> Vicam </td><td> 31,240 </td></tr><tr><td> 1.5 μm의 유리 microfibre </td><td> Vicam </td><td> 31,955 </td></tr><tr><td> Afla 테스트 칼럼 </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla 테스트 개발자 </td><td> Vicam </td><td> 32,010 </td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> Vicam </td><td> 35,016 </td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 고체 상 추출 칼럼 (준비 9월 SPE C18 열) </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-phthalaldehyde (오파) </td><td> 시그마 화학 공동 </td><td> 79,760~5g </td></tr><tr><td> 붕산 </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> 나트륨 borate </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> 메르 캅 토 에탄올 </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (펌프) </td><td> Shimadzu 과학 인 스트 루먼트 주식 회사 </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS 칼럼 (4.6x150mm) </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl 형광 검출기 </td><td> Shimadzu 과학 인 스트 루먼트 주식 회사 </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> 인산 나트륨 </td><td> 피셔 Scientifc </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 기준 </td><td> 시그마 화학 (주) </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 0.45 음 나일론 막 (HPLC)와 13mm의 주사기 필터 </td><td> 막 생활 과학 </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> 섬광 튜브 </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

커널 bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, sporogenesis 및 mycotoxins 생산의 부량

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

에 의해 입자의 썩어가는 씨앗 - 감염 곰팡이는 인간과 동물 건강에 심각한 위험을 언급하지 않기로, 시리얼 생산 세계적으로 가장 큰 경제적 어려움 중 하나가 포즈. 시리얼 생산 중에서 옥수수는 곡물 무결성 및 진균 독소의 종자 오염의 병원체 유발 손실로 인해 거의 틀림없이 가장 영향을받는 작물이다. 옥수수 재배자 및 식품 및 사료 프로세서를위한 두 가지 가장 널리 사용하고 문제가 mycotoxins는 각각 Aspergillus flavus와 Fusarium의 verticillioides 제작한 아플라톡신과 fumonisin, 수 있습니다. 분자 식물 - 병원균 상호 작용의 최근 연구에 곰팡이 감염 및 진균 독소 오염 1,2,3,4,5,6으로 식물 반응과 관련된 구체적인 메커니즘을 이해 약속을 증명하고있다. 많은 실험실이 식물 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 커널 assays를 사용하고 있기 때문에, 서로 다른 생물 학적 매개 변수를 quantifying위한 표준화된 방법에 필요하므로,이다른 실험실에서 결과를 비교 해석될 수 있습니다. 씨앗에 대한 정량 분석​​을위한 강력하고 재현할 수단을 위해서는 곰팡이 성장, 바이오 매스 및 진균 독소 오염을 수치 인 - 실험실 커널 assays와 후속 방법을 개발했습니다. 네 소독 옥수수 커널은 곰팡이 서스펜션 (10 6)와 함께 유리 튜브 안에 주사하고 미리 정해진 기간 동안 incubated됩니다. 샘플 튜브 그러면 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC), AflaTest fluorometer 방법을 사용하여 아플라톡신의 부량, 그리고 HPLC에 의한 fumonisin의 부량하여 hemocytometer, ergosterol 기반의 바이오 매스 분석하여 conidia의 열거를 위해 선택됩니다.

