마우스 기관에서 자연적으로 흐르는 것과 셀 및 Submucosal 글 랜드 덕트 세포의 분리

본 방법의 목적은 연구, 수복 및 재생을 위해 생쥐의 기관지 점막하선 도관에서 줄기세포를 분리하는 것입니다. 먼저, 안락사시킨 생쥐로부터 기관을 적출합니다. 이후 기관을 세척하고 절단하여 소화시킵니다.

그 후 상피세포를 기계적으로 박리하고 추가로 소화시켜 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 그다음 세포를 염색하여 분류한 뒤, 최종적으로 in vivo 및 in vitro 분석에 사용하기 위해 처리합니다. 궁극적으로 이 방법은 기도 상피 줄기세포의 자기 재생 및 분화를 조절하는 주요 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술들은 인 비트로(in vitro) 및 엑스 비보(ex vivo) 기도 상피 수복 및 재생 모델을 제공하므로 매우 중요합니다. 이를 통해 정상적인 기도 수복뿐만 아니라 만성 폐쇄성 폐질환, 낭성 섬유증, 천식과 같은 기도 질환을 연구할 수 있습니다. 당초 이 방법은 기저 세포와 관 줄기세포를 분리할 수 있는 특정 표면 마커를 찾지 못했을 때 고안되었으며, 이에 따라 기저 세포가 포함된 표면 상피를 제거하고 관 세포만 남기기로 결정했습니다. 기관 해부 절차를 시연합니다.

기도 상피 박리, 단일 세포 현탁액 제조 및 FACS 소팅 과정이 진행될 것입니다. 저희 실험실의 박사후 연구원이 in vitro 및 ex vivo 모델에서 소팅된 세포를 처리하는 절차를 시연할 것이며, 저희 실험실 매니저가 함께 합니다. 안락사시킨 마우스의 복벽을 절개하여 이 절차를 시작하십시오.

장관을 옆으로 밀어 복부 대동맥이 드러나게 한 후 이를 박리합니다. 횡격막과 흉벽 내측을 양쪽으로 절개하여 흉강을 열고 심장과 폐를 노출시킵니다. 계속해서 목 부분까지 절개하고, 미세 가위를 사용하여 지방과 타액선을 제거함으로써 기관을 노출시킵니다.

흉선을 제거하고 폐 하단과 뒤쪽에 있는 결합 조직으로부터 폐를 분리합니다. 그다음 기관과 식도 사이에 핀셋을 삽입하여 두 조직을 분리합니다. 후두와 연결된 부위 위쪽의 기관 최상단을 절단합니다.

다음으로, 핀셋으로 기관을 잡고 부착 부위에서 분리합니다. 심장 및 폐와 함께 제거하기 위해 아래로 계속 진행하며, 좌우 주기관지의 대부분을 포함하도록 폐문 근처에서 심장과 폐를 절단합니다. 기관을 해부 현미경 아래에서 얼음 위에 놓인 수집 배지가 담긴 작은 페트리 접시에 넣습니다.

매우 정밀한 5번 핀셋, 포셉, 정맥 튜브 및 가위를 사용하여 기관에 부착된 모든 조직을 제거합니다. 여기에는 림프절, 반회후두신경 지방, 갑상선 및 잔여 폐혈관이 포함됩니다. 기관의 상단부는 특히 주의를 기울여, 윤상연골(CRICO cartilage)과 첫 번째 기관 연골 고리 C1 사이에 위치한 가장 큰 점막하선 덩어리를 손상시키지 않으면서 후두 연골의 큰 조각들을 제거해야 합니다.

다음으로, C4와 C5 사이에서 기관을 상부와 하부로 절단합니다. 기관의 내강을 통해 두 부분을 모두 엽니다. 효소 소화 및 단일 세포 현탁액 제작을 위해 기관 하부는 1 mL 마이크로 원심분리 튜브에, 기관 상부는 15 mL 원추형 튜브에 옮깁니다.

절차의 다음 단계에서는 기관의 하단과 상단 부위를 처리하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 이 과정들은 동시에 처리되어야 하지만, 여기서는 두 가지 방법을 순차적으로 시연하겠습니다. 기관의 하단 부위를 처리하려면, 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 1 mL의 16 unit dis space에 이를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 기관을 0.5 mg/mL DNAse I이 포함된 DMM이 든 새 튜브로 옮겨 실온에서 20분 더 반응시킵니다. 소화 후에는 미세 핀셋을 사용하여 조직을 신선한 수집 배지가 들어 있는 멸균 페트리 접시로 옮깁니다. 그 다음 해부 현미경 하에서 상피층을 가볍게 잡아당겨 아래의 기저막에서 분리함으로써 표면 상피를 벗겨냅니다. 이어서 피펫을 사용하여 벗겨낸 상피가 포함된 배지를 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 4°C에서 1000 G로 원심분리합니다.

원심분리 후, SNAT를 제거하고 0.1% trypsin EDTA를 첨가한 뒤, 37 °C의 진탕 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 1000 µL 팁 피펫을 사용하여 반복적으로 파이펫팅함으로써 세포 덩어리를 분해하고 세포가 단일 세포 현탁액을 형성하도록 합니다. 상부 기관을 1 mL의 0.15% Pronase가 들어 있는 원추형 튜브에 넣고 4 °C에서 4시간 동안 배양합니다. 기관의 하부 영역은 16 units의 disc base가 포함된 배지 1 mL가 들어 있는 1 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.

배양 후, 튜브를 가볍게 볼텍싱하고 기관을 새로운 수집 배지에 넣습니다. 해부 현미경 하에서 표면 상피가 완전히 박리되었는지 확인합니다. 미세 가위를 사용하여 기관을 잘게 다지고 점막하선 구획을 엽니다.

실온에서 0.15% pronase를 넣고 천천히 흔들어주며 1시간 더 배양합니다. pronase를 제거한 후 기관 조직을 원심 분리합니다. 0.1% trypsin EDTA를 추가하고 37°C에서 30분 동안 흔들어주며 배양합니다.

다음으로, 70 micron 스트레이너로 큰 덩어리들을 걸러냅니다. 그 후 배지를 사용하여 스트레이너를 세척합니다. 소화된 세포 덩어리와 남아있는 선 조직 조각들을 10 milliliter 주사기를 이용해 20 gauge, 23 gauge 및 26 gauge 바늘로 통과시킵니다.

바늘 크기를 줄이기 전에 각 크기별로 패키징 과정을 여러 번 반복합니다. 이제 대부분의 세포가 단일 세포 현탁액 상태가 되어야 합니다. 현탁액을 40 micron 스트레이너로 여과한 후, 스트레이너를 배지로 세척하고 세포를 원심 분리합니다.

그런 다음 적절한 부피의 배지로 세포를 재현탁하고, 세포 수를 센 후 즉시 FACS 염색 및 소팅을 진행합니다. 비염색 및 단일 염색 보정 튜브를 준비하기에 충분한 양의 세포를 취합니다. 그런 다음 나머지 세포를 trop tube 및 I TGA six에 대한 1차 항체로 상온에서 15분 동안 염색합니다. 배양 후 PBS 또는 수집 배지로 세척하고, 상층액을 매우 조심스럽게 제거합니다.

적절한 2차 항체로 세포 펠릿을 염색합니다. 실온의 암소에서 10분 동안 배양합니다. 그 후 세척하여 염색약을 제거하고 펠릿을 분산시킵니다.

이제 형광 활성 세포 분별법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 세포를 분별할 수 있습니다. 세포 분별이 완료되면, 이를 이용해 복구 및 재생 기전을 조사하여 인비트로(in vitro) 구체 형성 배양물을 생성할 수 있습니다. 성장 인자가 감소된 Matrigel 100 µL를 최대 50,000개의 분별된 세포가 포함된 완전 배지 100 µL와 혼합하십시오.

이 혼합물을 24-웰 트랜스웰 플레이트의 상단 챔버에 피펫으로 분주하고, 하단 챔버에는 400 µL의 완전 배지를 분주한 후 37 °C에서 배양하십시오. 하단 챔버의 배지는 격일로 교체하고, 매주 또는 Matrigel 층이 얇아졌을 때 100 µL의 Matrigel을 추가로 첨가하십시오.