종자 - 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

종자 감염 곰팡이로 인한 곡물 부패는 전 세계 곡물 생산에 있어 가장 큰 경제적 난제 중 하나이며, 심각한 위험은 말할 것도 없습니다...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 분자 수준의 종자-곰팡이 상호작용을 연구하기 위해 마이코톡신(mycotoxin) 생합성, 부패 및 성장을 정확하게 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 커널 생물검정법(kernel bioassay)을 설정합니다. 그 다음 kedia의 수를 측정하고, 이어서 마이코톡신을 정량화합니다.마지막으로, 진균 생물량을 측정합니다. 궁극적으로, 포자 계수법과 고성능 액체 크로마토그래피를 결합하여 균사체 생물량과 2차 대사산물을 정량화함으로써, 종자 생리가 마이코톡신 생성 진균의 번식 발달 및 2차 대사에 미치는 영향에 대한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술을 보급하는 주요 목적은 여러 연구소 간의 방법을 표준화하여 서로 다른 실험실의 결과물을 상호 해석할 수 있도록 하는 것입니다.이 방법은 병원성 진균이 독성 전략으로서 식물의 지질 대사를 가로채는 방식과 같이, 종자-미생물 분자 상호작용 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 생소한 연구자는 angi의 균주마다 성장 및 발달 패턴이 다르기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 따라서 미로 실험을 수행하기 2주 전에 사용하고자 하는 진균-종자 상호작용 조건을 최적화하는 것이 필수적입니다.종자 바이오어세이 배양. 감자-덱스트로스-한천(PDA) 배지에서 28 °C로 진균 병원균을 배양합니다. 실험 준비가 되면 연령, 모양 및 크기가 유사한 종자를 선택하여 50 mL 튜브에 넣습니다. 표면.70% ethanol을 넣고 실온에서 5분 동안 튜브를 흔들어 종자를 멸균합니다. 다음으로, 멸균수로 1분 동안, 그리고 6% sodium hypochlorite로 10분 동안 흔들어 줍니다. 멸균수를 이용하여 각각 5분씩 3회 흔들어 씻어냅니다.그 다음, 멸균 타월로 알갱이의 물기를 닦아내어 aspergillus flavus를 감염시킵니다. 18 gauge 바늘을 사용하여 각 알갱이의 배아 쪽에 0.5 centimeters 깊이의 작은 상처를 냅니다. fusarium vertices 감염의 경우, 면도날을 사용하여 0.5 millimeter 깊이로 절개합니다.배양된 플레이트에 멸균된 0.1% tween 20 용액 5 mL를 첨가하여 접종액 현탁액을 준비하고, 셀 스프레더를 사용하여 포자를 긁어냅니다. 멸균된 거즈를 최소 4겹으로 겹쳐 용액을 여과하여 중력으로 균사를 제거합니다. 혈구계수기(hemo cytometer)를 사용하여 포자 농도를 계산하고, mL당 6개의 포자가 되도록 조정합니다.두 진균 종 모두에 대해, 플라스틱 용기에 페이퍼 타월 다섯 장을 깔고 멸균수 100 milliliters를 추가하여 습도 챔버를 만듭니다. 그다음, 각 오토클레이브에 커널 4개를 넣습니다.20 mL 유리 설치 바이알을 준비합니다. 각 바이알의 무게를 측정하여 기록합니다. 각 바이알 캡에 200 µL의 포자 현탁액을 넣고, 커널이 현탁액으로 고르게 코팅되도록 볼텍싱합니다.그런 다음 캡을 느슨하게 풀어 공기가 자유롭게 교환되도록 하고 바이알을 습도 챔버에 넣습니다. 28 °C에서 12시간 광기 및 12시간 암기로 구성된 광주기 조건으로 7일 동안 또는 원하는 상태가 될 때까지 종자를 배양합니다. 감염 기간이 끝난 후, 감염된 종자가 들어 있는 시뮬레이션 바이알에 0.01% Tween 20 오토클레이브 용액 5 mL를 첨가하고 1분 동안 충분히 볼텍싱합니다. 넓은 입구의 VRE 피펫 팁을 사용하여, 1.8 mL의 0.01% Tween 20이 들어 있는 2 mL 에펜도르프 튜브 두 개에 각각 200 µL씩 두 번 분주하여 포자 현탁액을 즉시 희석합니다.헤모사이토미터를 사용하여 각 분주액을 두 번씩 측정하십시오. 아플라톡신을 정량하기 위해, 단일 시료의 커널을 80% methanol 20 mL와 염화나트륨 0.05 g과 함께 50 mL 블렌더 컵에 넣으십시오. 뚜껑을 덮고 고속으로 1분 동안 혼합하십시오.깨끗한 수집 용기 위에 적신 거름종이를 놓고 추출물을 거름종이에 붓습니다. 여과액 10 milliliters를 깨끗한 용기로 옮깁니다. 증류수 20 milliliters를 첨가하고 잘 섞습니다.