구체(Sphere)는 일반적으로 7일 후에 형성되며, 수주 동안 배양하거나 연속적으로 계대 배양할 수 있습니다. 체내(in vivo) 모델의 경우, 정제된 세포 펠릿을 Matrigel과 1:1로 혼합한 완전 배지에 50 µL당 5,000에서 10,000개의 세포 농도로 재현탁합니다. 수용체 C 57 black six 마우스를 마취시킨 후, 등의 윗부분을 포함하여 등 부위를 멸균하고 제모합니다.

중앙에 세로로 피부 절개를 실시합니다. 가위 날의 뭉툭한 면을 사용하여 피부와 흉벽 후면 사이의 양측 포켓을 넓힙니다. 마우스의 사지를 위쪽과 뒤쪽으로 밀어 올려 견갑골의 내측 경계를 이동시키고 확인합니다.

그 다음 300 µL 인슐린 주사기를 사용하여, 견갑골의 내측이자 척추의 외측에 위치한 지방 패드에 세포 현탁액 50 µL를 주입합니다. 팽진(bleb)이 형성되어야 하며, 반대편에도 동일하게 주입한 후 3주 뒤에 피부 절개 부위를 클립으로 고정하거나 봉합합니다. 안락사시킨 마우스의 피부를 이전과 같이 절개하고, 양측의 지방 패드 전체를 안전 여유분을 두어 적출합니다.

주변으로 형성되어 확장되었을 수 있는 조직 구조를 누락하지 않도록 하기 위해, 적출한 지방 패드를 PFA로 고정하고 파라핀에 매립하여 블록 절편 제작 시 구조물이 누락되거나 간과되는 것을 방지하십시오. 40 µm 두께로 한 번 트리밍한 다음, 4 µm 두께의 슬라이스를 절단하십시오.

이를 유리 슬라이드 위에 놓고 현미경으로 관찰하여 상피 구조가 존재하는지 확인합니다. 아무것도 보이지 않는다면, 한 번 더 다듬은 후 이 단계를 반복합니다. 본 영상에서 설명한 방식대로 생쥐 기관을 박리하면, 여기 denuded tracheas에서 보는 바와 같이 광학 현미경으로 확인할 수 있는 박리된 기관이 됩니다.

dyspasted 처리 30분 후, 왼쪽에는 소화 과정과 박리된 기관이 나타납니다. 오른쪽에는 pronase 소화 4시간 후의 모습이 나타납니다. 상피 박리 후, 점막하선이 조직에서 분리되어 포도 송이와 같은 형태로 나타납니다.

표면 상피 세포의 제거는 검은색 화살표로 표시되어 있습니다. 점막하선 및 도관 내 세포의 제거는 녹색 화살표로 표시되어 있습니다. 단일 세포 현탁액의 유세포 분석 결과는 여기에서 보여지는 것과 같이 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 플롯으로 나타나야 합니다.

도관 세포가 나머지 세포들과 잘 분리되었습니다. 형광 활성 세포 분류를 위한 유세포 분석에서 Trop two 항체로 기관 세포를 확인해야 한다면, 배양 후 약 1주일이 지났을 때 매트리젤(matri gel) 내에서 구체(sphere)가 관찰되어야 하며, 기저 세포 유래일 경우 관강 형태를 띠고 도관 세포 유래일 경우 얇은 외형을 나타냅니다. 이 과정의 효율은 1~2% 수준이며, 매트리젤 내에 여전히 단일 세포들이 존재할 수 있는데, 이는 자기 재생 능력이 없는 점막하선 도관 유래 세포일 가능성이 높습니다.

기저구(Basal spheres)는 크기가 더 크고 루멘(luminal) 형태의 외관을 보입니다. 생쥐의 지방 패드(fat pad)에 관 줄기세포를 주입하면 구형이며 중앙에 루멘을 가진 점막하선(submucosal gland)과 유사한 구조가 형성됩니다. 이러한 구조는 h and e 염색을 하지 않은 블록에서도 관찰됩니다.

이러한 상피 구조를 포함하는 절편을 얻기 위해서는 지방 패드(fat pad)를 통해 많은 횡단면 절편을 제작해야 합니다. 이 영상을 시청한 후에는 유선관 세포로부터 줄기세포 집단을 분리하는 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 숙련되면 이 기술은 10시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 구체 형성(sphere formation) 및 재생 촉진 성장 인자와 관련된 여러 가지 다양한 질문에 답하기 위해 배양 조건을 변경할 수 있습니다.