샘플을 1.5 micron 유리 미세섬유 필터로 걸러 깨끗한 컵에 담습니다. 필터링된 추출물 1 mL를 ALE 테스트 컬럼에 도포하고, 압축 공기를 사용하여 1초당 1~2방울의 속도로 추출물을 컬럼에 통과시킵니다. 공기가 나올 때까지 1초당 1~2방울의 속도로 증류수 1 mL를 컬럼에 통과시켜 컬럼을 두 번 세척합니다.초당 1~2방울의 속도로 100% HPLC 등급 메탄올 1mL를 사용하여 컬럼을 용리하고, 이를 Glass Q Vet에 수집합니다. EIT에 ale 테스트 현상액 1mL를 첨가하고 잘 섞습니다. Q VET를 보정된 형광 광도계에 넣고 60초 후에 측정합니다. acin B one 또는 FB one 분석의 경우, 각 커널 생물분석 시료에 아세토나이트라이트-물 50:50 혼합액 10mL를 첨가하고, 교반 없이 실온에서 하룻밤 동안 추출합니다.추출물을 6 mL의 탈이온수와 혼합하고, 2 mL의 아세토니트릴과 2 mL의 물로 사전 처리된 C 18 고상 추출 컬럼에 적용합니다. 시료를 로딩한 후, 컬럼을 2 mL의 물과 이어서 2 mL의 아세토니트릴 수용액으로 세척합니다. HPLC 분석용 시료가 포함된 FB 1 분획을 2 mL의 아세토니트릴 수용액으로 용출합니다.컬럼 EIT 1 mL를 붕산염 완충액 0.1 mL와 알데하이드 0.1 mL가 들어 있는 바이알로 옮겨 FB one을 유도체화하고 10분 동안 배양하십시오. 0.5 mL의 아세토니트릴 및 0.01 M 붕산 용액을 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 아세토니트릴과 0.1 M 인산나트륨의 선형 기울기를 이용한 HPLC로 FB one을 분석하십시오.옥수수 위의 진균을 7~14일 동안 배양한 후, sterol 배양물을 분석하기 위해 시료를 FB one 표준 곡선과 비교하십시오. 배양 기간이 끝난 후, 각 바이알에 10 milliliters의 chloroform methanol을 첨가하십시오. 시료를 충분히 흔들어 섞은 다음, 바이알을 실온의 암소에서 24시간 동안 배양하십시오.샘플을 5,000 RPM에서 3분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 0.45 micron 나일론 막으로 여과합니다. 샘플을 HPLC 컬럼에 직접 주입하고 1.5 milliliters per minute의 유속으로 100% methanol을 사용하여 용출합니다.HPLC 등급 또는 gold 표준물을 사용하여 작성된 표준 곡선과 피크 면적을 비교하여 시료를 정량합니다. 접종 후 습도 챔버에서 2~3일 동안 배양합니다. 그러면 여기에서 보는 바와 같이 커널(종실)에 진균 성장이 나타나기 시작해야 합니다.접종된 커널의 처리 후 70년대 식생 성장은 명확하게 보여야 하며, 모의 대조군은 감염되지 않아야 합니다. 배양 기간이 길어질수록 더 풍성한 식생 성장이 촉진됩니다. 이 그림은 flavus 야생형 NR RL 3 3 5 7이 각각 4일, 6일, 8일째에 군락 형성, 아플라톡신 축적 및 kedia 생성의 최대값을 나타냈음을 보여줍니다. 그러나 롤 단위당 마이코톡신 오염 및 tion을 비교했을 때, 각각 4일과 6일째에 가장 높은 수준이 관찰되었습니다.여기에 이 비디오에서 설명한 방법을 사용한 HPLC 크로마토그램의 퓨모니신(fumonisin)과 rol 대표 예시가 나와 있습니다. 퓨모니신 수치는 커널 1g당 3,500에서 8,000 nanograms 범위이며, rol 수치는 커널 1g당 5,000에서 10,000 nanograms 범위입니다. 커널 바이오어세이가 완료되면, 실험 시료의 수에 따라 2~4일 이내에 곰팡이 독소와 곰팡이 바이오매스를 모두 측정할 수 있습니다.본 절차를 수행할 때는 가능한 한 멸균된 환경에서 방법을 진행하는 것이 중요하다. 이 절차 외에도 phyto-harmonics, lipidomics, proteomics, transcriptomics 또는 기타 inter-atomics와 같은 다른 방법들을 통해, 이러한 중요한 왕국 간 상호작용에 어떤 유전자, 단백질 및 호르몬 경로가 관여하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

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학습하세요 커널 바이오어세이를 이용한 곰팡이 콜로니, 포자형성 및 진균독소 생산 정량화 방법입니다. 고성능 액체크로마토그래피를 활용하여 종자-곰팡이 상호작용을 연구하고 실험실 간 표준화된 결과를 얻을 수 있습니다.

커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량

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